메주에서 분리된 Enterococcus faecium MJ-14가 생산하는 박테리오신의 부분정제 Partial Purification of Bacteriocin Produced by Enterococcus faecium MJ-14 Isolated from Meju원문보기
E. faecium MJ-14 균주의 배양 상등액에 $50\%$황산암모늄을 처리한 결과, 박테리오신 활성은 3,840 BU/mL으로 배양 상등액에 비해 6배 증가되었고 회수율은 약 $60\%$에 이르렀다. 이온교환크로마토그래피에 의해 용출된 획분 중 $48\∼76$번에서 항균 활성이 나타났으며, 용출물의 비활성은 35.7배 증가하였고, 회수율은 약 $41\%$였다. 그리고 겔 크로마토그래피에 의해 비활성 127,293 BU/mg인 박테리오신 단백질을 정제하였으며, 이 때 정제도는 114배, 수율은 $36\%$였다. 정제된 박테리오신 단백질을 SDS-FACE한 결과. 항균 활성을 나타내는 4.3 kDa과 5.8 kDa의 분자량을 확인하였다.
E. faecium MJ-14 균주의 배양 상등액에 $50\%$ 황산암모늄을 처리한 결과, 박테리오신 활성은 3,840 BU/mL으로 배양 상등액에 비해 6배 증가되었고 회수율은 약 $60\%$에 이르렀다. 이온교환크로마토그래피에 의해 용출된 획분 중 $48\∼76$번에서 항균 활성이 나타났으며, 용출물의 비활성은 35.7배 증가하였고, 회수율은 약 $41\%$였다. 그리고 겔 크로마토그래피에 의해 비활성 127,293 BU/mg인 박테리오신 단백질을 정제하였으며, 이 때 정제도는 114배, 수율은 $36\%$였다. 정제된 박테리오신 단백질을 SDS-FACE한 결과. 항균 활성을 나타내는 4.3 kDa과 5.8 kDa의 분자량을 확인하였다.
The bacteriocin produced by E. faecium MJ-14 was precipitated with $50\%$ saturated ammonium sulfate in MRS broth and then the precipitated protein was dissolved in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0). The crude bacteriocin was purified by CM-sepharose CL 6B and Sephacry S-100 column c...
The bacteriocin produced by E. faecium MJ-14 was precipitated with $50\%$ saturated ammonium sulfate in MRS broth and then the precipitated protein was dissolved in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0). The crude bacteriocin was purified by CM-sepharose CL 6B and Sephacry S-100 column chormatograhy. In this case, the purification fold of the bacteriocin was 114, therefore, its activity was 127,293 BU/mg of specific activity. Result from SDS-PAGE of the purified bacteriocin, it was obtained two protein bands of 4.3 kDa and 5.8 kDa having antilisterial activity.
The bacteriocin produced by E. faecium MJ-14 was precipitated with $50\%$ saturated ammonium sulfate in MRS broth and then the precipitated protein was dissolved in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0). The crude bacteriocin was purified by CM-sepharose CL 6B and Sephacry S-100 column chormatograhy. In this case, the purification fold of the bacteriocin was 114, therefore, its activity was 127,293 BU/mg of specific activity. Result from SDS-PAGE of the purified bacteriocin, it was obtained two protein bands of 4.3 kDa and 5.8 kDa having antilisterial activity.
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문제 정의
본 연구에서는 전통 발효식품의 원료인 메주로부터 분리한 Enterococcus faecium MJ-14가 생산하는 박테리오신을 황산암모늄 침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피 및 SDS-PAGE를 이용하여 정제한 후 박테리오신의 분자량을 측정하고자 한다.
가설 설정
Marker materials made by TEFCO. 2, Purified the bacteriocin bands staining with coomassie blue. 3, A gel overlaid with cells of L.
CM sepharose CL-6B와 HiPrep 16/60 Sephacryl S-100에 의해 정제한 박테리오신 분획물의 정제도를 확인하기 위하여 Laemmli14)의 방법을 일부 변형하여 Mini-PROTEIN II electrophoresis system (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, US A)으로 전기영동을 실시하였다.
정제한 박테리오신 용액 50 |11와 sample buffer 50 μL을 혼합하고 95°C에서 3분간 가열한 후 가볍게 원심분리하여 준비하였다. Running gel (2 M Tris-HC], 30% acrylamide, 0.8% bisacrylamide, 20% SDS, 10% Ammonium persulfete, TEMED)와 stacking gel (0.25 M Tris-HCl, 30% acrylamide,1.5% bisacrylamide, 20% SDS, 10% ammonium persulfate, TEMED) 각각을 조제한 후 전기영동 장치에 장 착한 다음 전개 완충용액 (0.025 M Tris-HCl, 0.192 M glycine, 0.1% SDS)을 붓고, gel의 well에 protein marker 와 준비된 시료 20 μL을 loading 한 뒤 80 V의 일정한 전압에서 3시간 전개시켰다. 전기영동 종료 후 영동판으로부터 gel을 분리하여 coomassie brilliant blue R 250으로 2시간 염색하고 나서 2시간 탈색시켰다.
고순도의 박테리오신을 조제하기 위하여 E. faecium MJ- 14의 배양 상등액 중의 단백질을 황산암모늄 침전법으로 염석시킨 후 이온교환크로마토그래피와 겔크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 정제한 결과는 Table 1과 같다. E.
전기영동한 gel을 20% (vol/vol) iso-propanol과 10% (vol/vol) glacial acetic acid solution에 담군 후 상온에서 2시간 고정시키고 나서 증류수로 30분마다 교체하면서 2시간 동안 세척하였다. 세척한 gel은 L. monocytogenes KCTC 3569 (약 106 CFU/ mL)가 중층된 BHI 평판배지 위에 올려 놓고 37°C에서 24 시간 동안 배양하여 항균 활성을 확인하였다. 이때 단백질 분자량 측정을 위한 표준물질로는 Protein Molecular Weight Markers (TEFCO, Technical frontier, Co.
