[논문]Bacillus alcalophilus AX2000 유래 xylanase 유전자 (XynT)의 Cloning과 염기서열 분석

박영서

doi:10.5352/jls.2005.15.5.734

Bacillus alcalophilus AX2000 유래 xylanase 유전자 (XynT)의 Cloning과 염기서열 분석
Molecular Cloning and Nucleotide Sequence of Xylanase gene (xynT) from Bacillus alcalophilus AX2000. 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.15 no.5 = no.72, 2005년, pp.734 - 738

박영서 (경원대학교 생명공학부)

초록
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Xylanase를 생산하는 알칼리 내성 Bacillus alcalophilus AX2000의 chromosomal DNA로부터 xylanase 유전자를 cloning하여 그 염기배열 순서를 결정한 다음 이로부터 유전자 발현에 관련된 구조를 분석하였다. Xylanase 유전자의 cloning을 위해 제한효소 PstI으로 절단한 B. alcalophilus AX2000의 chromosomal DNA와 pUC19을 ligation 시켜 E. coli $DH5\alpha$에 형질전환시킨 후 형질전환체 중에서 xylanase 활성을 나타내는 재조합 plasmid pXTY99를 분리하였다. 재조합 plasmid pXTY99은 pUC19의 PstI 부위 내에 7kb의 외래 DNA가 삽입 되 었다. Cloning된 xylanase 유전자(xynT)의 염기배열을 분석한 결과 유전자의 크기는 1,020 bp이었고 이는 340개의 아미노산으로 구성된 분자량 40 kDa의 poly-peptide를 coding하고 있었다. 이 염기배열은 AUG 개시 codon으로부터 각각 259와 282 base상류에 TACAAT의 -10 box와 GTTCACA인 -35 box로 추정되는 염기배열이 존재하였으며 ribosome 결합부위가 존재하였다. B. alcalophilus AX2000의 xylanase와 아미노산배열의 유사성이 가장 높은 xylanase는 Bacillus sp. N137과 B. stearothemophilus 21 유래의 xylanase로 각각 $61\%$와 $59\%$의 유사성을 나타내었다.

Abstract ▼ AI-Helper

A gene coding for xylanase from alkali-tolerant Bacillus alcalophilus AX2000 was cloned into Escherichia coli $DH5\alpha$ using pUC19. Among 2,000 transformants, one transformant showed clear zone on the detection agar plate containing oat-spells xylan. Its recombinant plasmid, named pXTY99, was found to carry 7.0 kb insert DNA fragment. When the nucleotide sequence of the cloned xylanase gene (xynT) was determined, xynT gene was found to consist of 1,020 base-pair open reading frame coding for a poly-peptide of 340 amino acids with a deduced molecular weight of 40 kDa. The coding sequence was preceded by a putative ribosome binding site, and the transcription initiation signals. The deduced amino acid sequence of xylanase is similar to those of the xylanases from Bacillus sp. Nl37 and B. stearothermophilus 21 with $61\%$ and $59\%$ identical residues, respectively.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

Xylanase 유전자를 cloning하기 위하여 Wizard Genomic DNA Purification System (Promega, USA)을 이용하여 B. alcalophilus AX2000으로부터 분리된 chromosomal DNA를 PstL으로 부분 절단 한 후 pUC₁₉에 ligation시킨 다음 E. coli DH₅_q에 형질 전환시켰다[디. LB/Ap/X-Gal/IPTG 배지[5]에서 형성된 형질전환 체 중에 서 white colony를 나타내는 약 2,000주의 재조합체를 0.5%의 oat-spelts xylan이 함유된 LB 한 천배지에 배양시킨 결과 colony 주위에 투명환을 생성하는 균주를 얻었다. 이 균주로부터 plasmid DNA를 분리한 후 제한효소 분석을 실시한 결과 pUC₁₉의 PstI 부위에 7.
Xylanase를 생산하는 알칼리내성 Bacillus alcalophilus AX2000의 chromosomal DNA로부터 xylanase 유전자를 cloning하여 그 염기배열 순서를 결정한 다음이로부터 유전자 발현에 관련된 구조를 분석하였다. Xylanase 유전자의 cloninge;.
24 U/ml로 나타나 vector 내에 xylanase 유전자가 cloning되 었음을 확인하였고, 이재조합 plasmid DNA를 pXTY99로 명명하였다. pXTY99 의 제한효소 분석과 효소 활성 측정에 의해 xylanase 유전자가 존재하는 것으로 확인된 2.27 kb의 Cla I -Pst I DNA 단편의 염기서열결정을 기초과학지원 연구소에 의뢰하여 ABI 자동염기 분석기로 수행하였다. 그 결과 xylanase 유전자를 함유한 삽입 DNA의 크기는 2.
본 연구에 사용된 xylanase 유전자의 공여 균주로는 pH 10 에서 최적 효소 활성을 지니는 호알칼리성 xylanase를 생산하는 Bacillus alcalophilus AX2000[4]을 사용하였다, Xylanase 효소의 활성 측정은 1%의 xylan 용액(oat-spolts xylan in 10 mM Tris-HCL pH 8.0)을 기질로 사용하여 Somogyi-Nelson 의 환원 당 정량법 I기에 의하여 수행하였으며 효소 1 U는 주어진 조건에서 분당 1 μm 이의 D-xylose를 생성할 수 있는 효소의 양으로 정하였다.
본 연구에서는 토양으로부터 분리한 알칼리 내성 Bacillus 균주의 chromosomal DNA로부터 xylanase 유전자를 cloning하여 그 염기배열 순서를 결정한 후 이로부터 전사, 번역 등 유전자 발현에 관련된 구조를 분석하였다.
Xylanase 유전자의 cloninge;. 위해” 제한효소 PsH으로 절단한 B. alcalophilus AX2000의 chromosomal DNA와 pUC₁₉을 ligation 시켜 E. coli DH₅_q에 형질전환시킨 후 형질전환체중에서 xylanase 활성을 나타내는 재조합 plasEd pXTY99를 분리하였다. 재조합 plasmid pXTY99은 pUC₁₉의 PstI 부위 내에 7 kb의 외래 DNA가 삽입되었다.

