In order to investigate the of effects of nalbuphine on immune system in mice, we examined the various immunological parameters. After single oral administration of nalbuphine (130, 260, 390 mg/kg, i.p.) to female ICR mite, the weights of bodies and organs (thymus, spleen, liver, kidney), and hemato...
In order to investigate the of effects of nalbuphine on immune system in mice, we examined the various immunological parameters. After single oral administration of nalbuphine (130, 260, 390 mg/kg, i.p.) to female ICR mite, the weights of bodies and organs (thymus, spleen, liver, kidney), and hematological parameters were examined on day 2, 4, 6, and 8. The increased rate of body weight, relative weight of organ, and hematological parameters in nalbuphine -treated groups, were not significantly changed when compared with control group. However, number of WBC was decreased by the treatment of nalbuphine. To assess the effects of nalbuphine on humoral immune responses, splenic IgM plaque forming cell (PFC) and serum IgM were assayed. When nalbuphine wat administered after immunization with SRBC, but not before immunization, splenic IgM PFC and ,serum IgM level against SRBC were significantly lowered in a dole -dependent manner. These results indicate that the suppressive effects of nalbuphine on primary humoral immune response may be dependent on the timing of its administration relative to the initial antigenic sensitization.
In order to investigate the of effects of nalbuphine on immune system in mice, we examined the various immunological parameters. After single oral administration of nalbuphine (130, 260, 390 mg/kg, i.p.) to female ICR mite, the weights of bodies and organs (thymus, spleen, liver, kidney), and hematological parameters were examined on day 2, 4, 6, and 8. The increased rate of body weight, relative weight of organ, and hematological parameters in nalbuphine -treated groups, were not significantly changed when compared with control group. However, number of WBC was decreased by the treatment of nalbuphine. To assess the effects of nalbuphine on humoral immune responses, splenic IgM plaque forming cell (PFC) and serum IgM were assayed. When nalbuphine wat administered after immunization with SRBC, but not before immunization, splenic IgM PFC and ,serum IgM level against SRBC were significantly lowered in a dole -dependent manner. These results indicate that the suppressive effects of nalbuphine on primary humoral immune response may be dependent on the timing of its administration relative to the initial antigenic sensitization.
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제안 방법
)로 채혈하여 EDTA (K3)가 들어있는 시험관(Sherwood medical)에 취하고 roll mixer로 혼화한 후 WBC (white blood cell), RBC (red blood cell), HGB (hemoglobin), HCT (hematocrit), MCV (mean corpuscular volume), MCH (mean corpuscular hemoglobin), MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration), PLT (plalelet)를 Coulter counter (T-890, Coulter)로 측정하였다. Coulter counter는 사용 전에 4C® plus 액으로 WBC, RBC, HGB, HCT, PLT값을 표준용액에 맞게 보정한 후 혈액을 분석하였다.
Blocking buffer로 500배 희석한 anti-mouse IgM alkaline phosphatase conjugate를 각 well에 100μL씩 가하여 37℃에서 1시간 방치시킨 후 기질용액 (p-nitro- phenyl phosphate) 100|iL/well를 가하여 37"C에서 30분 경과 후, 1 N-NaOH를 각 well당 50|iL씩 가 하여 반응을 종료시 켰다. Microplate reader (Dyna- tech MR5000, U.S.A.)로 각 well의 optical density (O.D., 405 nm)를 측정하고 대조군의 흡광도와 비교하였다 .
Nalbuphine을 130, 260, 390 ㎎/㎏ 용량으로 마우스의 복강 내에 주사한 후, 2, 4, 6, 8일째 에 체중증 가율과 체중에 대한 장기중량비를 측정하였다.
Nalbuphine이 SRBC항원에 대한 일차 체액성 면역반응에 미치는 영향을 보기 위하여 항원주사 2일 후 nalbuphine을 마우스에 130, 260, 390 ㎎/㎏으로 투여하고, 항원주사 후 4일째에 실험동물의 비장과 혈액을 채취하여 비장세포 중 IgM항체 생성 세포 수와 혈청중의 IgM항체 생성정도를 측정하였다.
