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문제 정의
- 이번 연구에서는 담배의 곁순과 관련된 유전자를 이용하여 형질전환을 통한 곁순이 없는 담배의 개 발을 위한 준비작업의 일환으로 담배에서 expansin 유전자를 발굴하고 이들 유전자를 이미 다른 작물 에서 발굴된 expansin 유전자와의 계통학적인 비교 를 수행하고 이미 발굴된 여러 expansin 유전자를 이용하여 담배의 형질전환 체계를 확립하는데 목적 이 있다.
제안 방법
- 유전자를 도입하지 않은 vector를 이용하여 형질전 환 시킨 세포를 대조구로 사용하였다. OsEXPA4는 cDNA clone U85246을 XbaI과 Kpnl, OsEXPB3와 OsEXPB4는 Sa"과 SacI을 이용하여 각각 EST clone S1104와 C51142로부터 잘라내었으며 OsEXPB6는 XbaI을 가진 T7 primer (GCTCTAGAGTAATACG ACTCACTATAGGGC) 와 T3 primer (ATTAACCCTC ACTAAAGGGAX 이용하여 EST clone C51730으 로부터 증폭한 후 X/&I과 SacI을 이용하여 잘라내 어 pCAMBIA1300mcs에 도입하였다.
- 계대배양 시 callus를 멸균된 핀셑을 이용하는 관계로 일정한 크기의 callus를 떼어내는 것은 실험자의 경험에 의 존할 수밖에 없는 한계가 있는데 이와 같은 실험을 하는 경우에는 편차를 고려하여 측정하는 callus의 숫자를 충분히 많게 늘리는 것이 하나의 해결책이 라고 생각된다. Callus의 무게 증가가 세포의 크기 에서 유래했는지 아니면 세포의 세포분열 속도에 의해 유래했는지를 알아보기 위하여 각 처리구에서 세포의 크기를 측정하여 비교하였다.
- 형질전환된 캘러스의 확인은 PCR과 면역학적 방법을 병용하여 수행하였다. PCR을 통한 형질전환 체의 확인은 OsEXPA4의 경우 유전자 특이적인 primer GATGCTTCCGGAACCATGG와 ATTCCG TTGCAAGGCCATCACTCO 이용하여, OsEXPB3의 경우 TTCCATCTCCAAGAAGGCT와 TAATT TATGACCTTTGTTCTG, OseXPB4의 경우 CCG CCACCTCTCTCATCG와 CCTTGTACGCCTACC TCCTCCATT, OsEXPB6의 경우 ACTACCACTAC TACTGCTGC와 CTGTAGCCTTAAGATTTGGTT 를 이용하여 PCR을 수행하였다. 면역학적인 방법은 전에 기술한 방법에 따라 OsEXPA4와 OsEXPB3에 특이적인 항체를 이용하여 수행하였다 (Lee and Choi, 2005).
- 고체배지에서 배양한 형질전환 세포를 NTC 액체 배지에서 1일 동안 현탁 배양하여 광학현미경을 이용하여 디지털 사진기를 이용하여 사진을 촬영하고 대물마이크로미터를 같은 배율에서 촬영하여 세포 의 폭과 길이를 측정하였다.
- 담배 (Nicotiana tabacum L)에서 expansin 유전 자의 기능을 알아보기 위하여 벼의 expansin 유전 자 (OsEXPA4f 0sEXPB3f 0sEXPB4, 0sEXPB6) 를 형질전환기술을 이용하여 담배에 도입하였다. Expansin 유전자의 도입은 callus의 무게를 36%에서 65%정도 증가시켰으며 세포의 크기를 측정한 결과 세포의 길이는 12%에서 28%가 증가하였으나 세포의 폭은 3EXPB3의 경우 3% 감소하였고, OsEXPB4의 경우에는 변화가 없었으며, OsEXPA4와 OsEXPB6의 경우에는 각각 25%와 20% 증가하였다.
- 담배의 expansin 단백질의 아미노산 서열은 GenBank에서 수집하였으며 벼 (Oryaz sativa L.) 와 애기장대 (Arabidopsis thaliana L)의 expansin super-family 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 분류하였다. 계통수는 먼저 Clustal X (1.
