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문제 정의
- 뿐만 아니라 환원전리수가 항산화활성을 가지고 있어서 활성산소 생성으로 인한 DNA 분해를 억제한다고 보고되었다.본 연구에서는 환원전리수의 항산화 활성을 근거로 하여 paraquat 에 의해 생성되는 활성산소종으로 인한 사람 임파구 DNA의 손상에 미치는 환원전리수의 보호효과를 Comet assay(single cell gel electrophoresis)를 통하여 살펴보았다.
제안 방법
- 본 연구에서는 Comet assay"1를 사용하여 대표적인 비선택적 맹독성 제초제인 paraquat에 의한 사람 임파구 DNA의 산화적 손상을 살펴보았으며 환원전리수 처리에 의한 임파구 DNA의 손상 회복효과를 분석하였다. 세포내 DNA 손상정도를 측정하는 방법으로는 chromosomal aberration, sister chromatid exchange, micronuclei, 8-hydroxy-2-deoxyguanosine 증의 방법 이 널리 사용되어 왔으나, 최근 Comet assay가 소개되면서 in vitro, in vivo 연구 뿐만 아니라 DNA 손상 측정을 위한 사람 모니터링 방법으로 광범위하게 사용되고 있다 Comet assay 는 유전 독성물질에 의한 DNA 손상을 세포수준에서 민감하고 간편하게 감지할 수 있는 유용한 연구 방법으로 알려져 있다.
- 이러한 결과는 환원전리수 처리가 paraquats로 인한 DNA 손상을 억제시킬 수 있음을 보여준다. 10 pM paraquat을 처리한 후 손상된 임파구의 컴퓨터 이미지와 환원전리수 처리 후 대다 수 임파구의 DNA 손상이 복구된 이미지를 살펴보았다(Fig. 4). PBS 완충용액만을 처리한 대조군의 임파구 DNA는 손상되지 않았으나(Fig 4-A), 10 nM paraquat으로 처리된 임파구의 경우 DNA 손상이 일어나 손상된 DNA 파편이 마치 혜성 꼬리처럼 퍼져있음을 볼 수 있다 (Fig.
- 0 comet image analyzing system (Kinetic Imaging, UK)로 분석하였다. Comet assay에 의한 임파구 DNA 손상정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리인 tail내에 함유된 DNA %인 tail % DNA 값을 측정하여 나타내었다. 각 대상자 당 2개의 slide> 만들어 각각 50개씩 총 100개의 임파구에서 DNA 손상정도를 측정하였다.
- Image analysis. Comet image 분석을 위해 20g/(10pg) 농도의 ethidium bromide로 핵을 형광 염색하고 cover slip으로 덮은 뒤 형광현미경 (Leica MZ16 FA, Germany) 상에서 관찰하였다. 그 후 CCD camera(Nikon, Japan)를 통해 얻어진 각각의 세포핵 image는 Komet 4.
- 7% LMA 용액 75 以를 slide 위에 첨가한 후 다시 cover slip을 덮어 gel°l 굳을 때 까지 냉장 보관하였다. Gel이 굳은 것을 확인한 뒤 cover slip을 제거한 후 slide를 차가운 alkali lysis buffer(2.5 M NaCl, 100 mM N^EDTA, lOmM Tris, 1% Triton X-100, 10% DMSO, 1% laurosylsarcosinate, pH 10)에 담그고, 4℃의 암실에서 1 시간 동안 두면서 세포 단백질을 제거하였다. Lysis가 끝난 slide를 alkaline 용액(300mM NaOH, 10 mM N&EDTA, pH>13)이 포함된 전기영동 탱크에 넣고 40분 동안 4。(3에서 unwinding 시킨 후 25 V/300 土 3 mA에서 20분간 전기영동을 실시하였다.
- Paraquat에 의한 dNa의 산화의 손상과 환원전리수 처리에 의 한 DNA 손상의 억제정도를 확인하기 위해 Single 등의 방법을 변형하여 Comet assay를 실시흐]였다. 준비된 임파구를 0.
- Comet assay에 의한 임파구 DNA 손상정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리인 tail내에 함유된 DNA %인 tail % DNA 값을 측정하여 나타내었다. 각 대상자 당 2개의 slide> 만들어 각각 50개씩 총 100개의 임파구에서 DNA 손상정도를 측정하였다.
- 모든 자료의 처리는 SPSS-PC+ 통계 package!- 사용하여 처리하였다. 각 처리군별로 100 개의 세포에서 측정한 DNA 손상도(tail % DNA)의 평균값과 표준 오차를 구하였다. 각 농도에서 DNA 손상 억제 정도를 비교하기 위해 농도별로 one-way 분산분석 (ANOVA)을 시행하였으며, 각 농도간의 차이는 Duncan test로 사후 검증하였고, 모든 통계적 유의성은 0.