Cunningham의 방법 (Cunnigham and Szenberg, 1968)을 약간 변형시킨 방법 (Loren, 1974)을 이용하여 IgM PFC수를 측정하였다. SRBC부유액 (5x 109 cells/mL) 0.5 mL, guinea pig complement 0.3 mL, 10% FBS-HBSS용액 2.0 mL를 혼합한 액 50 |1L와 비장세포 현탁액 (2x 106 cells/mL) 50 μL를 혼합하여 microchamber에 35 |1L씩 주입하고, vaseline과 paraffin (1 : 1) 혼액으로 밀봉하여 37℃ 에서 1시간 방치한 후 형성되는 용혈반 생성 세포수를 현미경하에서 측정하였다. 측정된 PFC수를 비장세포 106개중의 항체생성 세포수로 환산하여 나타내었다.
, 1994) 등이 면역 억제를 유발한다고 보고되었다. 그런데 nalbuphine이 생체의 면역계에 미치는 영향에 관한 연구는 별로 보고된 바가 없으므로 본 연구에서는 마우스에 nalbuphine 을 투여하여 체중 및 장기무게 변화, 혈액학적 변화와 면양적혈구 (SRBC) 항원주사 전과 후에 nal- buphine을 투여하여 비장세포 중의 용혈반 생성 세포수 (PFC수)와 혈청중의 IgM항체 생성 정도를 측정하여 일차 체액성 면역반응에 미치는 영향을 검토하였다.
마우스의 안정맥총에서 heparinized capillary (Chase instruments Co.)로 채혈하여 EDTA (K3)가 들어있는 시험관(Sherwood medical)에 취하고 roll mixer로 혼화한 후 WBC (white blood cell), RBC (red blood cell), HGB (hemoglobin), HCT (hematocrit), MCV (mean corpuscular volume), MCH (mean corpuscular hemoglobin), MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration), PLT (plalelet)를 Coulter counter (T-890, Coulter)로 측정하였다. Coulter counter는 사용 전에 4C® plus 액으로 WBC, RBC, HGB, HCT, PLT값을 표준용액에 맞게 보정한 후 혈액을 분석하였다.
면역 일 (day 0)로부터 4일 후에 모든 실험동물군 의 비장을 적출하여 빙냉의 HBSS에 넣고 teflon pestle을 이용하여 100 mesh stainless sieve를 통과 시켜 비장세포액을 만들었다. 이 세포액에 RBC lysis buffer를 가한 후 원심분리 (1,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 적혈구를 용혈시킨 후 상등액을 제거하고 침전된 비장세포에 일정량의 HBSS용액을 가하여 viable cell을 trypan blue exclusion method (Mis- chell and Shiigi, 1980)로 측정하여 2 x Itfcells/mL 의 비장세포 현탁액을 만들었다.
이와 같이 산출 된 nalbuphine의 LD50의 20, 40, 60%에 해당하는 130 (저용량), 260, 390(고용량) ㎎/㎏용량을 마우스에 1회 복강 내에 주사하였다. 모든 실험에서 실험 군당 마우스를 6마리로 하고, 대조군에는 생리식 염수를 같은 방법으로 투여하였다.
일차면역에서 비장세포의 IgM항체 용혈반 생성 세포수(plaque forming cell: PFC)를 측정하기 위한 항원으로 한국유니온랩에서 구입한 면양적혈구 (sheep red blood cell: SRBC)를 4℃에 보관하여 3 주이내에 사용하였다. 사용직전 PBS용액으로 3회 원심세척 (2, 500 rpm, 5 min, 4℃)한 후, SRBC농도가 2x Hfcells/mL가 되도록 PBS용액으로 조정하였으며, 이 부유액 0.2 mL (4 X IO® cells)을 면역 일 (day 0)에 모든 실험동물의 복강내에 주사하였고, nalbuphine 을 농도별로 면역 2일 전 또는 2일 후에 투여 하였다.
3~4주령인 ICR계 암컷 마우스를 유한양행 중앙연구소로부터 분양받아 고형사료와 물을 자유롭게 공급하면서 실험동물실에서 2~3주간 적응시킨 후, 건강상태가 양호한 6~8주령 (25±2g)의 마우스를 실험에 사용하였다. 실험동물실의 온도는 21 ~ 24℃, 습도는 40~60%로 유지하였고 조명은 12시간 간격으로 조정하였다.
실험직전에 보관된 혈청을 5SC에서 30분간 방치하여 불활성화 시켜 사용하였으며, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)로 혈청 중 IgM항체 를 측정하였다. 즉, anti-mouse IgM 을 0.
