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문제 정의
- Retrovirus의 미세주입이 1세포기 수정란의 생존율에 미치는 영향을 확인하고자 다음의 연구를 진행하였다. 1세포기 수정 란에 20 nL의 농축된 virus 혹은 대조군으로 기존의 방법으로 사용하였던 naked 유전자 미세주입하고 배양 4일차 수정 란에서 배아의 생존율을 조사하여 그 결과를 Table 3에 나타내었다.
- 본 연구는 이론적으로 모자이크가 나타날 확률이 낮으며, 주입한 외래유전자가 성세포에 도입될 확률이 상대적으로 높은 1 세포기 수정란에 retrovirus를 미세주입하는 새로운 방법과 기존에 확립된 형질전환 닭 생산 방법인 배반엽 단계 수정란에 retrovirus를 이용하는 방법간의 외래유전자 도입 효율성을 서로 비교하고자 하였다.
제안 방법
- 조사하였다. 다음으로 수정란의 생존율에 영향이 없는 polybrene의 농도 범위에서 vims의 감염이 최적인 농도를 확인하고자, virus와 각각 0, 10, 그리고 100 "잉mL 농도의 polybrene이 혼합된 1,000 nL의 virus를 세포질에 주입하고, 배양 3일차의 수정 란에서 주입한 GFP virus의 발현양상을 관찰하여 최적의 polybrene의 농도를 결정하였다.
- 1세포기 닭의 수정란에 retrovirus 미세주입 적용에 앞서, 최적의 실험 조건들을 확립하고자 1세포기 수정란에 비해 비교적 배양이 쉬운 배반엽 단계의 수정란에서 polybrene 농도에 따른 수정란의 생존율 및 외래 주입유전자의 발현율을 조사하였다.
- Table 3 연구 결과는 배양 4일차에서 수정 란의 생존율은 기존의 naked DNA 미세주입방법에 비해 다소 낮은 것으로 나타났으나, 상호간 유의성은 없는 것으로 나타났다. 1세포기 수정 란에 retrovirus 미세주입은 배반엽 단계에서 확립된 polybrene의 농도 조건으로 수행하였다. 연구 결과는 배양 4일차 수정란에서 주입한 외래유전자인 GFP의 발현이 관찰되지 않았다(Fig.
- 1세포기 수정란의 체외배양은 Perry and Mather(1991)의 방법을 약간 수정한 본 연구실의 지침서(전, 2000)에 준하여 수행하였다. 1세포기 수정란의 체외배양을 위한 배양 용기로는 공여계가 도살되기 전에 산란한 알의 무게와 동일한 신선란을 선별하여 예단부를 직경 3.
- Retrovirus 의 생산은 293mGPHY 세포에 calcium phosphate (Sigma) 방법으로 두 종류의 pVSV-G와 pRSV-GFP plasmid들을 transfection 하고, 배양 72시간 후에 배지를 수거하는 방법으로 virus를 생산하였고, 초고속원심분리기를 사용하여 생산된 virus를 농축하였다. 농축한 retrovirus] titer는 검증은 생쥐의 NIH/3T3 세포에 세포 배양액을 이용하여 10배씩 순차적으로 희석한 virus를 감염시키고, 배양 접시상에서 crystal violet(Sigma) 시약으로 염색하여 G-418 항생제에 저항성을 가지는 세포 군집의 수를 세는 방법으로 수행하였다.
- Louis, MO, USA)의 농도가 10 ug/mL되게 첨가하였다. 그리고 배양 3일차에 800 ug/mL 농도의 G-418 항생제(Sigma)를 포함하는 G-418 선별배지로 교환하고, 배지는 3일에 한번 교환하였고, 대조구 세포군이 완전히 죽을 때까지 2주 동안 지속적으로 수행하였다.
- virus를 농축하였다. 농축한 retrovirus] titer는 검증은 생쥐의 NIH/3T3 세포에 세포 배양액을 이용하여 10배씩 순차적으로 희석한 virus를 감염시키고, 배양 접시상에서 crystal violet(Sigma) 시약으로 염색하여 G-418 항생제에 저항성을 가지는 세포 군집의 수를 세는 방법으로 수행하였다. Fig.
