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문제 정의
- 특히, 효모는 세균, 곰팡이에 비하여 배양관리가 용이하고, 빵효모인 경우는 안전성에서 phytate 분해효소원으로 사용하는 타 미생물보다 장점을 갖고 있어서 향후 이에 대한 연구가 폭 넓게 이루어질 것으로 생각된다. 본 연구는 전통 민속주의 술덧으로부터 phytase를 생성하는 Saccharomyces속 효모균주를 분리하였으며, 분리효모의 phytase 생성과 반응 특징 및 phytate 의 분해방법에 관한 연구결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 균주배양.CY 효모균주는 YM 배지에 30℃에서 6-8시간 동안 진탕배양한 종균 1 mJ를 포도당의 농도를 5%로 조정한 YM 배지 50成에 접종하고 30℃에서 48시간 동안 200rpm으로 진탕배양 하면서 phytase의 활성도를 조사하였다. 효모균주의 생육도 는 600nm에서의 흡광도로 나타내거나 또는 건조균체량(dry cell weight, DCW)으로 나타냈다.
- Phytate의 분석.Haug와 Lantzsch의 방법淄에 따라 시료 0.5 m/에 1 m/의 ferric 용액(0.2g ammonium iron(Ⅲ) sulfate , 12足0를 30% TCA lOOmZ로 용해한 후 증류수로 11로 맞춘 용액)을 첨가한다. 그 후 뚜껑을 덮고 끓는 수욕중에서 30분 동안 반응시킨 다음 얼음물로 15분 동안 냉각하여 원심분리 (12, 000 rpm, 15분)하였다.
- Phytase 활성의 측정.Phytasee 활성도는 Quan')과 Shimizu171 의 방법을 변형하여 분석하였으며, 세포외 phytase 활성 (extracellular phytase activity)과 세포 내 phytase 활성 (intracellular phytase activity)을 각각 측정하였다. 세포외 phytase 활성은 배양액의 상징액을 조효소액으로 사용하여 측정하였고, 세포 내 phytase 활성은 배양액을 원심분리하여 효모균체를 수확한 후 0.
- Phytate 분해능 확인방법.CY 효모균주의 phytate 분해능은 PSM 배지에서 생육하는 동안 형성되는 투명환으로 phytase 생성 균주임을 확인하였다.
- 효모균주의 생육도 는 600nm에서의 흡광도로 나타내거나 또는 건조균체량(dry cell weight, DCW)으로 나타냈다. 건조균체량의 측정은 배양액 1 n”를 0.8% NaCl 멸균용액으로 2-3회 세척한 후 membrane filter(0.20 μm)로 여과하여 microwave oven에서 2분간 건조 시켜 측정하였다.
- 3 mM이 되도록 하고, CY 균주를 접종한 후 3(FC에서 진탕배양하면서 성장하는 효모 세포에 의한 phytMe의 분해도를 측정하였다. 또 다른 phytate의 분해방법으로 배양된 CY 균체를 직접 분해반응액에 현탁 하여 phytate를 분해시키는 방법으로 0.2 M acetate buffer (pH 3.5)에 sodium phytate가 4.3 mM이 되도록하고 수확된 세척 효모균체를 완충액에 현탁시켜 30℃에서 반응시키면서 phytate의 분해도를 측정하였다.
- 2 mg//)은 membrane filtere. 별도로 제균한 후 혼합배지의 pH가 5.5가 되도록 제조하여 phytate 분해능 측정 배지로 사용하였다.
- 그 후 뚜껑을 덮고 끓는 수욕중에서 30분 동안 반응시킨 다음 얼음물로 15분 동안 냉각하여 원심분리 (12, 000 rpm, 15분)하였다. 상징액 1 m/에 1.5 m/의 bipyridine 용액(10 g의 22-bipyridine에 10 m/의 thioglycolic acid를 첨가하여 증류수로 1Z로 맞춘 용액) 1.5 m/와 반응시켜 519nm에서 흡광도를 측정하여 phytate를 분석하였다.
- Phytasee 활성도는 Quan')과 Shimizu171 의 방법을 변형하여 분석하였으며, 세포외 phytase 활성 (extracellular phytase activity)과 세포 내 phytase 활성 (intracellular phytase activity)을 각각 측정하였다. 세포외 phytase 활성은 배양액의 상징액을 조효소액으로 사용하여 측정하였고, 세포 내 phytase 활성은 배양액을 원심분리하여 효모균체를 수확한 후 0.8% NaCl 용액으로 2-3회 세척하고 0.2 M acetate 완충용액 (pH 3.5) 에서 효모세포의 phytase 활성을 측정하였다. 세포 내 phytase 활성은 단위 배양액이 함유하는 세포의 효소활성을 용량을 기준 (mU/mZ)으로 표현하거나, 건조균체량을 기준(mU/mg-DCW)으로 표현하였다.
