종실에 비해 다량의 rutin이 함유된 것으로 알려진 메밀 식물체의 최적 rutin함량 분석조건을 확립하기 위해 추출조건, HPLC 분석조건, 분석 재현성 및 최소검출한계를 검토한 결과 rutin은 미황색을 나타내는 폴리페놀 성분으로 에탄올에 용해 하여 최대 흡수파장을 측정하였을 때 359nm에서 흡수 극대파장을 나타내었다. 메밀 식물체 함유 rutin의 최적 HPLC분석 조건을 검토한 결과 컬럼은 Tosoh ODS 120T를 이용하고, 검출기 파장을 355nm, 이동상으로 A용매를 $2\%$ 초산함유-$45\%$ 아세토나이트릴로, B용매는 $2\%$ 초산함유-증류수로 하여 농도구배조건을 0분 : $50\%$ A용액, 0-18분 : $100\%$ A용액, 18-20분 : $50\%$ A용액, 20-22분 : $50\%$ A용액으로 조절하고, 분당 1mL를 용출 하였을 때 가장 우수한 분리가 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 HPLC 분석요인에 대한 재현성을 검정한 결과 머무름시간, peak면적 및 peak높이의 변이 계수가 모두 $0.6\%$미만을 나타내어 극히 높은 분석 재현성을 나타내는 것으로 조사되었으며, HPLC분석 시 최소검출한계는 20ng/mL수준이었다. 메밀 식물체 함유 rutin 분석을 위한 최적 추출조건을 검토한 결과 추출용매를 에탄올로 사용하고, $80^{\circ}C$ 조건에서 120분 이상의 환류추출을 시행하는 것이 가장 바람직한 추출법으로 조사되었다.
종실에 비해 다량의 rutin이 함유된 것으로 알려진 메밀 식물체의 최적 rutin함량 분석조건을 확립하기 위해 추출조건, HPLC 분석조건, 분석 재현성 및 최소검출한계를 검토한 결과 rutin은 미황색을 나타내는 폴리페놀 성분으로 에탄올에 용해 하여 최대 흡수파장을 측정하였을 때 359nm에서 흡수 극대파장을 나타내었다. 메밀 식물체 함유 rutin의 최적 HPLC분석 조건을 검토한 결과 컬럼은 Tosoh ODS 120T를 이용하고, 검출기 파장을 355nm, 이동상으로 A용매를 $2\%$ 초산함유-$45\%$ 아세토나이트릴로, B용매는 $2\%$ 초산함유-증류수로 하여 농도구배조건을 0분 : $50\%$ A용액, 0-18분 : $100\%$ A용액, 18-20분 : $50\%$ A용액, 20-22분 : $50\%$ A용액으로 조절하고, 분당 1mL를 용출 하였을 때 가장 우수한 분리가 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 HPLC 분석요인에 대한 재현성을 검정한 결과 머무름시간, peak면적 및 peak높이의 변이 계수가 모두 $0.6\%$미만을 나타내어 극히 높은 분석 재현성을 나타내는 것으로 조사되었으며, HPLC분석 시 최소검출한계는 20ng/mL수준이었다. 메밀 식물체 함유 rutin 분석을 위한 최적 추출조건을 검토한 결과 추출용매를 에탄올로 사용하고, $80^{\circ}C$ 조건에서 120분 이상의 환류추출을 시행하는 것이 가장 바람직한 추출법으로 조사되었다.
This experiment was conducted to know the appropriate methods for extraction and determination of rutin contained buckwheat plants. The efficient HPLC analytical condition of rutin contained buckwheat plants was developed. The gradient elution employed a $250mm\times4.6mm$ i.d. Tosoh ODS ...
This experiment was conducted to know the appropriate methods for extraction and determination of rutin contained buckwheat plants. The efficient HPLC analytical condition of rutin contained buckwheat plants was developed. The gradient elution employed a $250mm\times4.6mm$ i.d. Tosoh ODS 120T column. The gradient system was used two mobile phases. A gradient elution was performed with mobile phase A, consisting of $2\%$ Acetic $acid-45\%$ Acetonitrile, and mobile phase B, comprising $2\%$ aqueous acetic acid, and delivered at a flow rate of 1mL/min as follows: 0-18 min, $50-100\%$ A; 18-20 min, $100-50\%$ A; 20-22 min, $50\%$ A. The UV detection wavelength was set at 355 nm. The limit of detection (LOD) for rutin standard compound was 20 ng/mL. And, the higher content of rutin in the extracts was obtained by $80^{\circ}C$ reflex extraction for 120 min. from plants of buckwheat using ethanol.