- 다음으로 virus의 감염률에 영향을 미치는 최적의 polybrene의 농도를 찾고자, 수정란의 발생에 영향이 없는 범위인 0~100 ug/mL 사이에서 아래의 연구들을 진행하였다. 실험은 polybrene의 농도를 각각 0, 10, 그리고 100 ug/mL를함유한 1,000 nL 의 농축한 virus들을 배반엽 단계 수정란의 세포질에 주입하고, 배양 3일차 수정란에서 GFP 유전자의 발현양상으로 판별하였다.
- 먼저 DMEM 배지에 polybrene-2] 농도를 0, 10, 100, 그리고 300 ug/mL으로 달리하여 수정란의 세포질에 1,000 nL의 polybrene 혼합액을 주입하였다. 배양 3일차 수정란의 생존율은 polybrene의 농도가 300 ug/mL인 경우를 제외하고 비슷한 결과를 나타내었으나, 300 ug/mL 농도의 실험군은 생존율이 극명하게 저하되는 결과를 나타내었다(Table 1).
- 생산된 vims의 titer는 아래의 순서로 검증하였다. 먼저 virus의 감염 전날에 IxlO4 5 * * NIH/3T3 세포를 6-well plate에 심고, 다음날 배양 배지에 10배씩 순차적으로 희석한 viurs를 세포에 감염시켰고, 더불어 virus 감염의 과정에 polybrene(Sigma, St. Louis, MO, USA)의 농도가 10 ug/mL되게 첨가하였다. 그리고 배양 3일차에 800 ug/mL 농도의 G-418 항생제(Sigma)를 포함하는 G-418 선별배지로 교환하고, 배지는 3일에 한번 교환하였고, 대조구 세포군이 완전히 죽을 때까지 2주 동안 지속적으로 수행하였다.
- 먼저 virus의 감염을 도와주는 물질인 polybrene이 닭의 수정란 발생에 영향이 없는 농도 범위를 확립하고자, 배반엽단계 수정란에 각각 0, 10, 100, 그리고 300 ug/mL 농도의 polybrene/DMEM(Gibco, Grand Island, NY, USA) 혼합액 1,000nL를 수정란의 세포질에 주입하고, 배양 3일차에 polybrene의농도에 따른 수정란의 생존율을 발생과 발생 중지란들을 대상으로 조사하였다. 다음으로 수정란의 생존율에 영향이 없는 polybrene의 농도 범위에서 vims의 감염이 최적인 농도를 확인하고자, virus와 각각 0, 10, 그리고 100 "잉mL 농도의 polybrene이 혼합된 1,000 nL의 virus를 세포질에 주입하고, 배양 3일차의 수정 란에서 주입한 GFP virus의 발현양상을 관찰하여 최적의 polybrene의 농도를 결정하였다.
- 세포질에 미세 주입하였다. 배자의 생존율과 발현율은 배양 4일차 배자에서 전언한 방법과 동일한 방법으로 조사하였다.
- 실험은 polybrene의 농도를 각각 0, 10, 그리고 100 ug/mL를함유한 1,000 nL 의 농축한 virus들을 배반엽 단계 수정란의 세포질에 주입하고, 배양 3일차 수정란에서 GFP 유전자의 발현양상으로 판별하였다.(fig.
- 35로 조정하여 사용하였다. 이와 같이 준비된 배양액 5 mL를 대리난각에 채운 후, 채란된 1세포기 수정란을 이식하였다. 이식 후 1회용 배양접시로 대리난각의 입구를 덮고 41.
- 채란 당일 산란 후 2시간 15분 후에 공여계를 도살하고, 복부로부터 1세포기 수정란이 들어있는 난관 팽대부에서 협부까지의 난관을 외과적 수술 방법으로 들어낸 다음, 협부와 수정란까지의 길이를 측정한 뒤 난관을 벗겨내고 1세포기 수정란을 채란하였다.
