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문제 정의
- 따라서 본 연구는 C/N비가 비교적 낮은 부산의 S하수처리장의 슬러지로부터 탈질 효율이 높은 균주를 선별한 후, 그 중 호기성인 영역에서도 탈질을 수행할 수 있는 균을 분리하여 균을 동정하고 호기적인 조건에서의 탈질 특성을 살펴보고 자 하였다. 아울러 기존의 잘 알려져서 연구되고 있는 호기성탈질균 및 전통적인 무산소 탈질을 수행하는 대조균과의 탈질능을 비교함으로써 본 연구에서 분리된 탈질균의 호기성 상태에서의 질산염 환원능을 평가해보고자 하였다.
- 하였다. 아울러 기존의 잘 알려져서 연구되고 있는 호기성탈질균 및 전통적인 무산소 탈질을 수행하는 대조균과의 탈질능을 비교함으로써 본 연구에서 분리된 탈질균의 호기성 상태에서의 질산염 환원능을 평가해보고자 하였다.
제안 방법
- Escherichia c。"의 균주와 그 생육 및 탈질 특성을 비교하였다.가스형성정도 및 무기 질소 화합물들의 동태를 살펴볼 때 본 연구 중에 사용된 균주 중호기적인 탈질능을 속도면까지 통합하여 볼 때 가장 우수한 탈질균은 P.
- 3시간의 유도기를 거친 후 배양시간에 따라 시료를 채취하여 배양액 내 무기질소 성분의 변화를 통해 그 탈질능을 살펴보았으며, 그 결과는 Fig. 3과 같다. 암모늄염과 질산염이 각각 단독으로 배지 내에 있을 때와 암모늄과 질산염이 혼합되었을 때 균의 생육 변화를 살펴본 결과, 본 실험 균주의 경우 SL「배지(Sistrom 최소 배지에서 암모늄염을 제거한 것에 5% LB를 첨가한 배지)에 질산염을 첨가한 배지에서 균의 생장이 다소 늦게 시작되었고 암모늄염과 질산염 모두 있는 반응조에서는 초기에는 빠른 성장 속도였으나 시간이 지날수록 탈질과 함께 성장이둔화되었다.
- 아질산성 질소, 질산성 질소 및 암모니아성질소는 BANS+LUBBE사의 수질이온분석기를 사용하였으며, 총질소는 수질오염 공정시험 방법의 흡광광도법을 이용하였다. Nitric oxide의 측정은 GC (Gas Chromatography, Varian 3800)를 사용하였으며, ECD 검출기에 Polarpack Q(80/100)으로 충진된 Column을 사용하였다.
- 균주간의 성장 정도에 따른 nitrate의 경쟁적 전자수용체인 산소에의 영향을 고려하여 호기 상태를 충족시키기 위한 실험으로 200 ml 용량의 serum 용병에 시료 100 ml를 넣은 후, 공기 발생기를 통해 무균적으로 공기를 주입하면서 30℃ 수욕조를 이용하여 실험을 실시하였으며, 6시간 단위의 시간 간격으로 시료 분석을 하였다. 이때 사용한 배지는 SL broth에 질산염을 첨가(0.
- 대조 균주마다 성장 속도 및 산소 이용도 차를 고려하여 본 실험에서 사용된 분리균주에서의 탈질능실험 때와는 달리 산소의 고갈을 대비하여 반응 초부터 공기 발생기를 통해 인위적으로 공기를 불어넣어 주면서 실험을 실시하였다. 반응기는 200 ml의 serum병을 이용하였으며, 100 ml의 배지를 채우고 여기에 흡광도 0.
- 실험을 실시하였다. 반응기는 200 ml의 serum병을 이용하였으며, 100 ml의 배지를 채우고 여기에 흡광도 0.05 수준으로 전 배양한 균을 접종한 후 30℃, 수욕조에서 공기를 주입하면서 탈질능 실험을 실시하였다.
