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문제 정의
- 본 연구에서는, 누에 체액에 의한 세포 생장의 증가가 연골 세포, 골막 유래 세포, 그리고 MRC-5 세포주와 같은 인간 유래 정상세포에서도 나타남을 확인하였으며 , 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 누에체액으로부터 세포 사멸 억제 효과가 가장 뛰어나다고 알려진 30K 단백질을 빠르고 간단하게 분리할 수 있는 정제 조건을 확립하고자 하였다. 분획된 단백질 또한 인간 유래 정상세포에서 세포증식 향상 효과를 가지고 있음을 확인하여 세포치료용 의료 분야로의 적용 가능성을 살펴보았다.
- 분획된 단백질 또한 인간 유래 정상세포에서 세포증식 향상 효과를 가지고 있음을 확인하여 세포치료용 의료 분야로의 적용 가능성을 살펴보았다.
제안 방법
- 12-well plate에 인간 유래 정상 연골세포와 (passage 2) 골막유래 세포 (passage 4), MRC-5 세포주 (passage 19)를각 well 당 2 X 10, 개의 세포 수로 접종하였다. FBS가 10% 첨가된 DMEM과 FBS가 첨가되지 않은 DMEM을 배양액으로 사용하는 well 을 대조군으로 하여 FBS 가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 누에 체액을 각각 1, 3, 10% (v/v)씩 처리한 well, FBS가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 정제 .
- 분획된 단백질은 SDS-PAGE 를 통해 분리하였으며, PVDF membrane (Invitrogen, USA)으로 단백질을 이동시켰다. 1차 항체인 mouse anti-silkworm 30K protein을 5,000aH 희석하여 1시간 처리 후 trizma buffered saline with tween 20 (TBST)로 3회 세척한 뒤 2차 항체로 peroxidase labeled goat anti-mouse IgG (KPL, USA)를 처리하였다. 발색을 위해서는 TMB membrane peroxidase substrate (KPL, USA)를 이용하였다
- 30K 단백질을 분리하기 위하여 AKTA-FPLC system (Amersham Biosciences, Sweden)을 사용하였다. XK26/40 컬럼 (Amersham Biosciences, Sweden) 에 Q-Sepharose FF (Amersham Biosciences, Sweden)를 200 ml 충전하여 이온교환 컬럼을 제작하였으며 이동상으로는 20 mM trizma-base 완충액 (pH 9.
- well 당 2 X 10, 개의 세포 수로 접종하였다. FBS가 10% 첨가된 DMEM과 FBS가 첨가되지 않은 DMEM을 배양액으로 사용하는 well 을 대조군으로 하여 FBS 가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 누에 체액을 각각 1, 3, 10% (v/v)씩 처리한 well, FBS가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 정제 . 농축된 30K 단백질 용액을 누에 체액을 1, 3, 10% 사용하였을 때 첨가되는 30K 단백질의 양만큼 (각각 0.
- FBS가 10% 첨가된 DMEM과 FBS가 첨가되지 않은 DMEM을 배양액으로 사용하는 well 을 대조군으로 하여 FBS 가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 누에 체액을 각각 1, 3, 10% (v/v)씩 처리한 well, FBS가 첨가된 DMEM 배양액과 첨가되지 않은 DMEM 배양액에 정제 . 농축된 30K 단백질 용액을 누에 체액을 1, 3, 10% 사용하였을 때 첨가되는 30K 단백질의 양만큼 (각각 0.04, 0.12, 0.4 mg/ml) 처리한 well을 비교하였다. FBS가 첨가된 배지의 경우 누에체액이 첨가되는 비율만큼 FBS의 양은 감소시켰다.
- 누에체액이 인간 유래 정상세포의 증식에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 대상 세포로서 연골세포, 골막유래 세포, MRC-5 세포주를 사용하였으며, 누에체액 원액을 여러 가지로 형태로 처리하여 누에체액이 세포 증식에 미치는 영향을 확인하였다. Fig.
- SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 단백질 시료는 9 5℃ 에서 3분간 열처리한 후 사용하였으며, 12% polyacrylamide separating gel을 사용하여 단백질 패턴을 분석하였다. 전기영동 후 젤은 Coomassie brilliant blue R250 (CBB R250, Sigma)으로 염색하였다.
- 분획된 단백질들과 누에 체액에 존재하는 단백질들의 유형을 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 단백질 시료는 9 5℃ 에서 3분간 열처리한 후 사용하였으며, 12% polyacrylamide separating gel을 사용하여 단백질 패턴을 분석하였다.
- 3), F4와 F5 분획에 30K 단백질이 포함되어 있는 것을 확인하였다. 세포 생장에 대한 효과를 확인하기 위한 실험에 사용하기 위하여 분획의 용매를 PBS로 치환, 농축하였다(Fig. 4). 이때 단백질 획득 수율은 62 ± 9%였다.