- 1A와 같이 pCAMBIA 1300mcs vector를 이용하여 네 가지 vector construct를 제조하였다. 유전자를 도입하지 않은 vector를 이용하여 형질전 환 시킨 세포를 대조구로 사용하였다. OsEXPA4는 cDNA clone U85246을 XbaI과 Kpnl, OsEXPB3와 OsEXPB4는 Sa"과 SacI을 이용하여 각각 EST clone S1104와 C51142로부터 잘라내었으며 OsEXPB6는 XbaI을 가진 T7 primer (GCTCTAGAGTAATACG ACTCACTATAGGGC) 와 T3 primer (ATTAACCCTC ACTAAAGGGAX 이용하여 EST clone C51730으 로부터 증폭한 후 X/&I과 SacI을 이용하여 잘라내 어 pCAMBIA1300mcs에 도입하였다.
- 이번 실험은 담배의 유전자가 아닌 벼의 유전자 를 이용하여 담배를 형질전환한 결과인데 앞으로 담배를 형질전환을 통하여 신품종을 개발하는 경우 다른 식물의 유전자를 이용할 수도 있겠으나 기존의 담배의 유전자를 이용하는 것이 가장 좋을 것으로 사료되고 특히 유전자의 발현을 증가시키는 경우에는 다른 식물의 유전자를 이용하는 것이 별 문제가 없어 보이나 기존의 유전자를 antisense 기술 이나 RNAi 기술을 이용하여 유전자 발현을 억제하는 경우 담배의 유전자를 거의 모두 알고 있어야 체계적인 접근이 가능하다. 이에 따라 database의 유전자 검색을 통하여 담배의 유전자를 검색하여 보았다.
- 형질전환된 캘러스의 확인은 PCR과 면역학적 방법을 병용하여 수행하였다. PCR을 통한 형질전환 체의 확인은 OsEXPA4의 경우 유전자 특이적인 primer GATGCTTCCGGAACCATGG와 ATTCCG TTGCAAGGCCATCACTCO 이용하여, OsEXPB3의 경우 TTCCATCTCCAAGAAGGCT와 TAATT TATGACCTTTGTTCTG, OseXPB4의 경우 CCG CCACCTCTCTCATCG와 CCTTGTACGCCTACC TCCTCCATT, OsEXPB6의 경우 ACTACCACTAC TACTGCTGC와 CTGTAGCCTTAAGATTTGGTT 를 이용하여 PCR을 수행하였다.
대상 데이터
- 실험재료로는 담배 (Nicotiana tabacum L. ) BY2 cell을 이용하였다.
- 현탁배양 세포의 형질전환을 통하여 대조구를 포함한 각 처리구에서 독립된 20 라인씩 총 100 라인 의 형질전환체가 선발되었으며 PCR을 통하여 유전 자의 도입이 확인되었다 (Fig. 3A). 또한 형질전환 된 담배세포라인으로부터 OsEXPA4와 OsEXPB3에 대한 항체 (Lee and Choi, 2005)를 이용하여 면역 학적인 실험을 한 결과 선택배지에서 자란 모든 캘 러스에서 도입된 단백질의 발현을 확인할 수 있었 다 (Fig.
이론/모형
- ) 와 애기장대 (Arabidopsis thaliana L)의 expansin super-family 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 분류하였다. 계통수는 먼저 Clustal X (1.81) 프로그램을 이용하여 align 한 후 MrBayes (3.0) 프로그램을 이용하여 (Jones 아미노산 모델 gamma estimation, 500, 000 generation, 4 channels) 만들 었고 root는 Dictyostellium의 expansin 유사단백질 (accession No. XP_647352) 을 이용하였다 (Huelsenbeck and Ronquist, 2001).
- 제조한 vector를 sequencing을 통하여 유전자서 열을 확인한 후 Agrobacterium tumefeciens LBA4404에 freeze-thaw 방법을 이용하여 도입하였다. 유전자의 도입이 확인된 Agrobacterium 세포 를 hygromycin이 들어있는 LB 배지에서 하룻밤 동안 배양한 후 계대배양한 지 3일째 되는 BY2 cell 50 mL 에 20 mM acetosyringone 50 11L를 첨가한 후 피펫을 이용하여 20 회 빨아들였다 내뱉기 를 반복해서 세포에 상처를 유도한 후 4 mL의 세 포를 페트리디쉬에 넣고 100 uL의 Agrobacterium 세포를 첨가하여 잘 섞어주었다.