면역 일 (day 0)로부터 4일 후에 모든 실험동물군 의 비장을 적출하여 빙냉의 HBSS에 넣고 teflon pestle을 이용하여 100 mesh stainless sieve를 통과 시켜 비장세포액을 만들었다. 이 세포액에 RBC lysis buffer를 가한 후 원심분리 (1,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 적혈구를 용혈시킨 후 상등액을 제거하고 침전된 비장세포에 일정량의 HBSS용액을 가하여 viable cell을 trypan blue exclusion method (Mis- chell and Shiigi, 1980)로 측정하여 2 x Itfcells/mL 의 비장세포 현탁액을 만들었다.
)는 650 ㎎/㎏이었다. 이와 같이 산출 된 nalbuphine의 LD50의 20, 40, 60%에 해당하는 130 (저용량), 260, 390(고용량) ㎎/㎏용량을 마우스에 1회 복강 내에 주사하였다. 모든 실험에서 실험 군당 마우스를 6마리로 하고, 대조군에는 생리식 염수를 같은 방법으로 투여하였다.
실험직전에 보관된 혈청을 5SC에서 30분간 방치하여 불활성화 시켜 사용하였으며, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)로 혈청 중 IgM항체 를 측정하였다. 즉, anti-mouse IgM 을 0.05% NaNj -PBS (1 : 1000)로 희석하여 96well microtiter tray 에 well당 5O|1L씩 도포한 후 4℃에서 18시간 방치하여 anti-mouse IgM이 well 바닥에 부착되도록 하였다.
항원주사 2일전 (day-2)에 nalbuphine을 마우스에 130, 260, 390㎎/㎏으로 투여하고, 항원주사 후 4일째에 비장과 혈액을 채취하여 비장세포 중 IgM 항체 생성 세포수와 혈청 중 IgM항체량를 측정하여 nalbuphine 이 일차 체액성 면역반응에 미치는 영향을 알아보았다.
대상 데이터
3~4주령인 ICR계 암컷 마우스를 유한양행 중앙연구소로부터 분양받아 고형사료와 물을 자유롭게 공급하면서 실험동물실에서 2~3주간 적응시킨 후, 건강상태가 양호한 6~8주령 (25±2g)의 마우스를 실험에 사용하였다. 실험동물실의 온도는 21 ~ 24℃, 습도는 40~60%로 유지하였고 조명은 12시간 간격으로 조정하였다.
실험물질 nalbuphine . HC1 은 (주)제일 약품에서 분양받았으며, 마우스 체중 Wg당 0.1 mL 투여할 수 있는 농도로 생리식염수에 용시 조제하여 사용하였다. Nalbuphine의 투여용량을 결정하기 위하여 ICR 암컷 마우스에 용량별로 (500, 550, 600, 650, 700, 750㎎/㎏) 1회 복강내 주사한 후 생사여부를 14일간 관찰하고 Litchfield & Wilcoxon법 (Litchfield and Wilcoxon, 1943)을 이용하여 I.
일차면역에서 비장세포의 IgM항체 용혈반 생성 세포수(plaque forming cell: PFC)를 측정하기 위한 항원으로 한국유니온랩에서 구입한 면양적혈구 (sheep red blood cell: SRBC)를 4℃에 보관하여 3 주이내에 사용하였다. 사용직전 PBS용액으로 3회 원심세척 (2, 500 rpm, 5 min, 4℃)한 후, SRBC농도가 2x Hfcells/mL가 되도록 PBS용액으로 조정하였으며, 이 부유액 0.
데이터처리
각 실험군의 측정값의 평균과 표준편차를 구하고, 대조군과의 차이를 student's t-test를 이용하여 유의성을 검정하였다.
이론/모형
Cunningham의 방법 (Cunnigham and Szenberg, 1968)을 약간 변형시킨 방법 (Loren, 1974)을 이용하여 IgM PFC수를 측정하였다. SRBC부유액 (5x 109 cells/mL) 0.
성능/효과
Fig. 2에서 보여지는 바와 같이 비장세포 "개 당 PFC수는 대조군에 비해 용량의존적으로 감소 하였고, 특히 LD50의 60%에 해당하는 nalbuphine 390㎎/㎏투여군에서는 대조군에 비해 유의성 있게 (p< 0.01) 현저히 감소하였다.
