음이온교환 크로마토그래피를 이용한 누에체액 유래 30K 단백질의 정제와 정제된 단백질이 인간세포 배양 증식에 미치는 영향 One-step Separation of 30K Protein from the Silkworm Hemolymph by Anion-exchange Chromatography and Its Effect on the Proliferation of Human Cells원문보기
누에체액 성분 중의 30K 단백질은 Q-Sepharose FF를 이용한 단계별 농도구배 이온교환 크로마토그래피로 0.16 M NaCl 용출 조건에서 쉽게 얻을 수 있었다. 얻어진 단백질을 인간유래 정상세포에 처리하여 세포 증식 향상이 확인되었고, 이는 30K 단백질이 인간을 위한 세포치료제에 이용되는 세포의 증식을 위한 첨가물로 사용될 수 있음으로써 의료 분야에의 적용 가능성을 확인하였다. 또한 본 연구를 통해 확립된 30K 단백질의 간단한 정제 공정은 향후 대량 생산 공정으로 scale-up이 용이하게 이루어질 것으로 기대된다. 이 결과들은 동물세포를 생산 숙주로 사용할 때 생산 물질 자체의 생산량 증대에도 효과적으로 이용될 수 있으며 세포치료제를 위한 세포의 증식에도 효과를 보일 수 있으므로 세포배양을 이용한 생산 공정 전반에 큰 영향을 미칠 수 있을 것이다.
누에체액 성분 중의 30K 단백질은 Q-Sepharose FF를 이용한 단계별 농도구배 이온교환 크로마토그래피로 0.16 M NaCl 용출 조건에서 쉽게 얻을 수 있었다. 얻어진 단백질을 인간유래 정상세포에 처리하여 세포 증식 향상이 확인되었고, 이는 30K 단백질이 인간을 위한 세포치료제에 이용되는 세포의 증식을 위한 첨가물로 사용될 수 있음으로써 의료 분야에의 적용 가능성을 확인하였다. 또한 본 연구를 통해 확립된 30K 단백질의 간단한 정제 공정은 향후 대량 생산 공정으로 scale-up이 용이하게 이루어질 것으로 기대된다. 이 결과들은 동물세포를 생산 숙주로 사용할 때 생산 물질 자체의 생산량 증대에도 효과적으로 이용될 수 있으며 세포치료제를 위한 세포의 증식에도 효과를 보일 수 있으므로 세포배양을 이용한 생산 공정 전반에 큰 영향을 미칠 수 있을 것이다.
In order to investigate the feasibility of 30K protein from silkworm (Bombyx mori) hemolymph (SH) on the proliferation of human cells, a simple separating procedure by anion-exchange chromatography system with Q-Sepharose fast flow gel was established. The 30K protein was eluted with an optimized co...
In order to investigate the feasibility of 30K protein from silkworm (Bombyx mori) hemolymph (SH) on the proliferation of human cells, a simple separating procedure by anion-exchange chromatography system with Q-Sepharose fast flow gel was established. The 30K protein was eluted with an optimized condition of 0.16 M sodium chloride in 20 mM tris buffer (pH 9.0). The separated 30K protein at three concentrations of 0.04, 0.12, and 0.4 mg/ml was added to the culture medium with various human cells, such as chondrocytes, periosteum-derived cells, and MRC-5 cells, and their growth rates were measured. The cell growth rate at protein concentration of 0.4 mg/ml was always higher than that without 30K protein in all human cells tested, suggesting that the 30K protein has positive effect on the increase of the life span of human cells.
In order to investigate the feasibility of 30K protein from silkworm (Bombyx mori) hemolymph (SH) on the proliferation of human cells, a simple separating procedure by anion-exchange chromatography system with Q-Sepharose fast flow gel was established. The 30K protein was eluted with an optimized condition of 0.16 M sodium chloride in 20 mM tris buffer (pH 9.0). The separated 30K protein at three concentrations of 0.04, 0.12, and 0.4 mg/ml was added to the culture medium with various human cells, such as chondrocytes, periosteum-derived cells, and MRC-5 cells, and their growth rates were measured. The cell growth rate at protein concentration of 0.4 mg/ml was always higher than that without 30K protein in all human cells tested, suggesting that the 30K protein has positive effect on the increase of the life span of human cells.
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문제 정의
본 연구에서는, 누에 체액에 의한 세포 생장의 증가가 연골 세포, 골막 유래 세포, 그리고 MRC-5 세포주와 같은 인간 유래 정상세포에서도 나타남을 확인하였으며 , 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 누에체액으로부터 세포 사멸 억제 효과가 가장 뛰어나다고 알려진 30K 단백질을 빠르고 간단하게 분리할 수 있는 정제 조건을 확립하고자 하였다. 분획된 단백질 또한 인간 유래 정상세포에서 세포증식 향상 효과를 가지고 있음을 확인하여 세포치료용 의료 분야로의 적용 가능성을 살펴보았다.