This experiment was conducted to know the appropriate methods for extraction and determination of rutin contained buckwheat plants. The efficient HPLC analytical condition of rutin contained buckwheat plants was developed. The gradient elution employed a $250mm\times4.6mm$ i.d. Tosoh ODS 120T column. The gradient system was used two mobile phases. A gradient elution was performed with mobile phase A, consisting of $2\%$ Acetic $acid-45\%$ Acetonitrile, and mobile phase B, comprising $2\%$ aqueous acetic acid, and delivered at a flow rate of 1mL/min as follows: 0-18 min, $50-100\%$ A; 18-20 min, $100-50\%$ A; 20-22 min, $50\%$ A. The UV detection wavelength was set at 355 nm. The limit of detection (LOD) for rutin standard compound was 20 ng/mL. And, the higher content of rutin in the extracts was obtained by $80^{\circ}C$ reflex extraction for 120 min. from plants of buckwheat using ethanol.
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문제 정의
따라서 본 연구는 메밀종실에 비해 다량의 rutin이 함유된 것으로 알려진 메밀식물체를 대상으로 최적의 rutin 함량분석 석조건을 확립하기 위해 rating 최적 추출 조건, 다양한 HPLC 분석 조건, 분석 재현성 및 최소검출 한계를 검토하고자 하였다.
가설 설정
1)Same letters in a column are not significantly different at the 5% level by DMRT.
1)Same letters in a column are not significantly different at the 5% level by DMRT.
제안 방법
메밀식물체 함유 rutin의 최적 추출 조건 확립을 위해 검토된 저온(5°C), 상온(25。(2) 및 초음파(50°C) 추출법은 시료 1 g 에 에탄올 20mL를 첨가하여 추출 시간별로 추출하였고, 환류추출법(80。(2)은 시료 5 g에 에탄올 100 mL를 첨가하여 추출시 간별로 rutin을 추출하고, 추출 양상을 HPLC로 분석하여 최적 추출 조건을 확립하였다.
Ruting 피리딘, 물 및 알콜에 잘 녹는 특징을 가지는 물질이며, 전형적인 추출법으로서 알콜을 이용한 환류 추출법이 여러 연구자들에 의해 이용되어 왔다(맹등, 1990).메밀 식물체로부터 rutin을 추출할 수 있는 최적의 추출방법을 설정하기 위해 추출방법을 저온(5°C), 상온(25。0, 초음파(50。0 및 환류 추출(80。0로 달리하고, 각 추출방법별로 추출 시간을 달리하였을 때 rutin의 추출 양상을 HPLC 분석을 통하여 정량적으로 검토하였다.
5°C 저온 조건에서 rutin의 추출 효율을 검토하기 위해 메밀식물체 1g에 에탄올 20 ml를 첨가하고 5°C 조건에서 1-24시간 동안 방치하여 rutin을 추출하였고 여과 후 HPLC로 rutin peak의 면적 값을 계산하였다. 추출 시간에 따른 rutin 함량은 Fig.
HPLC를 이용하여 rutin을 분석할 때 분석 가능한 최소검출 량을 확인하기 위해 rutin 표준품을 농도별로 (2ng-2, 000ng/ mL) 조제하여 HPLC 분석을 수행하였다. 최소 검출량을 확인하기 위한 HPLC 분석 조건은 확립된 최적의 HPLC 분석조건 과 동일한 조건이었으며 단지 검출기의 signal 대비 noise 비 율(S/N ratio)0] 3이 되는 조건에서 농도별 rutin 표준품을 분석하고, 검출되는 rutin 표준품의 peak 양상을 확인하여 최소 검출양을 설정하였다.