0)를 사용하여 linear salt gradient 방법으로 수지에 흡착된 단백질을 용출시켰다. 이 때, 유속은 24 mL/hr 이었으며, 용출액은 4.5 mL씩 분획하여 214 nm에서의 흡광도를 측정하고 단백질 획분을 모아 항균 활성을 확인하였다.
이온교환 크로마토그래피에서 얻어진 활성 분획물 2 mL를 20 mM Na-phosphate buffer (pH 6.0)로 평형화시킨 HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 column (2.6 x 60cm, Pharmacia, Sweden)으로 2차 정제를 시도하였다. 즉, 150 mM Na- phosphate buffer (pH 6.
이온교환 크로마토그래피에서 얻은 항균 활성 획분(48~76번)을 모아 증류수에 하룻밤 동안 투석 (MWC0 1,000)한 후 Sephacryl S-100 HR 컬럼으로 정제한 결과는 Fig. 2와 같다. 용출된 단백질 peak 중에서 53〜64번 획분에서 박테리오신 활성이 나타났으며, 비활성은 127, 293 BU/ mL로 크게 증가하였으며, 활성 회수율은 36%였다.
배양 상등액 2 L에 50% 농도의 황산암모늄을 천천히 교반하면서 첨가하여 4℃에서 12시간 염석한 후, 원심분리(10, 000 rpm, 20 min, 4°C)하였다. 침전물만을 회수하여 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) 200 mL에 현탁하고 spectra-por dialysis membrane (molecular weight cut off 1, 000; Spectrum Medical Industries, Inc., CAL,USA)에 넣어 4°C에서 동일한 buffer로 12시간 동안 투석시켜 항균 활성을 확인하였다.
황산암모늄 염석한 조박테리오신 용액을 양이온 교환수지인 carboxy-methyl sepharose CL-6B (CM-Sepharose CL- 6B, Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)을 사용하여 1 차 정제를 시도하였다. 즉, 20 mM Na-phosphate buffer (pH 6.
대상 데이터
monocytogenes KCTC 3569 (약 106 CFU/ mL)가 중층된 BHI 평판배지 위에 올려 놓고 37°C에서 24 시간 동안 배양하여 항균 활성을 확인하였다. 이때 단백질 분자량 측정을 위한 표준물질로는 Protein Molecular Weight Markers (TEFCO, Technical frontier, Co., Japan)를 사용하였다.
이론/모형
전보13)에서 보고된 바와 같이 박테리오신 용액의 항균 활성은 critical dilution method로 측정하였다. 즉, 정제된 박테리오신 용액은 2진법으로 희석한 후 50 μL씩 paper disk (Toyo, 0 8 mm)에 loading하였다.
성능/효과
faecium MJ- 14의 배양 상등액 중의 단백질을 황산암모늄 침전법으로 염석시킨 후 이온교환크로마토그래피와 겔크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 정제한 결과는 Table 1과 같다. E. faecium MJ-14를 MRS 액체배지에서 37°C, 12시간 배양한후 원심분리하여 얻은 배양 상등액의 박테리오신 활성은 640 BU/mL이었고, 여기에 황산암모늄 50% 포화상태로 첨가하여 4℃에서 하룻밤 방치한 다음 얻어진 pellet을 20 mM Na-phosphate buffer (pH 6.0)에 녹여 투석한 황산암 모늄 획분의 박테리오신 활성은 3, 840 BU/mL으로 나타나 배양 상등액에 비해 약 6배 증가되었고 회수율은 약 60% 였다.
26)은 e. faecium NIAI 157의 enterocin ON-157 분자량 은 2.5 kDa이었으며, enterocin 012는 3.4 kDa27)인 것으로 나타났는데, E. faecium MJ-14의 박테리오신은 이들의 박테리오신보다 다소 크기가 큰 것을 알 수 있었다.
3%로 나타났다고 보고하였다. 따라서 E. faecium MJ-14가 생산하는 박테리오신은 황산암모늄 침전법, 이온교환수지 및 겔 크로마토그래피를 통해 비교적 높은 정제도와 회수율을 얻을 수 있었다.
2와 같다. 용출된 단백질 peak 중에서 53〜64번 획분에서 박테리오신 활성이 나타났으며, 비활성은 127, 293 BU/ mL로 크게 증가하였으며, 활성 회수율은 36%였다.
45 M NaCl 농도에 해당호)였다. 용출된 획분 중 48〜76번 째 획분에서 항균 활성이 나타났으며, 이온교환 크로마토그피하여 얻은 용출물의 비활성은 35.7배 증가하였고, 회수율은 약 41%였다.
faecium G16이 생산한 박테리오신은 40%의 황산암모늄으로 포화되어 이들의 비활성은 각각 181 BU/mg와 151 BU/mg이고 회수율은 86%와 55%를 나타내 었다고 하였다. 이러한 연구 결과와 비교해 볼 때, E. faecium MJ-14의 배양 상등액 중의 박테리오신은 50% 황산암모늄 염석에 의해 비교적 효율적으로 회수된 것으로 볼 수 있다.
15% SDS-PAGE 결과 뚜렷하게 분리된 4개의 밴드가 나타났다. 전기 영동된 4개의 밴드를 L. monocytogenes가 접종된 평판배지에 올리고 37°C에서 배양 한 결과 2개의 밴드에서 항균 활성이 나타났으며, 이들 각각의 분자량은 5.8 kDa과 4.3 kDa이었다. 따라서 E.
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