- 인간 유래의 연골세포를 분리하기 위하여 연골 조직을 잘게 자른 후 0.2% (w/v) type II collagenase (Washington, USA)를 녹인 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, USA) 배양액에 넣어 37℃에서 12~24시간 동안 처리하였다. 단일 세포로 분리되면 phosphate buffered saline (PBS, Gibco, USA)으로 3회 세척하고 fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA) 이 10% (v/v) 첨가된 DMEM 배양액을 넣어 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
- 이때 단백질 획득 수율은 62 ± 9%였다. 정제된 30K 단백질의 세포 증식에 대한 효과 얻어진 단백질 분획이 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 단백질 분획을 여러가지 형태로 세포 배양액에 첨가하였으며, 그 결과는 Fig. 5에 정리한 것과 같다. 누에체액 1% 사용시의 결과와 마찬가지로 FBS가 들어 있는 배지에서 단백질이 0.
- 크로마토그래피 법을 이용하였다. 컬럼에 20 mM trizma-base (pH 9.0) 이동상으로 희석한 누에 체액을 주입하고 1 M의 NaCl이 첨가된 이동상을 이용하여 선형 농도구배 크로마토그래피를 수행하였다. 얻어진 단백질 분획들을 SDS-PAGE 및 Western blot을 통해 분석하여 0.
이론/모형
- 누에체액 성분 중에 존재하는 30K 단백질의 정제에 있어서 보다 간단하면서도 대량 정제로의 scale-up이 용이한정제 과정을 확립하기 위하여 Q-Sepharose FF를 이용한 이온교환 크로마토그래피 법을 이용하였다. 컬럼에 20 mM trizma-base (pH 9.
- 분획된 단백질에 30K 단백질의 존재 유무를 확인하기 위하여 Western blot 을 수행하였다. 분획된 단백질은 SDS-PAGE 를 통해 분리하였으며, PVDF membrane (Invitrogen, USA)으로 단백질을 이동시켰다.
- 세포 수 확인을 위해서는 MTT assay를 수행하였다. 3-4, 5- dimethylthiazol-2yl-2, 5-diphenyltetrazoliuin bromide (MTT, Sigma)를 PBS에 2 mg/ml이 되도록 녹인 후 배지와 1 : 4 의 비율로 희석하여 사용하였으며, MTT 시약을 처리한 뒤 37 ℃ 에서 4시간 동안 반응시켰다.
- 피크가 검출될 때 용출액을 40 ml 씩 분획하였다. 얻어진 단백질 용액은 vivaflow 50 system (10, 000 MWCO RC, Sartorius, Germany)을 이용한 투석법을 이용하여 PBS로 용매를 치환함과 동시에 용액을 농축하였다.
성능/효과
- 04 mg/ml (누에체액 1% 사용시의 함유량) 첨가하였을 때와 비슷한 세포 증식 결과를 얻었다. 0.12 mg/ml (누에체액 3% 사용시의 함유량) 첨가한 경우에는 FBS가상대적으로 적게 들어가 0.04 mg/ml과 0.4 mg/ml 첨가된 경우 뿐만 아니라 단백질이 첨가되지 않은 경우보다 낮은 세포 성장을 보였다. FBS가 사용되지 않은 경우에는 누에 체액 원액을 사용했을 때와 마찬가지로 거의 세포 증식이 이루어지지 않았다.
- 확인하였다. Fig. 1에 나타낸 것과 같이 누에체액이 FBS가 첨가된 배지에 1%로 들어간 경우 누에체액이 첨가되지 않은 경우보다 모든 세포 종류에서 세포 증식이 더욱 뛰어났음을 확인할 수 있었다. 반면에 3% 농도로 첨가된 경우에는 연골세포의 경우 누에체액이 1% 첨가된 경우와 유사한 증식률을 보였으나, 골막 유래 세포의 경우에서는 누에체액이 첨가되지 않은 경우와 유사하게, MRC-5 세포주에서는 누에체액이 사용되지 않았을 때 보다 현저하게 세포 생장률이 감소하는 것을 보였다.
- 그러나 누에체액 원액이 10% 첨가되었을 경우 첨가되지 않았을 때보다 낮은 세포 생장을 보인 것과 달리, 정제된 단백질을 0.4 mg/ml (누에체액 원액 10% 사용시 30K 단백질 함유량) 첨가하였을 때 실험에 사용된 모든 세포주에서 첨가하지 않은 경우보다 높은 세포 증식률을 보였을 뿐만 아니라 0.04 mg/ml (누에체액 1% 사용시의 함유량) 첨가하였을 때와 비슷한 세포 증식 결과를 얻었다. 0.
- 5에 정리한 것과 같다. 누에체액 1% 사용시의 결과와 마찬가지로 FBS가 들어 있는 배지에서 단백질이 0.04 mg/ml 농도로 첨가되었을 때 첨가되지 않은 경우보다 실험에 사용된 세 가지 세포주 모두 세포 증식에 효과적이었다.