Tosoh ODS 120T 컬럼을 이용하고 이동상으로 A용매를 2% 초산 함유-45% 아세토나이트릴로, B용매를 2% 초산 함유- 증류수를 사용한 농도구배 조건이 메밀식물체 함유 rutin 분석의 최적 HPLC 분석 조건으로 확인되었으며, 이 조건에서 동일 시료를 10번 계속 반복하여 분석하였을 때 여러 종류의 HPLC 분석 요인에 대한 재현성을 검정하였다(Table 3).그 결과 rutin의 머무름 시간(Rt.
또한 문헌상 rutin의 전형적인 추출방법으로 알려진 80°C 환류추출 조건에서 추출 시간을 10분-180분 동안 달리하였을 때 rutin의 추출 양상을 검토하였다(Table 5). 80°C 환류조건으로 추출할 경우 환류시간이 10분-120분까지는 추출 시간이 증가할수록 추출된 rutin 함량이 증가되는 양상을 나타내었으나 (453 pig-810 |ig/g), 180분 추출의 경우 801 ug/g으로 오히려 120분 추출보다 함량이 감소된 양상을 나타내지만 통계적 차이는 인정되지 않았다.
또한 확립된 최적의 이동상 조건에서 다양한 종류의 컬럼을 적용하였을 때 가장 분리 능이 뛰어난 컬럼을 선정하기 위해 11종의 C18 및 C8 컬럼을 대상으로 분석을 실시하였다. 그 결과 150 및 300 mm 컬럼들은 대부분 rutin peak의 baseline 분리가 이루어지지 않는 양상을 나타내었으나, 250 mm의 컬럼들은 전반적으로 양호한 rutin의 baseline 분리가 이루어지며, 특히 Tosoh ODS 120T 컬럼은 rutin과 quercetin peak가 각각 5분 및 14분대에 완벽한 baseline 분리를 유도함으로 15분 안에 메밀식물체 함유 rutin 및 quercetin 분석을 수행할 수 있는 가장 적합한 컬럼으로 조사되었다.
메밀식물체 함유 rutin의 최적 HPLC 분석 조건 확립을 위해 사용된 분석 컬럼은 Table 1과 같이 C18 및 C8 컬럼 11종을 사용하였고, 이동상 조건은 유기용매로서 메탄올 및 아세토나이트릴을 사용하여 다양한 농도별로 분리 양상을 검토하였다. 이들 용매계 중 가장 우수한 분리 양상을 나타낸 용매조건은 A 용액으로 2% 초산 함유-45% 아세토나이트릴을, B 용액으로 2% 초산함유-증류수를 선형농도구배법으로 사용하는 것이 가장 우수한 분리능을 나타내는 것으로 조사되었다(Table 2).
메밀식물체에 함유된 rutin의 최적 HPLC 분석 조건을 확립하기 위해 HPLC 분석에 많이 이용되는 11종의 컬럼(Table 1)과 다양한 용매조건에서 rutin의 분리 양상을 검토하였다. rutin의 표준품을 대상으로 한 HPLC 분석시 이동상으로는 40% 수준의 메탄올 혹은 25% 수준의 아세토나이트릴을 사용할 경우 여러 종류의 컬럼에서도 rutin의 분리가 양호한 양상을 나타내었다(Fig 2).
HPLC를 이용하여 rutin을 분석할 때 분석 가능한 최소검출 량을 확인하기 위해 rutin 표준품을 농도별로 (2ng-2, 000ng/ mL) 조제하여 HPLC 분석을 수행하였다. 최소 검출량을 확인하기 위한 HPLC 분석 조건은 확립된 최적의 HPLC 분석조건 과 동일한 조건이었으며 단지 검출기의 signal 대비 noise 비 율(S/N ratio)0] 3이 되는 조건에서 농도별 rutin 표준품을 분석하고, 검출되는 rutin 표준품의 peak 양상을 확인하여 최소 검출양을 설정하였다.
