생물학적 질소고정과정의 연구는 학문적으로나 산업적으로 매우 중요한 과정이다. 본 총설에서는 공업적 질소고정과 비교되는 생물학적 질소고정의 특징을 간단히 살펴보고, Azotobacter vinelandii에서 연구되고 있는 생물학적 질소고정효소의 특징을 다룬다. 생물학적 질소고정과정은 다양한 생명체에서 일어나며, 최근에는 미생물인 A. vinelandii에 그 작용 메커니즘에 관한 연구가 집중되어 있다. 공기중의 질소를 암모니아로 변환시키는 질소고정은 화학적으로 환원 반응에 해당하므로 전자의 공급이 필요하다. 생물학적 질소고정을 담당하는 질소고정효소는 촉매반응을 위해 생물학적인 환원력을 사용하여 전자를 공급받아, Fe 단백질의 $Fe_4S_4$ cluster와 MoFe 단백질의 P-cluster를 거쳐 질소 환원 반응이 일어나는 FeMo-cofactor로 전달한다. 이러한 전자전달의 과정과 수소이온의 전달 과정은 질소고정효소의 반응 메커니즘 이해에 매우 중요한 과정이며, FeMo-cofactor와 질소분자의 상호작용은 생물학적 질소고정 메커니즘의 중심에 있다. 질소고정 작용 메커니즘의 연구에는 X-선 단백질 결정학, EPR과 $M{\ddot{u}}ssbauer$ 등의 다양한 분광학적 방법과, 효소의 기질과 저해제의 상호작용을 연구하고 mutant와 비교하는 생화학적 접근방법, 그리고 FeMo-cofactor의 모델 화합물을 합성하여 연구하는 화학적 방법 등이 적용되었다. 이들 분야의 최근 연구결과를 소개하며, 마지막으로, 다양한 연구 결과에 바탕하여 새로운 질소고정효소의 작용 기작이 제안하였다.
생물학적 질소고정과정의 연구는 학문적으로나 산업적으로 매우 중요한 과정이다. 본 총설에서는 공업적 질소고정과 비교되는 생물학적 질소고정의 특징을 간단히 살펴보고, Azotobacter vinelandii에서 연구되고 있는 생물학적 질소고정효소의 특징을 다룬다. 생물학적 질소고정과정은 다양한 생명체에서 일어나며, 최근에는 미생물인 A. vinelandii에 그 작용 메커니즘에 관한 연구가 집중되어 있다. 공기중의 질소를 암모니아로 변환시키는 질소고정은 화학적으로 환원 반응에 해당하므로 전자의 공급이 필요하다. 생물학적 질소고정을 담당하는 질소고정효소는 촉매반응을 위해 생물학적인 환원력을 사용하여 전자를 공급받아, Fe 단백질의 $Fe_4S_4$ cluster와 MoFe 단백질의 P-cluster를 거쳐 질소 환원 반응이 일어나는 FeMo-cofactor로 전달한다. 이러한 전자전달의 과정과 수소이온의 전달 과정은 질소고정효소의 반응 메커니즘 이해에 매우 중요한 과정이며, FeMo-cofactor와 질소분자의 상호작용은 생물학적 질소고정 메커니즘의 중심에 있다. 질소고정 작용 메커니즘의 연구에는 X-선 단백질 결정학, EPR과 $M{\ddot{u}}ssbauer$ 등의 다양한 분광학적 방법과, 효소의 기질과 저해제의 상호작용을 연구하고 mutant와 비교하는 생화학적 접근방법, 그리고 FeMo-cofactor의 모델 화합물을 합성하여 연구하는 화학적 방법 등이 적용되었다. 이들 분야의 최근 연구결과를 소개하며, 마지막으로, 다양한 연구 결과에 바탕하여 새로운 질소고정효소의 작용 기작이 제안하였다.
Biological nitrogen fixation is an important process for academic and industrial aspects. This review will briefly compare industrial and biological nitrogen fixation and cover the characteristics of biological nitrogen fixation studied in Azotobacter vinelandii. Various organisms can carry out biol...