분획된 단백질 또한 인간 유래 정상세포에서 세포증식 향상 효과를 가지고 있음을 확인하여 세포치료용 의료 분야로의 적용 가능성을 살펴보았다.
제안 방법
12-well plate에 인간 유래 정상 연골세포와 (passage 2) 골막유래 세포 (passage 4), MRC-5 세포주 (passage 19)를각 well 당 2 X 10, 개의 세포 수로 접종하였다. FBS가 10% 첨가된 DMEM과 FBS가 첨가되지 않은 DMEM을 배양액으로 사용하는 well 을 대조군으로 하여 FBS 가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 누에 체액을 각각 1, 3, 10% (v/v)씩 처리한 well, FBS가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 정제 .
분획된 단백질은 SDS-PAGE 를 통해 분리하였으며, PVDF membrane (Invitrogen, USA)으로 단백질을 이동시켰다. 1차 항체인 mouse anti-silkworm 30K protein을 5,000aH 희석하여 1시간 처리 후 trizma buffered saline with tween 20 (TBST)로 3회 세척한 뒤 2차 항체로 peroxidase labeled goat anti-mouse IgG (KPL, USA)를 처리하였다. 발색을 위해서는 TMB membrane peroxidase substrate (KPL, USA)를 이용하였다
30K 단백질을 분리하기 위하여 AKTA-FPLC system (Amersham Biosciences, Sweden)을 사용하였다. XK26/40 컬럼 (Amersham Biosciences, Sweden) 에 Q-Sepharose FF (Amersham Biosciences, Sweden)를 200 ml 충전하여 이온교환 컬럼을 제작하였으며 이동상으로는 20 mM trizma-base 완충액 (pH 9.
well 당 2 X 10, 개의 세포 수로 접종하였다. FBS가 10% 첨가된 DMEM과 FBS가 첨가되지 않은 DMEM을 배양액으로 사용하는 well 을 대조군으로 하여 FBS 가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 누에 체액을 각각 1, 3, 10% (v/v)씩 처리한 well, FBS가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 정제 . 농축된 30K 단백질 용액을 누에 체액을 1, 3, 10% 사용하였을 때 첨가되는 30K 단백질의 양만큼 (각각 0.
FBS가 10% 첨가된 DMEM과 FBS가 첨가되지 않은 DMEM을 배양액으로 사용하는 well 을 대조군으로 하여 FBS 가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 누에 체액을 각각 1, 3, 10% (v/v)씩 처리한 well, FBS가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 정제 . 농축된 30K 단백질 용액을 누에 체액을 1, 3, 10% 사용하였을 때 첨가되는 30K 단백질의 양만큼 (각각 0.04, 0.12, 0.4 mg/ml) 처리한 well을 비교하였다. FBS가 첨가된 배지의 경우 누에체액이 첨가되는 비율만큼 FBS의 양은 감소시켰다.
누에체액이 인간 유래 정상세포의 증식에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 대상 세포로서 연골세포, 골막유래 세포, MRC-5 세포주를 사용하였으며, 누에체액 원액을 여러 가지로 형태로 처리하여 누에체액이 세포 증식에 미치는 영향을 확인하였다. Fig.
SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 단백질 시료는 9 5℃ 에서 3분간 열처리한 후 사용하였으며, 12% polyacrylamide separating gel을 사용하여 단백질 패턴을 분석하였다. 전기영동 후 젤은 Coomassie brilliant blue R250 (CBB R250, Sigma)으로 염색하였다.
분획된 단백질들과 누에 체액에 존재하는 단백질들의 유형을 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 단백질 시료는 9 5℃ 에서 3분간 열처리한 후 사용하였으며, 12% polyacrylamide separating gel을 사용하여 단백질 패턴을 분석하였다.
3), F4와 F5 분획에 30K 단백질이 포함되어 있는 것을 확인하였다. 세포 생장에 대한 효과를 확인하기 위한 실험에 사용하기 위하여 분획의 용매를 PBS로 치환, 농축하였다(Fig. 4). 이때 단백질 획득 수율은 62 ± 9%였다.
