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문제 정의
- 본 연구는 생물공학적 기술을 이용하여 대량 생산된 잎새버섯 균사체 배양액으로부터 분리된 세포 외 다당체인 GF-glucan을 이용하여 자외선을 조사한 사람 섬유아세 포에서 MMP-1 발현저해 효과를 검색하고 이를 항노화 소재로 응용하고자 하였다.
- 본 연구에서는 잎새버섯(G frondosa HB0071)균주에서 생산되는 세포 외 다당체(GF-glucan)가 사람 섬유아세포에 서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 사람 섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1 의 발현저해 효과는 0.
제안 방법
- GF-glucan은 5% 이하의 농도에서 90% 이상의 세포 생존 율을 나타내어 이 농도 이하의 농도로 사용할 경우, 매우 안전한 것으로 확인되었다(Figure 3). GF-glucan을 5% 이하의 농도로 처리 시 섬유아세포의 생존에 영향이 없는 것으로 확인되어 이후 실험에서는 5% 이하의 농도로 실험을 진행하였다.
- MTT [3-(4, 5-dimethythiazo2-gl)-2-5-diphenytetrazo- lium bromide] 정량은 Mosmann [19] 의 방법을 변형하여 실시 하였다. 사람 섬 유아세포를 2 X 105 cells/mL 농도로 96-well plate의 well에 GF-glucan을 세포에 처리하여 CO2 배양기에서 24 h 배양하였다.
- 5 min, 72℃ 1 min, 28 cycles로 반응시켰다. PCR에 의하 여 생성된 산물을 1.5% agarose g인에서 전기영동하여 MMPT과 8- actin 유전자의 발현을 image analyzer (BIS303PC, DNR Imaging Systems Ltd, UK)로 확인하였으며 각 band의 density는 densitometric program (NIH Image software, Maryland, USA)을 이용하였다. MMPT의 oligonucleotide 서열은 sense oligonucleotide^]- 5'-AAAGGGAATAAGT ACTGGGC-3; antisense oligonucleotide/} 5-AATTCC AGGAAAGTCATGTG-3’ 이며, 0 -actin 의 oligonucleotide 서열은 sense oligonucleotide가 5'-ATGCAGAAGGAGA TCACTGC-3; antisense oligonucleotide^7]- 5'CTGCGC AAGTTAGGTTTTGT-3 이다.
- 5 uM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 4 unit Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, Hilden, Germany)로 37℃에서 60 min, 93℃에서 5 min heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다. Polymerase chain reaction (PCR)은 cDNA로부터 MMP-1, -actin 을 증폭하기 위하여 1 uL cDNA, 0.5의 5'과 3'pri- merf 10 x buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 200 uM dNTP, 25 mM MgCl2, 2.5 unit Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Germany)# 섞고 distilled water로 전체를 25 /jL로 맞춘 다음 PCR을 실시하였다. PCR증폭은 94℃ 0.
- 5 X 105 cells/mL의 농도로 35 mm dish에 배양, 약 80%의 confluency에 도달할 때까지 배양한다. UV조사 전에 원배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 배지 내 serum성분을 제거 후 6.3 J/cm2 UVA (UVA F15T8BLB, Sankyo Denki, Japan)를 조사하였다. UVA 조사 후 배양 배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM/F12 (3:1) 배지에 GF-glucan^- 처리하여 24 h 배양하였다.
- Total RNA추출은 RNeasy mini kit (Qiagen, Maryland, Germany)을 이용하였다. cDNA합성은 1의 total RNA 를 oligo (dT)15 primer, dNTP (0.5 uM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 4 unit Omniscript reverse transcriptase (Qiagen, Hilden, Germany)로 37℃에서 60 min, 93℃에서 5 min heating 시킴으로서 반응을 중지시켰다. Polymerase chain reaction (PCR)은 cDNA로부터 MMP-1, -actin 을 증폭하기 위하여 1 uL cDNA, 0.
- 따라서 MMP 저해 활성을 측정하여 저해 효과를 가지고 있는 소재는 주름을 개선하고 탄력 있는 피부를 위한 화장품 개발에 유용하게 사용될 수 있다. 균사체 배양을 통해 생산된 GF-glucan의 MMP-1 효소 활성에 대한 저해 효과를 확인하였다. Figure 2에서 확인할 수 있듯이 양성대조군 인 1, 10-phenanthroline의 경우 약 0.
- 균사체 배양을 통해 생산된 GF-glucan이 사람 섬유아세 포에서 나타나는 세포독성 농도 확인과 피부 자극 유발 가능성을 확인하기 위하여 세포독성 시험을 실시하였다. GF-glucan은 5% 이하의 농도에서 90% 이상의 세포 생존 율을 나타내어 이 농도 이하의 농도로 사용할 경우, 매우 안전한 것으로 확인되었다(Figure 3).