성능/효과

alcalophilus AX2000의 xylanase와 가장 유사성이 높은 xylanase는 Bacillus sp. N₁₃7 유래의 xylanase로 61%의 아미노산이 동일하였으며 그 다음으로 B. 이}hilus 21(59%)과 B. stearothermophilus6(57%) 유래의 xylanase 순으로 유사성이 높았다. 현재까지 xylanase 의 활성 부위에 관 한 연구가 여러 연구진들에 의해 보고되었는데, Wakarchuk 등 μ 1]은B.
alcalophilus AX2000의 xylanase와 아미노산 배열의 유사성이 가장 높은 xylanase는 Bacillus sp. N₁₃7과 B. stearothermophilus 21 유래의 xylanase로 각각 61%와 59%의 유사성을 나타내었다.
1에서와 같이 ATG 개시 codon 으로부터 각각 259와 282 base 상류에-10 box와 -35 box로 추정되는 공통염기배열 의 존재를 확인하였다. TACAAT의 염기서열을 가진-10 box의 경우는 B. subtilis의 oA 인자가 인식하는 promoter의 공통염기배열인 TATAAT와 5개의 염기가 일치하였고, -35 box의 GTCACA는 공통 염기배열인 TTGACA '와 6개 중 4개의 염기가 일치하여 비교적 잘 보존되어 있음을 알 수 있었다. 또한 -10 box와 35box 사이의 간격도 17 bp로 매우 효율적인 promoter 구조임을 알 수 있었다.
또한 본유전자의 3, 말단의 하류에는 13 base로 이루어진 상보적역반복 서열이 10개의 염기를 사이에 두고 존재하여 mRNA로 전사될 때 stem-loop 구조가 형성될 수 있음을 확인하였다. 그러나 stem-loop 구조 내에 GC-rich한 부위가 존재하지 않았기 때문에 이 구역은 P-factor 의존성 전사termi- natoi로 작용할 것으로 추측되었다.
alcalophilus AX2000에서 세포 밖으로 분비되므로 signal peptide가 존재할 것으로 예상되었다. 본xylanase의 hydropathy plot을 살펴본 결과 N 말단 부분에 소수성 부위가 존재하는 것으로 나타나 첫 번째 아미노산으로부터 23번째 아미노산인 alanine까지의 부위가 signal peptide인 것으로 추측되어지며 signal peptidase의 전형적인 절단 부위인 23번째와 24번째에 존재하는 alanine과 alanine사이에서 절단이 이루어지는 것으로 사료되었다(data not 아iown).정확한 signal peptide의 위치를 알기 위해서는 세포 외로 분비된 효소를 정제한 후 N 말단 아미노산 서열 결정 실험이 요구된다.
대부분의 xylanase는 Bacillus의 영양세포 단계에서 생합성되어 분비되므로 영양세포 단계의 유전자 발현에 관계하는 RNA 중합효소의 oA 인자가 유전자의 전사 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다 [6]. 본연구에서 사용된 xylanase 역시 B. alcalophilus AX2000의 영양세포에서 생산되므로 xynT 유전자의 염기배열에서 Bacillus의 인자가 인식하는 promoter 구역을 검색해 본 결과 Fig. 1에서와 같이 ATG 개시 codon 으로부터 각각 259와 282 base 상류에-10 box와 -35 box로 추정되는 공통염기배열 의 존재를 확인하였다. TACAAT의 염기서열을 가진-10 box의 경우는 B.
1에 나타내었다. 이 DNA 단편에는 ATG 개시코 돈으로 시작되는 1, 020 bp의 open reading frame이 한 개가 존재하는 것으로 확인되었고, 이를 xylanase 유전자인 것으로 확인하여 xynT라 명명하였다(GenBank accession number: AY423561). Xylanase를 coding하고 있는 이 open reading framee 340개의 아미노산으로 구성되어 있으며 추산 분자량이 40 kDa인 하나의 polypeptide 분자의 유전정보를 지니고 있었다 ' Bacillus 중에는 pl가 낮으면서 분자량이 높은 종류와 pl가 높으면서 분자량이 낮은 종류가 있는데 본xylanase의 p I 는 5.
5%의 oat-spelts xylan이 함유된 LB 한 천배지에 배양시킨 결과 colony 주위에 투명환을 생성하는 균주를 얻었다. 이 균주로부터 plasmid DNA를 분리한 후 제한효소 분석을 실시한 결과 pUC₁₉의 PstI 부위에 7.0 kb의 DNA 단편이 삽입되었음을 확인하였으며 이 재조합 균주의 xylanase 활성을 측정한 결과 0.24 U/ml로 나타나 vector 내에 xylanase 유전자가 cloning되 었음을 확인하였고, 이재조합 plasmid DNA를 pXTY99로 명명하였다. pXTY99 의 제한효소 분석과 효소 활성 측정에 의해 xylanase 유전자가 존재하는 것으로 확인된 2.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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