인간 유래의 연골세포를 분리하기 위하여 연골 조직을 잘게 자른 후 0.2% (w/v) type II collagenase (Washington, USA)를 녹인 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, USA) 배양액에 넣어 37℃에서 12~24시간 동안 처리하였다. 단일 세포로 분리되면 phosphate buffered saline (PBS, Gibco, USA)으로 3회 세척하고 fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA) 이 10% (v/v) 첨가된 DMEM 배양액을 넣어 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
이때 단백질 획득 수율은 62 ± 9%였다. 정제된 30K 단백질의 세포 증식에 대한 효과 얻어진 단백질 분획이 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 단백질 분획을 여러가지 형태로 세포 배양액에 첨가하였으며, 그 결과는 Fig. 5에 정리한 것과 같다. 누에체액 1% 사용시의 결과와 마찬가지로 FBS가 들어 있는 배지에서 단백질이 0.
크로마토그래피 법을 이용하였다. 컬럼에 20 mM trizma-base (pH 9.0) 이동상으로 희석한 누에 체액을 주입하고 1 M의 NaCl이 첨가된 이동상을 이용하여 선형 농도구배 크로마토그래피를 수행하였다. 얻어진 단백질 분획들을 SDS-PAGE 및 Western blot을 통해 분석하여 0.
이론/모형
누에체액 성분 중에 존재하는 30K 단백질의 정제에 있어서 보다 간단하면서도 대량 정제로의 scale-up이 용이한정제 과정을 확립하기 위하여 Q-Sepharose FF를 이용한 이온교환 크로마토그래피 법을 이용하였다. 컬럼에 20 mM trizma-base (pH 9.
분획된 단백질에 30K 단백질의 존재 유무를 확인하기 위하여 Western blot 을 수행하였다. 분획된 단백질은 SDS-PAGE 를 통해 분리하였으며, PVDF membrane (Invitrogen, USA)으로 단백질을 이동시켰다.
세포 수 확인을 위해서는 MTT assay를 수행하였다. 3-4, 5- dimethylthiazol-2yl-2, 5-diphenyltetrazoliuin bromide (MTT, Sigma)를 PBS에 2 mg/ml이 되도록 녹인 후 배지와 1 : 4 의 비율로 희석하여 사용하였으며, MTT 시약을 처리한 뒤 37 ℃ 에서 4시간 동안 반응시켰다.
피크가 검출될 때 용출액을 40 ml 씩 분획하였다. 얻어진 단백질 용액은 vivaflow 50 system (10, 000 MWCO RC, Sartorius, Germany)을 이용한 투석법을 이용하여 PBS로 용매를 치환함과 동시에 용액을 농축하였다.
성능/효과
04 mg/ml (누에체액 1% 사용시의 함유량) 첨가하였을 때와 비슷한 세포 증식 결과를 얻었다. 0.12 mg/ml (누에체액 3% 사용시의 함유량) 첨가한 경우에는 FBS가상대적으로 적게 들어가 0.04 mg/ml과 0.4 mg/ml 첨가된 경우 뿐만 아니라 단백질이 첨가되지 않은 경우보다 낮은 세포 성장을 보였다. FBS가 사용되지 않은 경우에는 누에 체액 원액을 사용했을 때와 마찬가지로 거의 세포 증식이 이루어지지 않았다.
확인하였다. Fig. 1에 나타낸 것과 같이 누에체액이 FBS가 첨가된 배지에 1%로 들어간 경우 누에체액이 첨가되지 않은 경우보다 모든 세포 종류에서 세포 증식이 더욱 뛰어났음을 확인할 수 있었다. 반면에 3% 농도로 첨가된 경우에는 연골세포의 경우 누에체액이 1% 첨가된 경우와 유사한 증식률을 보였으나, 골막 유래 세포의 경우에서는 누에체액이 첨가되지 않은 경우와 유사하게, MRC-5 세포주에서는 누에체액이 사용되지 않았을 때 보다 현저하게 세포 생장률이 감소하는 것을 보였다.
그러나 누에체액 원액이 10% 첨가되었을 경우 첨가되지 않았을 때보다 낮은 세포 생장을 보인 것과 달리, 정제된 단백질을 0.4 mg/ml (누에체액 원액 10% 사용시 30K 단백질 함유량) 첨가하였을 때 실험에 사용된 모든 세포주에서 첨가하지 않은 경우보다 높은 세포 증식률을 보였을 뿐만 아니라 0.04 mg/ml (누에체액 1% 사용시의 함유량) 첨가하였을 때와 비슷한 세포 증식 결과를 얻었다. 0.
5에 정리한 것과 같다. 누에체액 1% 사용시의 결과와 마찬가지로 FBS가 들어 있는 배지에서 단백질이 0.04 mg/ml 농도로 첨가되었을 때 첨가되지 않은 경우보다 실험에 사용된 세 가지 세포주 모두 세포 증식에 효과적이었다.