- Comet image 분석을 위해 20g/(10pg) 농도의 ethidium bromide로 핵을 형광 염색하고 cover slip으로 덮은 뒤 형광현미경 (Leica MZ16 FA, Germany) 상에서 관찰하였다. 그 후 CCD camera(Nikon, Japan)를 통해 얻어진 각각의 세포핵 image는 Komet 4.0 comet image analyzing system (Kinetic Imaging, UK)로 분석하였다. Comet assay에 의한 임파구 DNA 손상정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리인 tail내에 함유된 DNA %인 tail % DNA 값을 측정하여 나타내었다.
- 5, 5, 10과 20pM가 되도록 한 후 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 대조군으로는 PBS만을 처리하였다. 또한 환원전리수가 paraquat 에 의한 임파구 DNA 손상에 미치는 영향을 살펴보기 위해서 10 pM paraquat으로 30분 동안 처리된 임파구에 환원전리수를 각각 0, 200, 500과 800씩 30분간 처리하였다.
- 그 결과 임파구 DNA에 환원전리수를 80까지 증가시키면서 처리하여도 대조군과 유사하게 DNA 손상을 발견할 수 없었다. 사람 임파구 DNA에 다양한 농도의 paraquat을 처리한 후 paraquat에 의한 임파구 DNA의 손상정도를 tail % DNA를 측정하여 살펴보았다(Fig. 2). 이 결과에서 알 수 있듯이 paraquat 농도 증가에 따라 DNA 손상정도가 의존적으로 증가하였다(Fig.
- 2배 씩 tail % DNA가 증가하 여 심각한 DNA 손상을 보여주었다. 이번에는 환원전리수 처 리가 paraqua에 의해 손상된 임파구 DNA에 미치는 보호효과를 살펴보기 위하여 먼저 10|iM paraquat 30분간 임파구에 처리한 후 환원전리수를 각각 200, 500과 800㎛씩 처리하였다 (Fig. 3). 그 결과 환원수를 처리하지 않은 경우 paraquat에 의해서 DNA가 심각하게 손상되어서 tail % DNA가 약 27%로 측정되었다(Fig.
- 산화 스트레스이 유도. 임파구 DNA에 paraquat에 의한 산화적 손상을 가하기 위해 paraquat의 최종 농도가 각각 0, 2.5, 5, 10과 20pM가 되도록 한 후 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 대조군으로는 PBS만을 처리하였다. 또한 환원전리수가 paraquat 에 의한 임파구 DNA 손상에 미치는 영향을 살펴보기 위해서 10 pM paraquat으로 30분 동안 처리된 임파구에 환원전리수를 각각 0, 200, 500과 800씩 30분간 처리하였다.
- 환원전리수가 사람 임파구 DNA에 미치는 효과를 tail % DNA를 통하여 살펴보았다(Fig. 1). 그 결과 임파구 DNA에 환원전리수를 80까지 증가시키면서 처리하여도 대조군과 유사하게 DNA 손상을 발견할 수 없었다.
대상 데이터
- 환원전리수의 제조. 실험에 사용된 환원전리수를 제조하기 위하여 마이크로 뱅크사의 Redox-water 생성기를 사용하였다. 전리수 제조장치에 사용된 물은 증류, 역삼투압(Reverse Osmosis) 을 거쳐 최종 3차수에 이르는 초순수(Deionized water)물이었다.
- 실험에 사용된 환원전리수를 제조하기 위하여 마이크로 뱅크사의 Redox-water 생성기를 사용하였다. 전리수 제조장치에 사용된 물은 증류, 역삼투압(Reverse Osmosis) 을 거쳐 최종 3차수에 이르는 초순수(Deionized water)물이었다. 본 실험에서 사용한 환원전리수는 pH가 8.
데이터처리
- 각 처리군별로 100 개의 세포에서 측정한 DNA 손상도(tail % DNA)의 평균값과 표준 오차를 구하였다. 각 농도에서 DNA 손상 억제 정도를 비교하기 위해 농도별로 one-way 분산분석 (ANOVA)을 시행하였으며, 각 농도간의 차이는 Duncan test로 사후 검증하였고, 모든 통계적 유의성은 0.05 수준에서 평가하였다.
성능/효과
- 본 연구결과 에서 나타난 환원전리수에 의한 DNA의 산화적 손상의 복구는 환원전리수에 포함된 활성수소로 인한 항산화력과 연관되어 있 을 것으로 추측된다.")최근 전리수(electrolyzed water)가 환경 친화적인 신개념의 기능수로 주목을 받고 있는데, 9)전기분해로 음극에서 생성되는 환원전리수는 superoxide를 소거할 수 있는 강력한 항산화효능을 가지고 있어서 DNA의 분해를 방지하였다 뿐만 아니라 일반 물의 입자보다 작은 클러스터를 가지 고 있어서 일반 물보다 운동성이 높고 대상물에 대한 흡수력과 용해력이 높다는 사실이 밝혀졌다.