성능/효과
- 담배 (Nicotiana tabacum L)에서 expansin 유전 자의 기능을 알아보기 위하여 벼의 expansin 유전 자 (OsEXPA4f 0sEXPB3f 0sEXPB4, 0sEXPB6) 를 형질전환기술을 이용하여 담배에 도입하였다. Expansin 유전자의 도입은 callus의 무게를 36%에서 65%정도 증가시켰으며 세포의 크기를 측정한 결과 세포의 길이는 12%에서 28%가 증가하였으나 세포의 폭은 3EXPB3의 경우 3% 감소하였고, OsEXPB4의 경우에는 변화가 없었으며, OsEXPA4와 OsEXPB6의 경우에는 각각 25%와 20% 증가하였다. 담배의 유전자를 database를 이용하여 검색한 결과 7개의 유전자를 발견하였고 이 중 6개는 EXR4에 속하였고 1개는 EXPB에 속하였으며 벼와 애기장대에서 발견된 ES와 EXLB는 발견되지 않았다.
- 계대배양 후 3주후에 각 처리구당 callus의 무게 를 측정한 결과 (Fig. 2, Table 1) 각 처리구의 평균 callus의 무게는 대조구에 비하여 36%에서 65%만큼 증가하였다. 그리고 callus의 무게는 대조구를 포함하여 모든 처리구에서 편차가 비교적 크게 나 왔는데 그 이유는 callus를 계대하는 과정에서 옮기는 callus의 크기가 callus의 생장에 많은 영향을 주 기 때문으로 생각된다.
- OsEXPB4와 OsEXPB6에 대해서는 항체가 없어 단백질의 발현을 면역학적으로 확 인하지 못하였다. 담배세포를 이용한 세포의 형질전 환은 오래전부터 시도되어 오고 있는 잘 확립된 실 험과정이지만 이번 실험에서는 expansin 유전자를 이용하여 형질전환을 시도함으로써 다른 식물의 expansin 단백질이 담배에서 발현되더라도 세포에 치명적인 효과를 주지 않고 세포가 잘 생존할 수 있음을 확인할 수 있었다.
- Expansin 유전자의 도입은 callus의 무게를 36%에서 65%정도 증가시켰으며 세포의 크기를 측정한 결과 세포의 길이는 12%에서 28%가 증가하였으나 세포의 폭은 3EXPB3의 경우 3% 감소하였고, OsEXPB4의 경우에는 변화가 없었으며, OsEXPA4와 OsEXPB6의 경우에는 각각 25%와 20% 증가하였다. 담배의 유전자를 database를 이용하여 검색한 결과 7개의 유전자를 발견하였고 이 중 6개는 EXR4에 속하였고 1개는 EXPB에 속하였으며 벼와 애기장대에서 발견된 ES와 EXLB는 발견되지 않았다. 벼와 애기장대 유전자와의 계통학적인 분석 결과 발견된 담배의 유전자는 계통수에서 비교적 고르게 분포하고 있는 것을 알 수 있었다.
- 담배의 유전자를 database를 이용하여 검색한 결과 7개의 유전자를 발견하였고 이 중 6개는 EXR4에 속하였고 1개는 EXPB에 속하였으며 벼와 애기장대에서 발견된 ES와 EXLB는 발견되지 않았다. 벼와 애기장대 유전자와의 계통학적인 분석 결과 발견된 담배의 유전자는 계통수에서 비교적 고르게 분포하고 있는 것을 알 수 있었다.
- 4). 이들 유전자를 이용하여 추정된 아미노산 서열 을 비교적 보존되어있지 않은 signal peptide 부분 을 제거한 상태로 컴퓨터프로그램을 이용하여 분석한 결과 6개는 EXPA에 속하였고 1개는 EXPB에 속하였다. 그리고 담배에서는 벼와 애기장대에서 공 히 발견된 EXLA와 EXLB에 속하는 유전자가 하나 도 발견이 안 되어서 아직 담배의 유전자은행이 불 완전하다는 것을 알 수 있다.