추출 조건 확립시험에 사용된 ultrasonic bath는 JAC사 (Korea)의 M-2010을 사용하였고, 분광특성 측정을 위한 spectrophotometer는 Shimadzu사(Japan)의 UV-1650PC를 사용하였다. 정량 분석에 사용된 HPLC 시스템은 TSP사(USA)의 제품을 사용하였으며, TSP HPLC는 Spectra system P2000 pump, UV 2000 detector, As 3000 Autosampler, Eppendorf CH-30 column oven, TSP vacumm degaser 및 Hitachi D- 2500 integraterS.
확립된 rutin의 최적 HPLC 분석 조건 즉 Tosoh ODS 120T(4.6x250 mm, 5 um) 컬럼을 사용하고, 이동상으로 A용매 는 2% 초산함유-45% 아세토나이트릴, B용매는 2% 초산함유 -증류수의 농도구배를 이용하며, 유속 ImL, 시료 주입량 20 u1, 온도는 25°C, 분석파장을 355 nm로 조절한 자외-가시검출기를 이용하였을 때 S/N ratio가 3이 되는 조건에서 농도별 rutin 표준품을 분석하였을 때 분석 가능 한 최소검출한계를 설정하기 위해 rutin 농도별(2ng-2, 000ng/mL)로 조제하여 HPLC를 이용한 최소 검출량을 조사하였다 (Fig. 5). Rutin의 농도가 0.
대상 데이터
Baker Inc.(USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 추출용매인 에탄올은 국산 GR 등급을 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용된 메밀은 농촌진흥청 고령지 농업연구소에서 5월 중순 파종하여 60일 정도 성숙한 양절 메밀 식물체를 분양받아 뿌리를 제거한 경엽과 줄기를 50°C 화력 건조기에서 24시간 건조한 후 분쇄하고, 60 mesh 체로 사별한 후 시료로 사 용하였다.
추출 조건 확립시험에 사용된 ultrasonic bath는 JAC사 (Korea)의 M-2010을 사용하였고, 분광특성 측정을 위한 spectrophotometer는 Shimadzu사(Japan)의 UV-1650PC를 사용하였다. 정량 분석에 사용된 HPLC 시스템은 TSP사(USA)의 제품을 사용하였으며, TSP HPLC는 Spectra system P2000 pump, UV 2000 detector, As 3000 Autosampler, Eppendorf CH-30 column oven, TSP vacumm degaser 및 Hitachi D- 2500 integraterS. 구성되었다.
성능/효과
, 1990) 구입 rutin 표준품을 1, 000 ppm의 농도로 에탄올에 용해하였다. 1, 000 ppm 농도의 rutin 에탄 올 표준용액은 아주 옅은 미 황색의 색상을 나타내었고, 다시 25 ppm 수준으로 희석하여 300-900nm의 파장 범위에서 최대 흡수파장을 측정한 결과 359nm에서 흡수 극대 파장을 나타내었고 (Fig. 1), 이 결과는 Deng 등(1998)의 결과와 일치하는 양상을 나타내었다.
5°C 저온 추출 결과 추출 시간이 길어질수록 추출되는 rutin의 함량이 증가하는 양상을 나타내어 24시간 추출이 167 ug/g으 로 함량 면에서 통계적으로 가장 높은 추출율을 나타내었다 (Table 4). 또한 2NC 상온 추출도 5°C 저온추출의 결과와 동일한 양상으로 추출 시간이 길어질수록 추출되는 rutin의 함량이 증가하는 양상을 나타내었으며 24시간 추출이 278 ug/g으 로 함량 면에서 가장 높은 추출양을 나타내었다.
또한 문헌상 rutin의 전형적인 추출방법으로 알려진 80°C 환류추출 조건에서 추출 시간을 10분-180분 동안 달리하였을 때 rutin의 추출 양상을 검토하였다(Table 5). 80°C 환류조건으로 추출할 경우 환류시간이 10분-120분까지는 추출 시간이 증가할수록 추출된 rutin 함량이 증가되는 양상을 나타내었으나 (453 pig-810 |ig/g), 180분 추출의 경우 801 ug/g으로 오히려 120분 추출보다 함량이 감소된 양상을 나타내지만 통계적 차이는 인정되지 않았다. 따라서 80°C 환류추출 시 적정 추출 시간은 120분이 바람직한 것으로 조사되었다.