- 이렇게 형성된 paraquat radical은 산소분자와 반응하여 superoxide radical(O2 T) 을 형성하며 이 superoxide radical은 superoxide dismutaw에 의하여 촉매되거나 paraquat와의 반응을 통해 과산화수소로 환원된다.3) 과산화수소는 계속해서 Fenton 반응에 의해 강력한 산소유리기인 하이드록시 라디칼(OH・)이 된다. 강력한 산화력을 가지고 있는 이러한 산화기들은 산소유리기에 의한 조직의 지질과 산화의 최종 단계를 매개하는 중요한 산화제이다.
- 1). 그 결과 임파구 DNA에 환원전리수를 80까지 증가시키면서 처리하여도 대조군과 유사하게 DNA 손상을 발견할 수 없었다. 사람 임파구 DNA에 다양한 농도의 paraquat을 처리한 후 paraquat에 의한 임파구 DNA의 손상정도를 tail % DNA를 측정하여 살펴보았다(Fig.
- 3). 그 결과 환원수를 처리하지 않은 경우 paraquat에 의해서 DNA가 심각하게 손상되어서 tail % DNA가 약 27%로 측정되었다(Fig. 3). 그러나 환원전리수를 200 B에서 800 g까 지 처리 후 모든 DNA의 산하적 손상이 복구 및 억제되어 Fig.
- 5와 5 ㎛ 농도로 처리하였을 때는 대조군과 마찬가지 로 거의 DNA가 손상되지 않았다. 그러나 paraquat 농도를 10 과 20 ㎛로 증가시켰을 패 임파구 DNA가 많이 손상되어 대 조군에 비해 각각 약 3.5배와 4.2배 씩 tail % DNA가 증가하 여 심각한 DNA 손상을 보여주었다. 이번에는 환원전리수 처 리가 paraqua에 의해 손상된 임파구 DNA에 미치는 보호효과를 살펴보기 위하여 먼저 10|iM paraquat 30분간 임파구에 처리한 후 환원전리수를 각각 200, 500과 800㎛씩 처리하였다 (Fig.
- 전리수 제조장치에 사용된 물은 증류, 역삼투압(Reverse Osmosis) 을 거쳐 최종 3차수에 이르는 초순수(Deionized water)물이었다. 본 실험에서 사용한 환원전리수는 pH가 8.5~9.5, ORP는 -850 〜 -800 mA가 유지되게 하였다.
- ⑺ Nitrosamine에 노출된 암환자의 임파구의 DNA repair 능력 뿐만 아니라, 淄 cisplatin 과 etoposide에 의한 DNA repair의 조절이 phosphatidylinositol 3'-kinase의 억제와 연관되어 있음도 보고되었다. 본 연구결과 에서 나타난 환원전리수에 의한 DNA의 산화적 손상의 복구는 환원전리수에 포함된 활성수소로 인한 항산화력과 연관되어 있 을 것으로 추측된다.")최근 전리수(electrolyzed water)가 환경 친화적인 신개념의 기능수로 주목을 받고 있는데, 9)전기분해로 음극에서 생성되는 환원전리수는 superoxide를 소거할 수 있는 강력한 항산화효능을 가지고 있어서 DNA의 분해를 방지하였다 뿐만 아니라 일반 물의 입자보다 작은 클러스터를 가지 고 있어서 일반 물보다 운동성이 높고 대상물에 대한 흡수력과 용해력이 높다는 사실이 밝혀졌다.
- 2). 이 결과에서 알 수 있듯이 paraquat 농도 증가에 따라 DNA 손상정도가 의존적으로 증가하였다(Fig. 1, 2). Paraquat 농 도를 2.
- 1에서 측정한 대조군의 tail % DNA 수치와 거의 유사하였다. 이러한 결과는 환원전리수 처리가 paraquats로 인한 DNA 손상을 억제시킬 수 있음을 보여준다. 10 pM paraquat을 처리한 후 손상된 임파구의 컴퓨터 이미지와 환원전리수 처리 후 대다 수 임파구의 DNA 손상이 복구된 이미지를 살펴보았다(Fig.
후속연구
- 또한 paraquat이 철 조절 단백질(IRP1)과 철 반응성 DNA 요소(IRE)와의 결합력을 증가시키는 것으로 보아 paraquat에 의한 세포독성에 철 대사과정이 관여할 것으로 추측하고 있다.29) 환원전리수가 paraquat에 의한 임파구 DNA 손상을 복구시키는 기전을 밝히기 위해서는 환원 전리수의 항산화력의 본질에 대한 이해와 함께, 환원전리수의 항산화력과 DNA repair효소의 활성조절의 관련성에 대한 체계적인 연구가 필요할 것이다.
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