Nalbuphine . HC1 을 투여 용량 (LD50의 20, 40, 60%에 해당하는 양인 130, 260, 390㎎/㎏)과 투여 일을 변화시켜 마우스 복강 내에 주사한 후, 체중, 장기무게 및 혈액학적 parameters에 미치는 영향을 측정한 결과, 백혈구수는 투여 후 6일째에 감소되었고, 저용량의 경우에는 8일째에는 대조군과 비슷 하여져 회복되는 경향을 보였으나, 고용량의 경우에는 회복되지 않았다. 체중의 증가율, 장기중량비 및 WBC를 제외한 혈액학적 parameters는 대조군에 비해 큰 변화를 나타나지 않았다.
1 mL 투여할 수 있는 농도로 생리식염수에 용시 조제하여 사용하였다. Nalbuphine의 투여용량을 결정하기 위하여 ICR 암컷 마우스에 용량별로 (500, 550, 600, 650, 700, 750㎎/㎏) 1회 복강내 주사한 후 생사여부를 14일간 관찰하고 Litchfield & Wilcoxon법 (Litchfield and Wilcoxon, 1943)을 이용하여 I.D50)을 산출한 결과, LD50 (i.p.)는 650 ㎎/㎏이었다. 이와 같이 산출 된 nalbuphine의 LD50의 20, 40, 60%에 해당하는 130 (저용량), 260, 390(고용량) ㎎/㎏용량을 마우스에 1회 복강 내에 주사하였다.
SRBC항원주사 전에 nalb叩hine을 투여했을 때 에는 저용량에서 비장세포의 용혈반생성 세포수 (PFC)와 IgM항체 생성이 유의성없이 다소 증가하는 경향을 보이고 고용량에서는 대조군과 비슷하였다. 그러나 항원주사 후에 nalb叩hine을 투여했을 경우에는 용혈반 생성 세포수와 IgM항체 생성 이 용량의존적으로 유의성 있게 현저히 감소되었다.
실험동물의 혈청 중 IgM항체 량 (Table 4)도 대조군에 비해 nalbuphine 130 ㎎/㎏투여군에서 약간 증가하는 경향을 보였으나 유의성은 없었으며, 나머지 투여군에 있어서는 거의 비슷하여 PFC와 유사한 결과를 나타내었다.
실험물질 투여일의 체중을 기준(100)으로 하여 각 실험 일의 체중 증가율을 관찰한 결과, nalbuphi- ne의 체중 증가율은 대조군과 유사하였다 (Table I).
실험시작하기 전 약 16시간동안 절식하여 체중을 측정하였으며, 체중변화는 nalbuphine 투여일의 체중을 기준(100)으로 하여 실험일의 증가된 체중 으로 나타내었다. 또한, 각 장기무게 변화는 실험일 에 실험동물의 비장, 흉선, 간장, 신장을 적출하여 각각의 무게를 실험일의 체중에 대한 백분율(%)로 나타내었다.
이 결과들을 볼 때 항원접촉 전에 nalbuphine 투여를 할 경우에는 비장세포 중 PFC수와 혈중 IgM 항체량이 크게 변화되지 않아 일차 체액성 면역반응에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보여진다.
이상의 실험결과, 항원주사 전에 nalbuphine이 투여되면 일차 체액성 면역 반응에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 보여졌으나, 항원주사 후에 nalbuphine이 투여되면 일차 체액성 면역 반응이 용량의존적으로 현저히 억제되었다.
그러나 항원주사 후에 nalb叩hine을 투여했을 경우에는 용혈반 생성 세포수와 IgM항체 생성 이 용량의존적으로 유의성 있게 현저히 감소되었다. 이상의 연구결과, nalbuphinee 항원과 접촉 전에 생체에 투여되면 마우스의 일차 체액성 면역반응에 크게 영향을 주지 않으나, 항원접촉 후에 투여 되면 일차 체액성 면역반응을 억제시키는 것으로 보인다.
혈중 IgM항체도 PFC의 결과와 같이 대조군에 비해 nalbuphine 투여군의 IgM항체량은 용량의 존적으로 감소했으며, 특히 260, 390 ㎎/㎏투여군에서 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.이)감소하였다 (Table 5).
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