- 종 합적으로 평가할 때 callus의 중량증가는 세포수의 증가보다는 세포의 크기가 커진 결과에 의한다고 생각된다. 이러한 결과는 expansin 유전자를 이용하여 식물을 형질전환한 경우 식물체의 크기가 증가하고 세포의 크기도 증가한다는 기존의 결과 (Cho and Cosgrove, 2000; Choi et al; 2003)와 일 치한 결과이며 실험에 사용된 유전자들이 세포내에서 정상적으로 발현되었음을 보여준다.
- 형질전환된 세포를 액체배지에 현탁하여 하루 동안 배양한 후 현미경과 디지털사진기를 이용하여 사진을 촬영한 후 세포의 길이와 폭을 측정한 결과 (Table 1) 세포의 길이는 대조구에 비하여 12%에서 28%가 증가하였으나 세포의 폭은 OsEXPB3의 경우 3% 감소하였고 OsEXPB4, OsEXPB6, OsEXPA4는 각각 1%, 20%, 25%가 증가하였다. 종 합적으로 평가할 때 callus의 중량증가는 세포수의 증가보다는 세포의 크기가 커진 결과에 의한다고 생각된다. 이러한 결과는 expansin 유전자를 이용하여 식물을 형질전환한 경우 식물체의 크기가 증가하고 세포의 크기도 증가한다는 기존의 결과 (Cho and Cosgrove, 2000; Choi et al; 2003)와 일 치한 결과이며 실험에 사용된 유전자들이 세포내에서 정상적으로 발현되었음을 보여준다.
- 형질전환된 세포를 액체배지에 현탁하여 하루 동안 배양한 후 현미경과 디지털사진기를 이용하여 사진을 촬영한 후 세포의 길이와 폭을 측정한 결과 (Table 1) 세포의 길이는 대조구에 비하여 12%에서 28%가 증가하였으나 세포의 폭은 OsEXPB3의 경우 3% 감소하였고 OsEXPB4, OsEXPB6, OsEXPA4는 각각 1%, 20%, 25%가 증가하였다. 종 합적으로 평가할 때 callus의 중량증가는 세포수의 증가보다는 세포의 크기가 커진 결과에 의한다고 생각된다.
후속연구
- , 1997) 애기 장대보다는 29배, 벼보다는 9배정도 게놈의 크기가 커서 expansin 유전자가 최소한 벼나 애기장대와 비슷한 수로 존재할 것으로 추정된다. 그럼에도 불구하고 현재 총 7개의 유전자가 발견된 것으로 보 아 앞으로 담배의 게놈이 분석된다면 더 많은 expansin 유전자가 발견될 것으로 예상된다.
- 이번 실험은 담배의 유전자가 아닌 벼의 유전자 를 이용하여 담배를 형질전환한 결과인데 앞으로 담배를 형질전환을 통하여 신품종을 개발하는 경우 다른 식물의 유전자를 이용할 수도 있겠으나 기존의 담배의 유전자를 이용하는 것이 가장 좋을 것으로 사료되고 특히 유전자의 발현을 증가시키는 경우에는 다른 식물의 유전자를 이용하는 것이 별 문제가 없어 보이나 기존의 유전자를 antisense 기술 이나 RNAi 기술을 이용하여 유전자 발현을 억제하는 경우 담배의 유전자를 거의 모두 알고 있어야 체계적인 접근이 가능하다. 이에 따라 database의 유전자 검색을 통하여 담배의 유전자를 검색하여 보았다.
- , 2005)과 경상대학교의 AC, DS line이 확보되어 있어 expansin의 연구에 크게 도움이 될 것으로 기대하고 있다. 하지만 expansin의 경우 매우 큰 redundancy를 보이고 있어 하나의 유전자의 knock-out mutant는 형질에 변화가 없을 가능성이 커서 중복돌연변이를 만들어 야 할 것 같고 각각의 단백질에 대한 특이적인 항 체의 생산도 이러한 연구에 큰 도움이 될 것이다. 지금까지 비교적 잘 연구된 EXPA와 pollen allergen (주로 꽂가루에서 발현되는 EXPB)과 달리 vegetative EXPB, EXLA, EXLB에 대해서는 아직 그 기능을 잘 모르-고 있는 실정이다.
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