Biological nitrogen fixation is an important process for academic and industrial aspects. This review will briefly compare industrial and biological nitrogen fixation and cover the characteristics of biological nitrogen fixation studied in Azotobacter vinelandii. Various organisms can carry out biological nitrogen fixation and recently the researches on the reaction mechanism were concentrated on the free-living microorganism, A. vinelandii. Nitrogen fixation, which transforms atmospheric $N_2$ into ammonia, is chemically a reduction reaction requiring electron donation. Nitrogenase, the biological nitrgen fixer, accepts electrons from biological electron donors, and transfers them to the active site, FeMo-cofactor, through $Fe_4S_4$ cluster in Fe protein and P-cluster in MoFe protein. The electron transport and the proton transport are very important processes in the nitrogenase catalysis to understand its reaction mechanism, and the interactions between FeMo-cofactor and nitrogen molecule are at the center of biological nitrogen fixation mechanism. Spectroscopic studies including protein X-ray crystallography, EPR and $M{\ddot{o}}ssbauer$, biochemical approaches including substrate and inhibitor interactions as well as site-directed mutation study, and chemical approach to synthesize the FeMo-cofactor model compounds were used for biological nitrogen fixation study. Recent research results from these area were presented, and finally, a new nitrogenase reaction mechanism will be proposed based on the various research results.
Biological nitrogen fixation is an important process for academic and industrial aspects. This review will briefly compare industrial and biological nitrogen fixation and cover the characteristics of biological nitrogen fixation studied in Azotobacter vinelandii. Various organisms can carry out biological nitrogen fixation and recently the researches on the reaction mechanism were concentrated on the free-living microorganism, A. vinelandii. Nitrogen fixation, which transforms atmospheric $N_2$ into ammonia, is chemically a reduction reaction requiring electron donation. Nitrogenase, the biological nitrgen fixer, accepts electrons from biological electron donors, and transfers them to the active site, FeMo-cofactor, through $Fe_4S_4$ cluster in Fe protein and P-cluster in MoFe protein. The electron transport and the proton transport are very important processes in the nitrogenase catalysis to understand its reaction mechanism, and the interactions between FeMo-cofactor and nitrogen molecule are at the center of biological nitrogen fixation mechanism. Spectroscopic studies including protein X-ray crystallography, EPR and $M{\ddot{o}}ssbauer$, biochemical approaches including substrate and inhibitor interactions as well as site-directed mutation study, and chemical approach to synthesize the FeMo-cofactor model compounds were used for biological nitrogen fixation study. Recent research results from these area were presented, and finally, a new nitrogenase reaction mechanism will be proposed based on the various research results.
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문제 정의
중요한 과정이다. 본 총설에서는 공업적 질소고정과 비교되는 생물학적 질소고정의 특징을 간단히 살펴보고, Azotobacter Vedii에서 연구되고 있는 생물학적 질소고정효소의 특징을 다룬다. 생물학적 질소고정과정은 다양한 생명체에서 일어나며, 최근에는 미생물인 A.
질소고정효소에 대해서는 생화학, 화학, 유전학 등의 다양한 분야에서 많은 총설이 현재까지 보고되어있다. 본 총설에서는 질소고정효소의 생화학적 특성과 그 메카니즘을 중심으로 최근의 동향을 다룰 것이다.
그러므로, 질소고정효소 내의 금속 클러스터를 연구하기 위해서 EPR, 57Fe Mossbauer spectroscopy, Mo와 Fe X- ray absorption spectroscopy, 95Mo, 33S, 57Fe, 'H-ENDOR, MCD, IR 등의 다양한 분광학적 방법이 사용되었다. 이런 분광학적 방법은 FeMo-ccctor의 Mo과 Fe 원자 주변의 환경과 전자구조에 대한 자료를 제공하였다. Dithionite 존재 하에서 분리된 질소고정효소는 “as-isolated” 형태로 지칭하고, MoFe 단백질은 특징적인 전자 스핀 S = 3/2의 EPR 신호를 보인다.
가설 설정
1. Isation of MoFe protein and Fe protein by ion exchange (Q-sepharose) column chromatography, (a) The proteins are black due to the metallo-cofactor which nitrogenase contains. The MoFe protein is eluted first, as shown in the picutre, and then Fe protein is eluted at higher concentation of NaCl.