- 최적반응 pH.완충용액에 현탁된 효모세포의 pH 영역별 phytase 활성도를 조사하였다. 세포 내 효소인 phytase의 최적 반응 pH는 3.
- 효모세포에 의한 phytate의 분해를 두 가지 방법으로 수행하여 비교하였다. 즉, phytate가 함유된 영양배지에서 성장하는 효모에 의한 phytate의분해와 배양효모를 수확한 후 완충용액에 현탁된 효모세포(whole cell)에 의한 phytate의 분해를 수행하였다. Fig.
- 3 mg phytate가 함유된 배지에 효모를 접종하여 48시간 동안 진탕배양한 결과 배양 후 36시간째 첨가된 phytate의 약 95%가 분해되었다. 한편, 호일한 농도의 phgte를 함유한 완충용액에 효모세포를 농도별应 첨가하여 현탁한 후 phytatee 분해를 측정하였다(Fig. 7). 반응용액 ImZ당 0.
- Phytate 분해방법.효모균주에 의한 phytate의 분해경향을 조사하기 위하여 YM 배지(5% 포도당 함유)에 sodium phytate (phytic acid dodecasodium salt)의 농도가 4.3 mM이 되도록 하고, CY 균주를 접종한 후 3(FC에서 진탕배양하면서 성장하는 효모 세포에 의한 phytMe의 분해도를 측정하였다. 또 다른 phytate의 분해방법으로 배양된 CY 균체를 직접 분해반응액에 현탁 하여 phytate를 분해시키는 방법으로 0.
- cerevisiae CY 균주에 의한 Phytate의 분해.효모세포에 의한 phytate의 분해를 두 가지 방법으로 수행하여 비교하였다. 즉, phytate가 함유된 영양배지에서 성장하는 효모에 의한 phytate의분해와 배양효모를 수확한 후 완충용액에 현탁된 효모세포(whole cell)에 의한 phytate의 분해를 수행하였다.
대상 데이터
- 실험균주.실험균주는 전통 민속주의 술덧에서 분리한 후, API 20C AUX 동정 Kit(Biomeriaux사, France)® 이용하여 Saccharomyces cerevisiae 로 동정하였으며, Saccharomyces cerevisiae CY 균주로 명명하여 본 연구에 사용하였다.
성능/효과
- 6에 성장하는 효모 세포에 의한 phytate의 경시적 분해율을 나타냈다. 5%의 포도당과 4.3 mg phytate가 함유된 배지에 효모를 접종하여 48시간 동안 진탕배양한 결과 배양 후 36시간째 첨가된 phytate의 약 95%가 분해되었다. 한편, 호일한 농도의 phgte를 함유한 완충용액에 효모세포를 농도별应 첨가하여 현탁한 후 phytatee 분해를 측정하였다(Fig.
- Phytate 분해능 확인방법.CY 효모균주의 phytate 분해능은 PSM 배지에서 생육하는 동안 형성되는 투명환으로 phytase 생성 균주임을 확인하였다. PSM 배지는 Lambrechts 등의 방법 山을 변형한 배지로 0.
- 8mg/mZ로 정치배양에 비하여 2 배의 균체수율을 보였으며, 세포외 phytase 활성과 세포 내 phytase 활성을 합한 총 phytase 활성도는 진탕배양인 경우가 1, 023 mU/mZ로 정치배양에서의 총 활성도인 594 mU/mZ에 비하여 높은 활성을 보였다(Table 1). 건조균체를 기준으로 나타낸 세포 내 phytase 활성은 생육기에 따라 달랐으며, 지수성장기 말기 무렵에서 173 mU/mg-DCW로 최대 활성을 보인 이후 배양 시간의 경과에 따라 점차적으로 감소하였다(Fig. 1). 이러한 세포 내 phytase 활성 감소는 Pichia 顷에서의 활성 감소 경향과 유사하였으며, 이러한 현상은 영양성분의 고갈이나 배양환경의 열화에 의한 세포의 노화현상에서 기인되는 것으로 생각되고 있다.