- 배양액 내의 질산성 질소, 아질산성 질소, 암모니아성 질소, 총질소 정량은 분리된 각각의 균주를 Table 3의 배지로 배양 후 원심분리하여 균체를 제거한 상등액을 구경 0.22 四의 유리섬유지로 여과한 액을 시료로 하여 분석하였다. 아질산성 질소, 질산성 질소 및 암모니아성질소는 BANS+LUBBE사의 수질이온분석기를 사용하였으며, 총질소는 수질오염 공정시험 방법의 흡광광도법을 이용하였다.
- 분리균의 배양 중 나온 가스 분석은 운반기체로서 N2를 사용한 GC를 이용하였다. 다양한 질소태의 가스가 탈질과정 중 발생할 것으로 예상되나 GC 운반기체가 N2 gas이며 아직 국내에서는 질소 방사선동위원소를 사용한 실험 분석상의 애로가 있어 정량분석을 흐}지 못했다.
- 분리균주의 형태적, 생리적 및 생화학적인 특성을 조사하였으며, 생화학적 특성의 조사를 위해서는 API 32NE kit를 사용하여 동정하였다. 분자생물학적 동정을 위해서는 실험 균주의 DNA를 추출하여 16S rRNA의 유전자 중에 변이가 많다고 알려진 V3 부위를 암호화하고 있는 유전자 범위를 PCR로 증폭한 후염기서열분석을 하였으며 二〔 결과를 NCBI (National Center, for Biotechnology Information, www.
- 분리된 균주를 30℃ 수욕조 내에서 산소발생기를 통해 공기를 주입하면서 호기적 배양하여, 가스 발생 정도와 질산성 질소 및 총질소 제거능의 비교를 통하여 탈질능이 우수한 균주를 선정하고, 이를 본 실험에 사용하였다.
- 분자생물학적 동정을 위해서는 실험 균주의 DNA를 추출하여 16S rRNA의 유전자 중에 변이가 많다고 알려진 V3 부위를 암호화하고 있는 유전자 범위를 PCR로 증폭한 후염기서열분석을 하였으며 二〔 결과를 NCBI (National Center, for Biotechnology Information, www. ncbi.nlm.nih.gov)의 Blast search를 통해서 결과를 도출하였다. 이때 사용된 primer들은 Bioneer사에 주문제작하여 사용하였다.
- 설정하여 실험을 하였다(Table 3). 실험은 1 L 삼각플라스크에 150 ml의 SL 배지에 0.5 g/L의 sodium nitrate를 첨가한 배지에 전 배양하여 키운 실험 균주를 흡광도(600nm)로 0.05가 되도록 주입하여 실험을 실시하였으며, 각 조의 반응조는 2개가 한 조를 이루어 실험하였다. 배지의 반응 초기 pH는 모두 7.
- 탈질의 수행에 있어 반드시 무산소 조건을 요구하는 전통적인 탈질균이 아닌 호기성상태에서도 탈질을 수행할 수 있는 호기성 탈질균의 분리를 S 하수처리장의 반송슬러지를 시료로 하여 분리하였다. 분리된 호기성 탈질균의 형태학적.
대상 데이터
- 기본적으로 탈질의 특성실험에 사용한 배지는 Sistrom's Minimal Medium A (Table 2)® 에 5% Luria broth를 첨가한 SL broth를 사용하되, 암모니아와 질산성 질소의 조합에 따른 서로 다른 4종류의 배지를 설정하여 실험을 하였다(Table 3). 실험은 1 L 삼각플라스크에 150 ml의 SL 배지에 0.