10(b)는 질소 고정작용에서의 FeMo-cofiictor와n 의 상호작용과 환원을 제안한 것이다. 이 제안에서는 FeMo-cofactor 내부의 미지의 원소를 질소로 가정하였다. 질소고정효소를 환원상태에서 분리하면, resting state로 존재하며(구조 1), a96-Arge (R)-homocitrate 에, al95-Hise FeMo-cofactor의 μ-S에 각각 수소 결합을 하고 있다.
제안 방법
질소고정 효소는 금속 효소로 여러 개의 금속 클러스터가 촉매적 작용에 중요한 역할을 함을 보았다. 그러므로, 질소고정효소 내의 금속 클러스터를 연구하기 위해서 EPR, 57Fe Mossbauer spectroscopy, Mo와 Fe X- ray absorption spectroscopy, 95Mo, 33S, 57Fe, 'H-ENDOR, MCD, IR 등의 다양한 분광학적 방법이 사용되었다. 이런 분광학적 방법은 FeMo-ccctor의 Mo과 Fe 원자 주변의 환경과 전자구조에 대한 자료를 제공하였다.
질소고정 작용 메커니즘의 연구에는 X-선 단백질 결정학, EPR과 Milssbauer 등의 다양한 분광학적 방법과, 효소의 기질과 저해제의 상호작용을 연구하고 mutant와 비교하는 생화학적 접근 방법, 그리고 FeMo-co&tor의 모델 화합물을 합성하여 연구하는 화학적 방법 등이 적용되었다. 이들 분야의 최근 연구 결과를 소개하며, 마지막으로, 다양한 연구 결과에 바탕하여 새로운 질소고정효소의 작용 기작이 제안하였다.
이것은 질소고정효소의 활성자리인 FeMo-co&ctoi에서 H+ 환원 자리와 다른 기질의 환원자리가 다르다는 것을 시사한다. 질소고정 효소에 CO가 결합하게 되면, 특이한 EPR 신호를 나타내게 되는데, CO의 농도에 따라서, 다른 EPR 신호가 얻어진다H ENDOR 실험에서는 이 EPR 신호를 분석하여, CO가 FeMo- cofkctoi에 결합하는 방식을 제안하였다.92)
성능/효과
이 신호는 FeMo-co0ctoi에서 기인한 것으로, 단백질은 분리하지 않고, 세포를 직접 측정하여도 같은 신호가 관찰된다.69)FeMo- cofector 는 가역적으로 산화, 환원이 가능하며, 이때는 각각 S = 0와 S = 정수의 EPR 비활성종이 얻어진다. 또한, resting state의 MoFe-cofhctor를 "Fe Mossbauer 분광기로 즉정하면, 7 개의 철 이온이 모두 전하 비편재화되어 나타난다.
Sodium dithionite 대신에 titanium citrate를 환원제로 사용하면 Fe 단백질의 [Fe4S4]2+ cluster/FeSj1의 산화상태를 가지는 것이 관측되었는데, 이런 산화상태가 생물학적으로 의미 있는 것인지는 분명하지 않다 Fe 단백질의 [Fe4S4]5] 산화상태가 관심을 끄는 이유는 전자전달의 효율이 두배가 되어 질소고정효소의 에너지 효율이 두 배가 되기 때문이다. Fe 단백질은 MoFe 단백질로의 전자 전달의 역할을 수행할 뿐 아니라, FeMo-cofhctor의 생합성과 FeMo-cofhctor가 결합하지 않은 apo-MoFe 단백질의 활성화에 관여하는 것으로 알려졌다.
계산화학에 의하면, 이 원소는 질소나 산소일 가능성이 높으며, 그 중에서도질소 원자일 것으로 제안되었다. 또한, 이 원소가 질소 환원의 촉매 활동이 진행되어도 변함없이 FeMo-cofactor 내부에 존재함이 관찰되었다. 그러므로, FeMo-cofector 내부에 있는 원자가 무엇이던 질소환원작용에 관여하지는 않는 것으로 보인다.