- 5 unit collagenase 40 uL을 첨가하였다. 암소, 실온에서 20 min 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, CT, USA) 를 이용하여 흡수파장 495 nm, 방출 파장 515 nm로 형광값을 측정하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응 완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소 활성 계산시 보정하였다.
- 피부의 광노화에 있어 MMPT의 발현은 UVA에 의해 세포에서 JNK/P38 활성도가 증가되고 전사인자인 AP-1 의 활성도가 증가되는 신호전달 경로를 통해 MMP-1 발현을 증가시켜 피부에서 교원 질의 결핍을 초래한다고 알려져 있다. 이러한 A에 의해 발현이 증가되는 MMP- 1에 대하여 단백질 수준에서 우수한 효과를 나타낸 GF-glucan의 MMP-1 mRNA발현량에 대한 저해 효과를RT-PCR<이용하여 평가하였다
- 잎새버섯 균사체를 배양하여 생산된 GF-glucan의 oxi dative stress 소거 효과를 확인하기 위하여 세포 내 산화과정 중 생성되는 라디칼 중 강력한 산화력을 가진 super oxide anion의 소거능을 측정하는 NBT시험을 하였다.
대상 데이터
- 구입한 HDF를 DMEM/F12 (3 : 1) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-strepto- mycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 6~10세대 세포를 실험에 이용하였다. Anti-MMP-1 antibody, anti-mouse IgG conjugated alkaline phosphatase, phosphatase substrate는 Sigma (MO, USA)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- 신생아의 표피조직에서 분리한 human dermal fibroblast (HDF)는 Modem Tissue Technology (MTT, Korea) 로부터 구입하였다. 구입한 HDF를 DMEM/F12 (3 : 1) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-strepto- mycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 6~10세대 세포를 실험에 이용하였다. Anti-MMP-1 antibody, anti-mouse IgG conjugated alkaline phosphatase, phosphatase substrate는 Sigma (MO, USA)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 잎새버섯다당체(GF-glucan)는 5 L 발효조를 통해 제조한 잎새버섯 균주(Grifola frondosa HB0071)의 세포 외 다당체를 실험에 이용하였다. 발효 배 양액은 메쉬와 원심분리기를 사용하여 균사체를 제거하고, 분리된 상등액은 4배량의 95% 에탄올을 가한 다음 4℃에서 24 h 침전시켰다.
- 신생아의 표피조직에서 분리한 human dermal fibroblast (HDF)는 Modem Tissue Technology (MTT, Korea) 로부터 구입하였다. 구입한 HDF를 DMEM/F12 (3 : 1) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-strepto- mycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하고 trypsinization으로 계대 배양한 뒤 6~10세대 세포를 실험에 이용하였다.
- MMP-1 효소 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-collagen, 효소(collagenase)는 Molecular Probe 사(Eugene, OR, USA)에서 시판 중인 제품을 사용하였으며, 반응 완충액 (0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCh, 2 mM sodium azide, pH 7.6) 100 uL에 0.25 mg/ mL DQ collagen 20 uL와 시료 40을 첨가하고 0.5 unit collagenase 40 uL을 첨가하였다. 암소, 실온에서 20 min 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, CT, USA) 를 이용하여 흡수파장 495 nm, 방출 파장 515 nm로 형광값을 측정하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응 완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소 활성 계산시 보정하였다.
- 발효 배 양액은 메쉬와 원심분리기를 사용하여 균사체를 제거하고, 분리된 상등액은 4배량의 95% 에탄올을 가한 다음 4℃에서 24 h 침전시켰다. 침전물을 원심분리하여 동결건조한 후 crude한 GF-glucan을 얻어 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균±표준편차로 표기하였고 통계적 유의성은 Students Atest로 하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- MMP-1 효소 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ-collagen, 효소(collagenase)는 Molecular Probe 사(Eugene, OR, USA)에서 시판 중인 제품을 사용하였으며, 반응 완충액 (0.
- Xanthine/xanthine oxidase 반응에서 형성된 superoxide radical 소거효과는 nitroblue tetrazolium (NBT) 방법에 의해 측정하였다 [18]. 50 mM Na2CO3 buffer (pH 10.
성능/효과
- 균사체 배양을 통해 생산된 GF-glucan의 MMP-1 효소 활성에 대한 저해 효과를 확인하였다. Figure 2에서 확인할 수 있듯이 양성대조군 인 1, 10-phenanthroline의 경우 약 0.01%의 농도에서 효 소활성의 90% 이상을 저해하는 것으로 나타난 것에 비해 GF-glucan의 경우 0.2%의 농도에서 효소 활성을 35% 저해하는 것으로 나타나, MMPT의 효소 활성에 대한 직접적인 저해 효과가 미약하게 나타났다.