5). Rutin의 농도가 0.01 ppm(10ng/mL)에서는 peak가 검출되지 않았지만 0.02ppm(20ng/mL)의 농도에서는 peak가 정확하게 검출되므로 결국 rutin의 HPLC 분석 시 최소검출한계는 20ng/mL 수준인 것으로 조사되었다 (Fig. 4).
한편 25。。상온 추출과 동일시간대의 5°C 저온추출의 결과를 비교해보면 동일 시간대에서는 251 상온추출이 항상 높은 추출율을 나타내며, 특히 24시간 추출에서는 상온추출이 저온추출에 비해 무려 112^g/g 높은 양상을 나타내는 것으로 보아 rutin 성분은 상온조건까지는 추출 온도가 높아질수록 추 출효율이 향상되는 것으로 평가되고 또 추출 시간이 길어질수록 추출율이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
컬럼을 대상으로 분석을 실시하였다. 그 결과 150 및 300 mm 컬럼들은 대부분 rutin peak의 baseline 분리가 이루어지지 않는 양상을 나타내었으나, 250 mm의 컬럼들은 전반적으로 양호한 rutin의 baseline 분리가 이루어지며, 특히 Tosoh ODS 120T 컬럼은 rutin과 quercetin peak가 각각 5분 및 14분대에 완벽한 baseline 분리를 유도함으로 15분 안에 메밀식물체 함유 rutin 및 quercetin 분석을 수행할 수 있는 가장 적합한 컬럼으로 조사되었다.
Tosoh ODS 120T 컬럼을 이용하고 이동상으로 A용매를 2% 초산 함유-45% 아세토나이트릴로, B용매를 2% 초산 함유- 증류수를 사용한 농도구배 조건이 메밀식물체 함유 rutin 분석의 최적 HPLC 분석 조건으로 확인되었으며, 이 조건에서 동일 시료를 10번 계속 반복하여 분석하였을 때 여러 종류의 HPLC 분석 요인에 대한 재현성을 검정하였다(Table 3).그 결과 rutin의 머무름 시간(Rt.), peak 면적 및 peak 높이의 변이계수를 조사한 결과 모두 0.6% 미만을 나타내어 극히 높은 분석 재현성을 나타내는 것으로 조사되었으므로 상기 조건에 의해 확립된 rutin의 최적 분석법은 재현성이 매우 높은 정량적 분석법으로 이용 가능함을 확인할 수 있었다.
따라서 이런 양상을 고려하여 메밀식물체 함유 rutin 분석에 적합한 HPLC 이동상의 조건을 검토한 결과 유기용매로 메탄올을 사용할 경우 어떤 농도에서도 메밀식물체에 함유된 rutin의 peak를 순수하게 분리하지 못하였다. 그러나 유기용매로 25% 수준 이상의 아세토나이트릴을 사용할 경우 메밀식 물체에 함유된 rutin의 분리가 양호하였고, 더욱이 시간별로 아세토나이트릴의 농도를 증가시키는 농도구 배 조건을 이용하면 rutin의 비당체로서 극성이 낮은 quercetin도 동시 분석이 가능한 것으로 조사되었다. 따라서 rutin과 quercetin을 동시에 분석할 수 있는 다양한 농도구 배 조건을 검토한 결과 이동상으로 A용매를 2% 초산 함유-45% 아세토나이트릴로, B용매는 2% 초산함유-증류수로 하여 농도구배 조건을 0분 : 50% A용 액, 0-18분 : 100% A용액, 18-20분 : 50% A용액, 20-22분 : 50% A용액으로 하였을 때 가장 분리가 우수한 가능한 이동상의 조성을 확인할 수 있었다.
80°C 환류조건으로 추출할 경우 환류시간이 10분-120분까지는 추출 시간이 증가할수록 추출된 rutin 함량이 증가되는 양상을 나타내었으나 (453 pig-810 |ig/g), 180분 추출의 경우 801 ug/g으로 오히려 120분 추출보다 함량이 감소된 양상을 나타내지만 통계적 차이는 인정되지 않았다. 따라서 80°C 환류추출 시 적정 추출 시간은 120분이 바람직한 것으로 조사되었다. 한편 80°C 조건에서 환 류추출 방법으로 추출할 경우 10분만 추출하여도 25°C 상온 및 5°C 저온에서 24시간 동안 추출한 함량보다 높은 rutin 함량을 나타내므로 환류추출법이 rutin의 추출에 상당히 높은 효율을 나타내는 최적 추출 방법 임을 알 수 있다.