이렇게, citrate가 결합된 FeMo-cofkctor를 apo-MoFe 단백질에 넣어주면, '새로운 MoFe 단백질은 역시 h를 생성하는 능력은 유지되나, 질소를 환원하는 능력이 없는 것이 보고되었다. 마지막으로, 일부 FeMo-coctor와 비공유 상호작용을 하는 주변 아미노산을 치환시킨 mutants는 극적인 기질 환원의 변화를 보임이 .여러 경우에 보고되었다.
이들은 각각 Mo-질소고정효소, V-질소고정 효소, 33)Fe-질소고정 효소로3638)불린다. 세 가지 질소고정 효소는 동일한 Fe 단백질을 가지고 있으며, MoFe 단백질의 금속 조효소의 구성성분이 다른 것으로 밝혀졌다. 따라서 MoFe 단백질, VFe 단백질, FeFe 단백질 세가지가 알려져 있다.
질소고정효소의 분광학적 연구. 질소고정 효소는 금속 효소로 여러 개의 금속 클러스터가 촉매적 작용에 중요한 역할을 함을 보았다. 그러므로, 질소고정효소 내의 금속 클러스터를 연구하기 위해서 EPR, 57Fe Mossbauer spectroscopy, Mo와 Fe X- ray absorption spectroscopy, 95Mo, 33S, 57Fe, 'H-ENDOR, MCD, IR 등의 다양한 분광학적 방법이 사용되었다.
의해서 밝혀졌다. 첫째, FeMo-cofector를 생합성화지 못하는 mutant는 apo-MoFe 단백질을 형성하는데, 이는 FeMo- cofhctor는 가지고 있지 않으나, P-cluster는 가지고 있다. 이런 apo-MoFe 단백질에 정상의 MoFe 단백질로부터 NMF(N- methylamide)를 사용하여 추출한 FeMo-cofactor를 더해주면 그 효소 활성이 회복되는 것으로 증명되었다 둘째, R.
후속연구
그 이유로는, 질소고정 조효소인 FeMococtor의 원자 수준의 3차원 구조의 규명, 밀도함수이론을 이용한 정교한 계산으로부터의 FeMo-cofiictor와 기질의 상호작용에 관한 연구, 여러 가지 중요한 mutants!- 이용한 MoFe 단백질의 생화학적 연구와 이들의 분광학적 연구 등이 최근에 중요한 결과들을 도출하고 있기 때문이다. 본문에서 생물학적 질소고정의 메커니즘을 제안하였지만, 이를 분명히 이해하기 위해서 앞으로 반드시 해결해야 할 과제는, 질소고정효소 조효소인 FeMo-cofector 와 n의 상호작용에 대한 원자수준에서의 직접적 관찰, FeMo- cofhctor의 합성과 이를 이용한 질소환원의 모델 연구, 그리고, 질소고정효소의 생물학적 합성과 이들의 조절 메카니즘의 이해둥이 될 것이다.
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The terminology of 'apo-MoFe protein' was used historically to designate FeMo-cofactor void MoFe protein, which formed from nifE, nifN, nifB or nifH mutant. Strictly speaking, these proteins contain P-cluster and 'apo' is misnomer. Besides, apo- MoFe proteins isolated from nifE, nifN, or nif B mutant were reported different from that of nifH mutant
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Although 1Mo4+, 1Fe3+, 6Fe3+ model was suggested by ENDOR spectroscopic study, Yoo, et al's result is recently more supported.
Yoo, S. J., Angove, H. C., Papaethymiou, V., Burgess, B. K. and Munck, E. (2000) Mossbauer study of the MoFe protein of nitrogenase from Azotobacter vinelandii using selective Fe- 57 enrichment of the M-centers. J. Am. Chem. Soc. 122, 4926-4936
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The distances are very short, considering hydrogen atoms are bonded to the amino acid residues
It is reported recently that the atom inside FeMo-cofactor may not be nitrogen atom. Yang, T.-C., Maeser, N. K., Laryukhin, M., Lee, H.-I., Dean, D. R., Seefeldt, L. C. and Hoffman, B. M. (2005) The interstitial atom of the nitrogenase FeMocofactor: ENDOR and ESEEM evidence that it is not a nitrogen. J. Am. Chem. Soc. ASAP ja0552489
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