- 본 연구에 사용된 CY 균주의 경우 현탁 세포의 phytase 활성은 효소가 세포내에 존재하기 때문에 비교적 높은 온도에서 최적 반응온도를 보일 것으로 기대하였으나 기존에 보고된 효모 균주들의 최적반응 온도보다 닞은 37- 4SC로 나타났다. 또한, 20℃ 이하와 50℃ 이상의 온도에서는 상대적 효소활성이 20% 이하의 수준으로 감소되어 효모의 phytase에 관한 기존의 연구皿와 비교할 때 낮은 온도에서 최적 반응온도를 보였다. 이러한 낮은 최적반응 온도는 오히려 생균 상태의 효모를 식품이나 사료에 적용될 경우는 생체내 phytate 분해반응에는 긍정적 효과를 미칠 것으로 생각된다.
- 이러한 세포 내 phytase 활성 감소는 Pichia 顷에서의 활성 감소 경향과 유사하였으며, 이러한 현상은 영양성분의 고갈이나 배양환경의 열화에 의한 세포의 노화현상에서 기인되는 것으로 생각되고 있다. 또한, CY 균주에 의한 세포 내 phytase 활성은 Pichia anoniala의 연구에서 보고된 세포외 phytase 활성도인 68 mU/mg-DCW 보다 약 2.5배 높은 활성을 보였다.")
- YM 배지에 포도당의 농도를 달리하면서 CY 균주를 48시간 동안 배양한 후 phytase 생성도를 조사하여 Table 2에 나타냈다. 본 실험조건에서 효모 균체량은 포도당 농도가 5%인 경우가 6.8 mg/ m/로 제일 높은 생육을 보였으며, 그 이상의 농도에서는 생육이 억제되었다. 포도당의 전 농도범위에서 총 phytase의 활성은 782-1, 023 mU/m/의 범위를 보였으며, 포도당 농도가 5%인 경우 가장 높은 활성을 보였다.
- subtilis, ll} Enterobacter'<>} Pseudomonas fragrv) 등의 세균은 50-70℃, Aspergilluse-, Rhizopus속 등의 곰핑-이9에서는 40-701, 효모"")인 경우에도 균주에 따라서 다르나 대략 60-75。(2에서 최적반응 온도를 보여 미생물 기원의 phytase는 주로 고온 영역에서 최적반응 온도를 보이는 것으로 생각된다. 본 연구에 사용된 CY 균주의 경우 현탁 세포의 phytase 활성은 효소가 세포내에 존재하기 때문에 비교적 높은 온도에서 최적 반응온도를 보일 것으로 기대하였으나 기존에 보고된 효모 균주들의 최적반응 온도보다 닞은 37- 4SC로 나타났다. 또한, 20℃ 이하와 50℃ 이상의 온도에서는 상대적 효소활성이 20% 이하의 수준으로 감소되어 효모의 phytase에 관한 기존의 연구皿와 비교할 때 낮은 온도에서 최적 반응온도를 보였다.
- 3(B)는포도당 농도가 5%인 배지에서의 phytase 활성을 나타낸 것이다. 세포 내 phytase 활성은 176mU/mg-DCW으로 최대에 도달한 후 배양시간의 경과에 따라 지속적으로 감소하였으며, 세포 외 phytase 활성은 285 mU/mZ로 포도당 농도가 1%인 배지와 비교할 때 세포외 활성이 낮았다. 이는 전술한 바와 같이 영양원과 배지환경의 변화에 기인한 세포노화와 투과성의 차이로 세포 내 및 세포외 효소활성이 다르게 나타나는 것으로 생각된다.
- 포도당의 전 농도범위에서 총 phytase의 활성은 782-1, 023 mU/m/의 범위를 보였으며, 포도당 농도가 5%인 경우 가장 높은 활성을 보였다. 세포 내 phytase의 최대 활성은 배지의 포도당 농도가 5% 이상인 경우는 170-190 mU/mg-DCW 이었으나, 배지중 포도당 농도가 1%인 경우는 세포 내 phytase 의 최대활성이 114mU/m& 낮게 나타났다. 한편, 총 phytase 활성중 세포외 phytase 활성이 차지하는 비율은 포도당 농도가 5% 이상인 경우는 약 23-28%의 범위를 차지하였으나 포도당 농도가 1%로 저농도의 배지에서는 세포외 phytase 활성과 세포 내 phytase 활성 비율이 거의 1 :1의 유사한 비율로 분포되었다.
- cerevisiae CY 균주의 phytase는 세포외 분비 능이 배양조건에 따라 현저히 다르게 나타났다. 전술한 바와 같이 CY 균주의 phytase는 세포외 분비성과 세포 내 효소의 특징을 함께 갖고 있으며, 배양액으로 분비된 세포외 효소활성보다 세포 내부에 함유된 세포 내 활성이 총 phytase 활성중 차지하는 비율이 더 높게 나타났다(Fig. 2). 배양기간 동안 세포 내 효소 활성이 차지하는 비율이 약 77-87%에 이르렀으며, 나머지가 세포 외 효소 활성으로 측정되었다.