- Table 2의 결과는 polybrene의 농도가 0~100 ug/mL 범위에서 배아의 GFP 발현양상에 유의적인 차이를 나타내지 않음을 보여주고 있다. 최종적 인 polybrene의 농도는 Table 2의 연구 결과와 배반엽 단계 수정란에서 10 ug/mL의 polybrene 농도를 사용하였던 연구 결과들(Kwon et al., 2004; Chapman et al., 2005)의 상황들을 고려하여 이후 진행한 실험들에서 polybrene의 농도를 10 ug/mL으로 고정하였다.
대상 데이터
- 1세포기 수정란을 제공하는 공여계(donor hen)의 선발은, 클러치당 5개 이상의 계 란을 산란하는 개체 135수를 선발하고, 채란 이틀 전 동일계통의 수탉 정액을 이용하여 인공수정하였다. 채란 당일 산란 후 2시간 15분 후에 공여계를 도살하고, 복부로부터 1세포기 수정란이 들어있는 난관 팽대부에서 협부까지의 난관을 외과적 수술 방법으로 들어낸 다음, 협부와 수정란까지의 길이를 측정한 뒤 난관을 벗겨내고 1세포기 수정란을 채란하였다.
- Retroviral vector(pRSV-GFP)와 virus producing cell(293mGPHY)은 대구가톨릭대 김태완 교수님으로부터 제공받아사용하였다. 세포배 양, virus 생산, 그리고 virux의 농축은 Kwon et, al.
- 본 실험에 사용한 실험계와 수정란은 축산연구소에서 보유 중인 갈색 산란계와 동종이 산란한 수정란들을 사용하였다. 공시동물의 사육실은 외부 공기를 Pre-filter와 Medium filter로 2중 여과를 시켜서 사육실 내부로 공급하여 청정도 (진집효율 99% 이상)를 유지하였다.
데이터처리
- 모든 얻어진 실험 결과들의 통계분석은 Statistical Analysis System(SAS, 1996)을 이용하여 5% 유의수준에서 T-test 및 duncan의 다중검증을 실시하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 세포배 양, virus 생산, 그리고 virux의 농축은 Kwon et, al.(2004)이 제시한 방법들에 준하여 수행하였다. 생산된 vims의 titer는 아래의 순서로 검증하였다.
성능/효과
- 결론적으로 본 연구 결과는 가장 효율적인 형질전환 닭 생산 방법은 배반엽 단계에 retrovirus를 주입하는 방법임을 다시 한번 보여주고 있다.
- 더불어 virus가 IO?~105이 희석된 경우는 군집의 수가 너무 많아 정확한 군집수의 파악이 불가하였으나, 이 희석된 virus를 감염한 세포군에서 대략 100여개의 군집을 형성함을 보여주고 있다. 따라서 연구에 이용된 virus의 titer는 대략적으로 biff cfh가 됨을 확인하였다.
- 혼합액을 주입하였다. 배양 3일차 수정란의 생존율은 polybrene의 농도가 300 ug/mL인 경우를 제외하고 비슷한 결과를 나타내었으나, 300 ug/mL 농도의 실험군은 생존율이 극명하게 저하되는 결과를 나타내었다(Table 1). Table 1의 연구 결과는 polybrene의 농도가 0~100 ug/mL 사이에서 배아의 생존 및 발생과정에 큰 영향이 없음을 보여주었으며, 기존의 연구 결과들에서 발표하였던 polybrene의농도 범위들과 일치하였다(Kwon et al, 2004; Mozdziak et al.
- 1은 102~106으로 희석한 而诟를 감염시킨 경우와 그렇지 않은 NIH73T3 세포를 crystal violet으로 염색한 결과이다. 연구 결과는 virus를 감염시키지 않은 대조구를 제외한 세포들에서 항생제에 저항성을 가지는 세포 군집들이 형성됨을 보여주고 있다. 더불어 virus가 IO?~105이 희석된 경우는 군집의 수가 너무 많아 정확한 군집수의 파악이 불가하였으나, 이 희석된 virus를 감염한 세포군에서 대략 100여개의 군집을 형성함을 보여주고 있다.
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