- 반면에 3% 농도로 첨가된 경우에는 연골세포의 경우 누에체액이 1% 첨가된 경우와 유사한 증식률을 보였으나, 골막 유래 세포의 경우에서는 누에체액이 첨가되지 않은 경우와 유사하게, MRC-5 세포주에서는 누에체액이 사용되지 않았을 때 보다 현저하게 세포 생장률이 감소하는 것을 보였다. 또한 10% 농도로 첨가된 경우에는 모든 세포주에서 누에체액이 첨가되지 않은 경우보다 낮은 세포 세포증식률을 보였다. FBS 가 사용되지 않은 경우에는 (SFM) 실험에 사용된 세포주 모두 세포 증식이 거의 이루어지지 않았다.
- 1에 나타낸 것과 같이 누에체액이 FBS가 첨가된 배지에 1%로 들어간 경우 누에체액이 첨가되지 않은 경우보다 모든 세포 종류에서 세포 증식이 더욱 뛰어났음을 확인할 수 있었다. 반면에 3% 농도로 첨가된 경우에는 연골세포의 경우 누에체액이 1% 첨가된 경우와 유사한 증식률을 보였으나, 골막 유래 세포의 경우에서는 누에체액이 첨가되지 않은 경우와 유사하게, MRC-5 세포주에서는 누에체액이 사용되지 않았을 때 보다 현저하게 세포 생장률이 감소하는 것을 보였다. 또한 10% 농도로 첨가된 경우에는 모든 세포주에서 누에체액이 첨가되지 않은 경우보다 낮은 세포 세포증식률을 보였다.
- 0) 이동상으로 희석한 누에 체액을 주입하고 1 M의 NaCl이 첨가된 이동상을 이용하여 선형 농도구배 크로마토그래피를 수행하였다. 얻어진 단백질 분획들을 SDS-PAGE 및 Western blot을 통해 분석하여 0.16 M NaCl 의 용출조건에서 얻어진 단백질에 30K 단백질이 존재함을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 토대로 단계별 농도구배 크로마토그래피를 실시하였고(Fig.
- 16 M NaCl 용출 조건에서 쉽게 얻을 수 있었다. 얻어진 단백질을 인간유래 정상 세포에 처리하여 세포 증식 향상이 확인되었고, 이는 30K 단백질이 인간을 위한 세포치료제에 이용되는 세포의 증식을 위한 첨가물로 사용될 수 있음으로써 의료 분야에의 적용 가능성을 확인하였다. 또한 본 연구을 통해 확립된 30K 단백질의 간단한 정제 공정은 향후 대량 생산 공정으로 scale-up이 용이하게 이루어질 것으로 기대된다.
- 16 M NaCl 의 용출조건에서 얻어진 단백질에 30K 단백질이 존재함을 확인할 수 있었다. 위의 결과를 토대로 단계별 농도구배 크로마토그래피를 실시하였고(Fig. 2), 얻어진 단백질 분획들 또한 SDS-PAGE 및 Western blot을 통해 분석하였으며 (Fig. 3), F4와 F5 분획에 30K 단백질이 포함되어 있는 것을 확인하였다. 세포 생장에 대한 효과를 확인하기 위한 실험에 사용하기 위하여 분획의 용매를 PBS로 치환, 농축하였다(Fig.
후속연구
- 얻어진 단백질을 인간유래 정상 세포에 처리하여 세포 증식 향상이 확인되었고, 이는 30K 단백질이 인간을 위한 세포치료제에 이용되는 세포의 증식을 위한 첨가물로 사용될 수 있음으로써 의료 분야에의 적용 가능성을 확인하였다. 또한 본 연구을 통해 확립된 30K 단백질의 간단한 정제 공정은 향후 대량 생산 공정으로 scale-up이 용이하게 이루어질 것으로 기대된다. 이 결과들은 동물세포를 생산 숙주로 사용할 때 생산 물질 자체의 생산량 증대에도 효과적으로 이용될 수 있으며 세포치료제를 위한 세포의 증식에도 효과를 보일 수 있으므로 세포배양을 이용한 생산 공정 전반에 큰 영향을 미칠 수 있을 것이다.
- 또한 본 연구을 통해 확립된 30K 단백질의 간단한 정제 공정은 향후 대량 생산 공정으로 scale-up이 용이하게 이루어질 것으로 기대된다. 이 결과들은 동물세포를 생산 숙주로 사용할 때 생산 물질 자체의 생산량 증대에도 효과적으로 이용될 수 있으며 세포치료제를 위한 세포의 증식에도 효과를 보일 수 있으므로 세포배양을 이용한 생산 공정 전반에 큰 영향을 미칠 수 있을 것이다.
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