- 8 mg-DCW/mZ의 효모가 증식한다. 즉, 현탁세포를 이용하여 phytate를 분해시키는 방법은 성장하는 효모에 의한 분해 방법보다 더 효과적인 것으로 판단되었다. YM 배지에서 배양된 효모 세포의 약 6% 정도의 균체량(0.
- cerevisiae CY 균주는 전통 민속주의 술덧으로부터 분리한 효모로 보통 정치배양으로 수행되는 알코올 발효 효모이다. 포도당 농도가 5%인 YM배지에서 4&시간 동안 진탕 배양한 경우는 건조균체량(DCW)이 6.8mg/mZ로 정치배양에 비하여 2 배의 균체수율을 보였으며, 세포외 phytase 활성과 세포 내 phytase 활성을 합한 총 phytase 활성도는 진탕배양인 경우가 1, 023 mU/mZ로 정치배양에서의 총 활성도인 594 mU/mZ에 비하여 높은 활성을 보였다(Table 1). 건조균체를 기준으로 나타낸 세포 내 phytase 활성은 생육기에 따라 달랐으며, 지수성장기 말기 무렵에서 173 mU/mg-DCW로 최대 활성을 보인 이후 배양 시간의 경과에 따라 점차적으로 감소하였다(Fig.
- 한편, 총 phytase 활성중 세포외 phytase 활성이 차지하는 비율은 포도당 농도가 5% 이상인 경우는 약 23-28%의 범위를 차지하였으나 포도당 농도가 1%로 저농도의 배지에서는 세포외 phytase 활성과 세포 내 phytase 활성 비율이 거의 1 :1의 유사한 비율로 분포되었다. 포도당 농도에 따른 세포 내 및 세포외 활성의 차이는 영양원의 조기 고갈에 의한 세포노화에 기인되어 세포 내 활성이 낮았으며 상대적으로 세포외로 분비된 세포외 phytase 활성이 높게 나타나는 특징을 보이는 것으로 생각된다. 이러한 phytase 의 세포 내 또는 세포외 분포는 세균인 Enterobacter sp.
- 8 mg/ m/로 제일 높은 생육을 보였으며, 그 이상의 농도에서는 생육이 억제되었다. 포도당의 전 농도범위에서 총 phytase의 활성은 782-1, 023 mU/m/의 범위를 보였으며, 포도당 농도가 5%인 경우 가장 높은 활성을 보였다. 세포 내 phytase의 최대 활성은 배지의 포도당 농도가 5% 이상인 경우는 170-190 mU/mg-DCW 이었으나, 배지중 포도당 농도가 1%인 경우는 세포 내 phytase 의 최대활성이 114mU/m& 낮게 나타났다.
- 세포 내 phytase의 최대 활성은 배지의 포도당 농도가 5% 이상인 경우는 170-190 mU/mg-DCW 이었으나, 배지중 포도당 농도가 1%인 경우는 세포 내 phytase 의 최대활성이 114mU/m& 낮게 나타났다. 한편, 총 phytase 활성중 세포외 phytase 활성이 차지하는 비율은 포도당 농도가 5% 이상인 경우는 약 23-28%의 범위를 차지하였으나 포도당 농도가 1%로 저농도의 배지에서는 세포외 phytase 활성과 세포 내 phytase 활성 비율이 거의 1 :1의 유사한 비율로 분포되었다. 포도당 농도에 따른 세포 내 및 세포외 활성의 차이는 영양원의 조기 고갈에 의한 세포노화에 기인되어 세포 내 활성이 낮았으며 상대적으로 세포외로 분비된 세포외 phytase 활성이 높게 나타나는 특징을 보이는 것으로 생각된다.
후속연구
- 최근에는 효모에 의한 phyta%의생성이나 효소적 특징에 관한 연구心©도 점차 증가하고 있다. 특히, 효모는 세균, 곰팡이에 비하여 배양관리가 용이하고, 빵효모인 경우는 안전성에서 phytate 분해효소원으로 사용하는 타 미생물보다 장점을 갖고 있어서 향후 이에 대한 연구가 폭 넓게 이루어질 것으로 생각된다. 본 연구는 전통 민속주의 술덧으로부터 phytase를 생성하는 Saccharomyces속 효모균주를 분리하였으며, 분리효모의 phytase 생성과 반응 특징 및 phytate 의 분해방법에 관한 연구결과를 보고하고자 한다.
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