- 대조균주로는 기존에 잘 알려져서 연구가 진행되고 있는 호기성 탈질균 Pseudomonas stutzeri9^와 Pseudomonas putida를 KCTC (Korea Culture Type Collection) 로부터 분양을 받아 사용하였으며, Escherichia coli 또한 탈질능 실험의 대조균주로 이용하였다. 균주간의 성장 정도에 따른 nitrate의 경쟁적 전자수용체인 산소에의 영향을 고려하여 호기 상태를 충족시키기 위한 실험으로 200 ml 용량의 serum 용병에 시료 100 ml를 넣은 후, 공기 발생기를 통해 무균적으로 공기를 주입하면서 30℃ 수욕조를 이용하여 실험을 실시하였으며, 6시간 단위의 시간 간격으로 시료 분석을 하였다.
- 탈질능이 우수한 탈질세균을 분리하기 위해서 S 하수처리장으로부터 반송슬러지를 채취하여 분리용 시료로 이용하였다. 채취한 슬러지 1 g을 50 ml의 인산염완충액 (pH 7.
- 혐기적인 조건에서 탈질 효능을 보이는 49개의 분리 균주 중호기성인 상태에서도 탈질 활성을 보이는 16개의 균주를 분리하였으며 그 가운데 가스형성능, 배지색깔의 변화를 육안으로 관찰하고 시료의 총질소 제거율이 우수한 DN-9을 본 연구의 호기 성 탈질용 실험 균주로 선정하였다(Table 4).
이론/모형
- 22 四의 유리섬유지로 여과한 액을 시료로 하여 분석하였다. 아질산성 질소, 질산성 질소 및 암모니아성질소는 BANS+LUBBE사의 수질이온분석기를 사용하였으며, 총질소는 수질오염 공정시험 방법의 흡광광도법을 이용하였다. Nitric oxide의 측정은 GC (Gas Chromatography, Varian 3800)를 사용하였으며, ECD 검출기에 Polarpack Q(80/100)으로 충진된 Column을 사용하였다.
성능/효과
- stutzeri이었고, 본 실험에서 분리된 균주인 Pseudomonas sp. DN-9도 P. stut~ zeri에 견줄 만큼 비교적 우수한 호기성 탈질을 수행함을 확인하였다.
- stutzeri와 견줄만한 좋은 호기성 탈질균임을 알 수 있 었다. Escherichia coli 와 비교해본다면 Pseudomonas putida도 호기적인 조건에서 nitrate reductase의 활성이 약하게나마 존재할 가능성도 있었다. 하지만 Escherichia co〃의 경우 균체의 증가에 따라 예상되는 충분한 호기가 이루어지지 못하는 상황에서의 무산소적 탈질 외에는 호기적인 조건에서는 nitrate reductase의 활성이 거의 없었다.
- 또한, 16S rDNA의 염기서열 자료를 가지고 NCBI 의 BLAST search 한 결과, 16S rRNA 염기 서열상에 상동성이 95% 이상인 2종류의 균주가 검색되어 나왔는데 AY965247의 Pseudomonas sp. WT OTU2와 AY472116의 Pseudomonas fluorescens으로 96.36%의 상동성을 나타내었다(request ID : 1162226723-5092-175213678513 BLASTQ1).
- 그러나 암모니아와 질산염을 함께 준 배지에서도 단독 염만을 준 배지와 비슷한 수준의 흡광도까지만 성장하는 것으로 보아 암모늄염은 개체의 성장에 이용이 되고 추가로 첨가한 질산염은 환원이 탈질의 방향으로 진행되었음을 알 수 있었고, 이것은 일련의 탈질 반응의 중간산물 중 하나인 N20 의 검출로써 재확인 되었다.
- 암모늄염과 질산염이 각각 단독으로 배지 내에 있을 때와 암모늄과 질산염이 혼합되었을 때 균의 생육 변화를 살펴본 결과, 본 실험 균주의 경우 SL「배지(Sistrom 최소 배지에서 암모늄염을 제거한 것에 5% LB를 첨가한 배지)에 질산염을 첨가한 배지에서 균의 생장이 다소 늦게 시작되었고 암모늄염과 질산염 모두 있는 반응조에서는 초기에는 빠른 성장 속도였으나 시간이 지날수록 탈질과 함께 성장이둔화되었다. 그러나 질소원이 타 반응조에 비해 절대적으로 부족할 것 같은 SL「배지에서의 반응을 제외한 나머지 3종류의 배지(SL, SL+N0.3, SL「+N03)에서는 모두 균의 성장이 접종 18시간 정도에서 최대흡광도를 보여주었다. SL 배지에서의 균의 생육은 흡광도 1.