반면에 3% 농도로 첨가된 경우에는 연골세포의 경우 누에체액이 1% 첨가된 경우와 유사한 증식률을 보였으나, 골막 유래 세포의 경우에서는 누에체액이 첨가되지 않은 경우와 유사하게, MRC-5 세포주에서는 누에체액이 사용되지 않았을 때 보다 현저하게 세포 생장률이 감소하는 것을 보였다. 또한 10% 농도로 첨가된 경우에는 모든 세포주에서 누에체액이 첨가되지 않은 경우보다 낮은 세포 세포증식률을 보였다. FBS 가 사용되지 않은 경우에는 (SFM) 실험에 사용된 세포주 모두 세포 증식이 거의 이루어지지 않았다.
1에 나타낸 것과 같이 누에체액이 FBS가 첨가된 배지에 1%로 들어간 경우 누에체액이 첨가되지 않은 경우보다 모든 세포 종류에서 세포 증식이 더욱 뛰어났음을 확인할 수 있었다. 반면에 3% 농도로 첨가된 경우에는 연골세포의 경우 누에체액이 1% 첨가된 경우와 유사한 증식률을 보였으나, 골막 유래 세포의 경우에서는 누에체액이 첨가되지 않은 경우와 유사하게, MRC-5 세포주에서는 누에체액이 사용되지 않았을 때 보다 현저하게 세포 생장률이 감소하는 것을 보였다. 또한 10% 농도로 첨가된 경우에는 모든 세포주에서 누에체액이 첨가되지 않은 경우보다 낮은 세포 세포증식률을 보였다.
0) 이동상으로 희석한 누에 체액을 주입하고 1 M의 NaCl이 첨가된 이동상을 이용하여 선형 농도구배 크로마토그래피를 수행하였다. 얻어진 단백질 분획들을 SDS-PAGE 및 Western blot을 통해 분석하여 0.16 M NaCl 의 용출조건에서 얻어진 단백질에 30K 단백질이 존재함을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 토대로 단계별 농도구배 크로마토그래피를 실시하였고(Fig.
16 M NaCl 용출 조건에서 쉽게 얻을 수 있었다. 얻어진 단백질을 인간유래 정상 세포에 처리하여 세포 증식 향상이 확인되었고, 이는 30K 단백질이 인간을 위한 세포치료제에 이용되는 세포의 증식을 위한 첨가물로 사용될 수 있음으로써 의료 분야에의 적용 가능성을 확인하였다. 또한 본 연구을 통해 확립된 30K 단백질의 간단한 정제 공정은 향후 대량 생산 공정으로 scale-up이 용이하게 이루어질 것으로 기대된다.
16 M NaCl 의 용출조건에서 얻어진 단백질에 30K 단백질이 존재함을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 토대로 단계별 농도구배 크로마토그래피를 실시하였고(Fig. 2), 얻어진 단백질 분획들 또한 SDS-PAGE 및 Western blot을 통해 분석하였으며 (Fig. 3), F4와 F5 분획에 30K 단백질이 포함되어 있는 것을 확인하였다. 세포 생장에 대한 효과를 확인하기 위한 실험에 사용하기 위하여 분획의 용매를 PBS로 치환, 농축하였다(Fig.
후속연구
얻어진 단백질을 인간유래 정상 세포에 처리하여 세포 증식 향상이 확인되었고, 이는 30K 단백질이 인간을 위한 세포치료제에 이용되는 세포의 증식을 위한 첨가물로 사용될 수 있음으로써 의료 분야에의 적용 가능성을 확인하였다. 또한 본 연구을 통해 확립된 30K 단백질의 간단한 정제 공정은 향후 대량 생산 공정으로 scale-up이 용이하게 이루어질 것으로 기대된다. 이 결과들은 동물세포를 생산 숙주로 사용할 때 생산 물질 자체의 생산량 증대에도 효과적으로 이용될 수 있으며 세포치료제를 위한 세포의 증식에도 효과를 보일 수 있으므로 세포배양을 이용한 생산 공정 전반에 큰 영향을 미칠 수 있을 것이다.
또한 본 연구을 통해 확립된 30K 단백질의 간단한 정제 공정은 향후 대량 생산 공정으로 scale-up이 용이하게 이루어질 것으로 기대된다. 이 결과들은 동물세포를 생산 숙주로 사용할 때 생산 물질 자체의 생산량 증대에도 효과적으로 이용될 수 있으며 세포치료제를 위한 세포의 증식에도 효과를 보일 수 있으므로 세포배양을 이용한 생산 공정 전반에 큰 영향을 미칠 수 있을 것이다.
참고문헌 (11)
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