- 균사체 배양을 통해 생산된 GF-glucan이 사람 섬유아세 포에서 나타나는 세포독성 농도 확인과 피부 자극 유발 가능성을 확인하기 위하여 세포독성 시험을 실시하였다. GF-glucan은 5% 이하의 농도에서 90% 이상의 세포 생존 율을 나타내어 이 농도 이하의 농도로 사용할 경우, 매우 안전한 것으로 확인되었다(Figure 3). GF-glucan을 5% 이하의 농도로 처리 시 섬유아세포의 생존에 영향이 없는 것으로 확인되어 이후 실험에서는 5% 이하의 농도로 실험을 진행하였다.
- 5에서 UVA를 처리하지 않은 것보다 MMP-1 mRNA량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다 . 결론적으로 GF-glucan은 자외선에 의해 유도된 MMP-1 의 발현을 단백질 및 mRNA 수준에서 억제하여, 자외선 조사에 의해 분해가 촉진되는 콜라겐을 보호하여 피부조직의 기계적 특성을 유지시켜 탄력과 피부가 늘어지는 것을 방지하는 효과를 가질 것으로 판단된다.
- 균사체 배양을 통해 생산된 GF-glucan에 대한 MMP-1 발현 억제 효과를 실험한 결과, UVA를 6.3 J/cm2 조사하는 경우 자외선을 조사하지 않은 대조군에 비해 약 24 %의 MMP-1 발현을 촉진하는 것을 확인하였으며, 효소 활성 저해 평가법에서 상대적으로 낮은 효소 활성 저해 효 과를 나타내었던 GF-glucan은 0.5%의 농도에서 자외선에 의한 MMP-1 발현 촉진을 완전히 억제할 뿐만 아니라, UVA를 조사하지 않은 대조군에 비해서도 약 54.4%의 MMP-1 발현을 억제하는 것으로 나타났다(Figure 4).이는 UV에 의한 c-Jun 단백질의 발현 증가를 억제하여 MMPT 발현 저해 효과가 보고된 [25] retinoic acid (3.
- 본 연구에서는 잎새버섯(G frondosa HB0071)균주에서 생산되는 세포 외 다당체(GF-glucan)가 사람 섬유아세포에 서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 사람 섬유아세포에서 UVA에 의해 발현이 증가되는 MMP-1 의 발현저해 효과는 0.5% GF-glucan에서 54.4%로 단백질 수준에서 우수한 발현 저 해효과를 나타내었으며, mRNA수준에서도 GF-glucan은 농도의존적으로 발현저해효과가 나타났다. 결론적으로 GF-glucan은 UVA에 의한 MMP의 발현을 효과적으로 저해하는 것으로 보아 우수한 광방어 소재로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 그 결과 잎새버섯을 배양하여 얻은 GF-glucan을 0.01 %부터 0.5%로 처리할 경우 MMP-1 mRNA 발현 저해 효 과는 최대 60%로, 농도의존적으로 MMP-1 mRNA 발현이 감소하였으며(Figure 5), UV에 의한 c-Jun 단백질의 발현 증가를 억제하여 MMP-1 발현저해 효과가 보고된[25] retinoic acid의 경우에도 3.5에서 UVA를 처리하지 않은 것보다 MMP-1 mRNA량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다 . 결론적으로 GF-glucan은 자외선에 의해 유도된 MMP-1 의 발현을 단백질 및 mRNA 수준에서 억제하여, 자외선 조사에 의해 분해가 촉진되는 콜라겐을 보호하여 피부조직의 기계적 특성을 유지시켜 탄력과 피부가 늘어지는 것을 방지하는 효과를 가질 것으로 판단된다.
- 5 uM)보다 우수한 MMP-1 발현 억제 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 결과는 in vitro MMP-1 저해활성 평가 결과에서 GF-읺ucan이 직접적으로 우수한 저해 활성을 가지는 것으로 나타나지 않았지만, GF- glucan은 자외선에 의해 유도된 MMP-1 생합성 과정의 다양한 경로를 통해 MMP-1 의 생합성을 억제하는 것으로 생각된다.
- 4%의 MMP-1 발현을 억제하는 것으로 나타났다(Figure 4).이는 UV에 의한 c-Jun 단백질의 발현 증가를 억제하여 MMPT 발현 저해 효과가 보고된 [25] retinoic acid (3.5 uM)보다 우수한 MMP-1 발현 억제 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 결과는 in vitro MMP-1 저해활성 평가 결과에서 GF-읺ucan이 직접적으로 우수한 저해 활성을 가지는 것으로 나타나지 않았지만, GF- glucan은 자외선에 의해 유도된 MMP-1 생합성 과정의 다양한 경로를 통해 MMP-1 의 생합성을 억제하는 것으로 생각된다.
후속연구
- 4%로 단백질 수준에서 우수한 발현 저 해효과를 나타내었으며, mRNA수준에서도 GF-glucan은 농도의존적으로 발현저해효과가 나타났다. 결론적으로 GF-glucan은 UVA에 의한 MMP의 발현을 효과적으로 저해하는 것으로 보아 우수한 광방어 소재로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
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