- 하지만 Escherichia co〃의 경우 균체의 증가에 따라 예상되는 충분한 호기가 이루어지지 못하는 상황에서의 무산소적 탈질 외에는 호기적인 조건에서는 nitrate reductase의 활성이 거의 없었다. 그리고 P. putida의 경우 실험에 사용된 SL 배지에서 이중적인 성장 형태를 보여주어 완전한 비교는 힘들지만, 호기성에서 배지 내 단위 탄소 원당 질소원 제거능이 크지 않음을 알 수 있었다. 이것을 통해 볼 때 비록 탈질균이라 하더라도 동일한 형태의 탈질보다는 공존하는 탄소원과 다른 영양분의 종류와 농도에 따라 탈질 특성이 달라질 수 있음을 알 수 있었다.
- 분리균주의 탈질능을 암모니아 및 질산염을 제한하면서 실험한 결과에 의하면 암모니아염이나 질산염만이 있는 배지에서는 원활한 질산화와 탈질이 이어지는 것이 아니라 개체성장에 주로 질소원이 사용되었다. 그러나 암모니아와 질산염을 함께 준 배지에서도 단독 염만을 준 배지와 비슷한 수준의 흡광도까지만 성장하는 것으로 보아 암모늄염은 개체의 성장에 이용이 되고 추가로 첨가한 질산염은 환원이 탈질의 방향으로 진행되었음을 알 수 있었고, 이것은 일련의 탈질 반응의 중간산물 중 하나인 N20 의 검출로써 재확인 되었다.
- 3과 같다. 암모늄염과 질산염이 각각 단독으로 배지 내에 있을 때와 암모늄과 질산염이 혼합되었을 때 균의 생육 변화를 살펴본 결과, 본 실험 균주의 경우 SL「배지(Sistrom 최소 배지에서 암모늄염을 제거한 것에 5% LB를 첨가한 배지)에 질산염을 첨가한 배지에서 균의 생장이 다소 늦게 시작되었고 암모늄염과 질산염 모두 있는 반응조에서는 초기에는 빠른 성장 속도였으나 시간이 지날수록 탈질과 함께 성장이둔화되었다. 그러나 질소원이 타 반응조에 비해 절대적으로 부족할 것 같은 SL「배지에서의 반응을 제외한 나머지 3종류의 배지(SL, SL+N0.
- 3의 (c), (d) 모두 반응 9시간쯤에 N03 가 반응 초보다 더 높은 농도를 보였다. 암모늄염만 있는 배지 (SL배지)와 암모늄염에 질산염이 부가된 배지 (SL+NCh배지)에서의 흡광도로 본균의 생장에 있어 동일한 배양조건 하에서 비슷한 최고치의 흡광 수치를 보임으로써, 그리고 배양액에도 가스상의 다량의 거품을 보이는 점 등을 통해 배지 내 존재하던 질산염은 nitrate ammonification에 의해 생체구성성분으로 소비된 것이 아니라, 명백하게 탈질을 수행하였음을 알 수 있었다. 한편 SL broth에서 암모늄 성분은 제거한 SL- broth에 질산염을 첨가한 배지 (SL「+NO3)에서는 5%로 첨가한 LB배지 외에는 암모늄이 없는데, SL「broth에서의 생육보다도 훨씬 높은 생육흡광도를 보이는 것은 질산염의 환원이 아마 nitrate ammonification방향으로 진행된 것이 아닐까 유추된다.