그러나 유기용매로 25% 수준 이상의 아세토나이트릴을 사용할 경우 메밀식 물체에 함유된 rutin의 분리가 양호하였고, 더욱이 시간별로 아세토나이트릴의 농도를 증가시키는 농도구 배 조건을 이용하면 rutin의 비당체로서 극성이 낮은 quercetin도 동시 분석이 가능한 것으로 조사되었다. 따라서 rutin과 quercetin을 동시에 분석할 수 있는 다양한 농도구 배 조건을 검토한 결과 이동상으로 A용매를 2% 초산 함유-45% 아세토나이트릴로, B용매는 2% 초산함유-증류수로 하여 농도구배 조건을 0분 : 50% A용 액, 0-18분 : 100% A용액, 18-20분 : 50% A용액, 20-22분 : 50% A용액으로 하였을 때 가장 분리가 우수한 가능한 이동상의 조성을 확인할 수 있었다.
따라서 이런 양상을 고려하여 메밀식물체 함유 rutin 분석에 적합한 HPLC 이동상의 조건을 검토한 결과 유기용매로 메탄올을 사용할 경우 어떤 농도에서도 메밀식물체에 함유된 rutin의 peak를 순수하게 분리하지 못하였다. 그러나 유기용매로 25% 수준 이상의 아세토나이트릴을 사용할 경우 메밀식 물체에 함유된 rutin의 분리가 양호하였고, 더욱이 시간별로 아세토나이트릴의 농도를 증가시키는 농도구 배 조건을 이용하면 rutin의 비당체로서 극성이 낮은 quercetin도 동시 분석이 가능한 것으로 조사되었다.
5°C 저온 추출 결과 추출 시간이 길어질수록 추출되는 rutin의 함량이 증가하는 양상을 나타내어 24시간 추출이 167 ug/g으 로 함량 면에서 통계적으로 가장 높은 추출율을 나타내었다 (Table 4). 또한 2NC 상온 추출도 5°C 저온추출의 결과와 동일한 양상으로 추출 시간이 길어질수록 추출되는 rutin의 함량이 증가하는 양상을 나타내었으며 24시간 추출이 278 ug/g으 로 함량 면에서 가장 높은 추출양을 나타내었다.
메밀식물체 함유 rutin의 최적 HPLC 분석 조건을 검토한 결과 컬럼은 Tosoh ODS 120T를 이용하고, 검출기 파장을 355 nm, 이동상으로 A용매를 2% 초산함유 45% 아세토나이트릴로, B용매는 2% 초산함유 증류수로 하여 농도구배 조건을 0분 : 50% A용액, 0-18분 : 100% A용액, 18-20분 : 50% A용액, 20-22분 : 50% A용액으로 조절하고, 분당 ImL를 용출하였을 때 가장 우수한 분리가 유도되는 것을 확 인할 수 있었다. 또한 HPLC 분석 요인에 대한 재현성을 검정한 결과 머무름 시간, peak 면적 및 peak 높이의 변이계수가 모두 0.6% 미만을 나타내어 극히 높은 분석 재현성을 나타내는 것으로 조사되었으며, HPLC 분석 시 최소검출 한계 는 20ng/mL 수준이었다. 메밀식물체 함유 rutin 분석을 위한 최적 추출 조건을 검토한 결과 추출용매를 에탄올로 사용하고, 80°C 조건에서 120분 이상의 환류추출을 시행하는 것이 가장 바람직한 추출법으로 조사되었다.
6% 미만을 나타내어 극히 높은 분석 재현성을 나타내는 것으로 조사되었으며, HPLC 분석 시 최소검출 한계 는 20ng/mL 수준이었다. 메밀식물체 함유 rutin 분석을 위한 최적 추출 조건을 검토한 결과 추출용매를 에탄올로 사용하고, 80°C 조건에서 120분 이상의 환류추출을 시행하는 것이 가장 바람직한 추출법으로 조사되었다.