- putida의 경우 실험에 사용된 SL 배지에서 이중적인 성장 형태를 보여주어 완전한 비교는 힘들지만, 호기성에서 배지 내 단위 탄소 원당 질소원 제거능이 크지 않음을 알 수 있었다. 이것을 통해 볼 때 비록 탈질균이라 하더라도 동일한 형태의 탈질보다는 공존하는 탄소원과 다른 영양분의 종류와 농도에 따라 탈질 특성이 달라질 수 있음을 알 수 있었다.
- 이에 의하면 본 실험에 사용된 균주 모두 흡광도 0.05로 출발하여 약 20시간을 전후로 최대 증식에 도달하였다(Fig. 5). 또한, 동일한 농도의 암모니아태질소와 질산태 농도를 가지는 배지에서 본 실험에 사용된 균주인 Pseudomonas putida와 Escherichia coli는 아질산태질소에서 아질산가스 및 질산화가스, 질소로의 일련의 탈질 반응에 의한 nitrate의 소실보다는, 화학적 산화 혹은 흡광도 상승과 함께 cell량이 증가됨에 따라 이어지는 산소와의 경쟁에서 일부 사용되어지는 것이 아닌가 여겨진다.
- DN-9의 경우 일정한 양의 균체량이 확보된 후 급속한 질산태질소의 소실이 일어나는 것을 알 수 있는데 중간대사물로 nitrite가 보여지는 것으로 미루어보다 nitrate의 환원이 호기적인 탈질의 결과로 판단된다. 탈질 속도면에서는 P. stutzeri가 흡광도 1에서 2사이의 급속한 균체생장과 함께 질산염 상태의 질소 역시 왕성하게 탈질시킴을 알 수 있었으며, 본 실험의 분리균 주도 실험에 사용된 배지에서의 성장 속도가 늦은 탓인지는 명확하지 않으나 동일한 흡광도에 도달했을 때 P. stutzeri와 견줄만한 좋은 호기성 탈질균임을 알 수 있 었다. Escherichia coli 와 비교해본다면 Pseudomonas putida도 호기적인 조건에서 nitrate reductase의 활성이 약하게나마 존재할 가능성도 있었다.
후속연구
- 이것은 질소와 인 같은 영양염 제거에 요구되는 추가적인 반응 조 부가에 따른 부지 확보 면의 해결 및 탈질에 요구되는 탄소원의 투입 등에 따른 추가 부대비용의 불필요에 따라 경제적인 생물학적 탈질공정의 개발에 좋은 착안점이기도, 하다. 그러나 현재까지의 연구에 의하면 탈질의 최종 산물인 질소가스로의 전환을 충분히 해내는 호기성 탈질은 적어, 탈질과정에서 유발되는 아질산염, 질산화가스 등의 유독성을 고려할 때 보다 세심한 연구 및 이를 보완 가능한 새로운 공정 또한 개발되어야 할 것이며 최종 산물이 용존성 물질이 아니라 주로 가스상의 물질이므로 슬러지의 침강성과 관련한 연구 또한 진행되어야 할 것으로 보인다.
- 아무튼, 본 연구와 같은 호기성 탈질균에 대한 연구는 기존의 유기물 제거를 목적으로 하는 활성슬러지공법의 호기 반응조를 약간 개조함으로써 탈질의 효과까지 유도할 수 있는 가능성을 보여준다는 점에서 주목할 만하다 할 것이다. 이것은 질소와 인 같은 영양염 제거에 요구되는 추가적인 반응 조 부가에 따른 부지 확보 면의 해결 및 탈질에 요구되는 탄소원의 투입 등에 따른 추가 부대비용의 불필요에 따라 경제적인 생물학적 탈질공정의 개발에 좋은 착안점이기도, 하다.
- 4). 하지만 본연구에서는 탈질의 극히 일부분의 영역에 대해서 실험한 것으로서 중간대사물을 포 함한 탈질의 최종산물인 질소가스로의 전환에 대한 실험은 앞으로 더 진행되어야 할 것이다.
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