종실에 비해 다량의 rutin이 함유된 것으로 알려진 메밀식 물체의 최적 rutin 함량분석조건을 확립하기 위해 추출 조건, HPLC 분석 조건, 분석 재현성 및 최소검출 한계를 검토한 결과 rutin은 미 황색을 나타내는 폴리페놀 성분으로 에탄올에 용해하여 최대 흡수파장을 측정하였을 때 359nm에서 흡수 극대 파장을 나타내었다. 메밀식물체 함유 rutin의 최적 HPLC 분석 조건을 검토한 결과 컬럼은 Tosoh ODS 120T를 이용하고, 검출기 파장을 355 nm, 이동상으로 A용매를 2% 초산함유 45% 아세토나이트릴로, B용매는 2% 초산함유 증류수로 하여 농도구배 조건을 0분 : 50% A용액, 0-18분 : 100% A용액, 18-20분 : 50% A용액, 20-22분 : 50% A용액으로 조절하고, 분당 ImL를 용출하였을 때 가장 우수한 분리가 유도되는 것을 확 인할 수 있었다. 또한 HPLC 분석 요인에 대한 재현성을 검정한 결과 머무름 시간, peak 면적 및 peak 높이의 변이계수가 모두 0.
메밀식물체(줄기 및 잎)는 종실과 달리 식물체가 생장하는 동안 다양한 물질의 합성이 이루어지는 부분이며, 경우에 따라서는 특정 물질의 합성을 위한 전구물질도 다양하게 존재함으로 단순히 최종 대사 산물만이 축적되는 종실과는 달리 내용 성분 면에서 판이하게 다른 양상을 나타낸다고 볼 수 있다. 실제 메밀식물체 추출물을 HPLC로 분석하였을 때 종실 추출물과 비교해 상당히 복잡한 크로마토그램을 나타내는 것을 확인할 수 있다(Fig 3).
컬럼 11종을 사용하였고, 이동상 조건은 유기용매로서 메탄올 및 아세토나이트릴을 사용하여 다양한 농도별로 분리 양상을 검토하였다. 이들 용매계 중 가장 우수한 분리 양상을 나타낸 용매조건은 A 용액으로 2% 초산 함유-45% 아세토나이트릴을, B 용액으로 2% 초산함유-증류수를 선형농도구배법으로 사용하는 것이 가장 우수한 분리능을 나타내는 것으로 조사되었다(Table 2).
종실에 비해 다량의 rutin이 함유된 것으로 알려진 메밀식 물체의 최적 rutin 함량분석조건을 확립하기 위해 추출 조건, HPLC 분석 조건, 분석 재현성 및 최소검출 한계를 검토한 결과 rutin은 미 황색을 나타내는 폴리페놀 성분으로 에탄올에 용해하여 최대 흡수파장을 측정하였을 때 359nm에서 흡수 극대 파장을 나타내었다. 메밀식물체 함유 rutin의 최적 HPLC 분석 조건을 검토한 결과 컬럼은 Tosoh ODS 120T를 이용하고, 검출기 파장을 355 nm, 이동상으로 A용매를 2% 초산함유 45% 아세토나이트릴로, B용매는 2% 초산함유 증류수로 하여 농도구배 조건을 0분 : 50% A용액, 0-18분 : 100% A용액, 18-20분 : 50% A용액, 20-22분 : 50% A용액으로 조절하고, 분당 ImL를 용출하였을 때 가장 우수한 분리가 유도되는 것을 확 인할 수 있었다.
한편 50°C 조건의 초음파 bath를 이용하여 10분-180분 동안 초음파 추출을 하였을 때 추출된 rutin의 함량을 검토하였 다(Table 5), 50°C 조건의 초음파 추출도 기타 상온 및 저온조건의 추출법과 같은 양상으로 추출 시간이 증가할수록 rutin 함량이 증가하는 양상을 나타내었으며, 180분 추출이 635 pg/ g으로 가장 높은 추출 효율을 나타내었다.
참고문헌 (9)
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