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문제 정의
- 본 연구에서는 장관손상을 알아보기 위하여 장투과성 검사와 장관에서의 지질과산화 측정 뿐만 아니라 백서의 식이량과 체중 변화와 더불어 혈청 내 단백과 알부민 수치를 측정하였다. 실험동물에서 비스테로이드성 항염제에 의한 장관손상 시 체중 변화가 없으며 식이량이 일정하다면 간기능 수치의 변화 없이 변화하는 혈청 내의 단백과 알부민 수치는 비스테로이드성 항염제에 의한 장관에서의 단백소실을 대변한다.
- 이에 본 연구에서는 비스테로이드성 항염제에 의한 장내세균 전위 및 지질과산화 유발 백서에서 글루타민의 효과를 알아보았다.
제안 방법
- 배양 후 각 배지에서 자란 집락 수를 관찰하여 CFU(colony-forming unit)/g 으로 표시하였다. 장내세균전위를 알아보기 위하여 장간막림프절, 간, 비장 및 신장 100 mg을 소독된 Ten Broeck 조직파쇄기를 이용하여 균질화한 후 연속적으로 희석하고 그람 음성균 수를 측정하기 위하여 MacConkey 한천배지에 접종하여 배양기에서 37℃로 2"]간 동안 배양하였다. 배양 후 각 배지에서 자란 집락 수를 관찰하여 CFU(colony-forming unit)/g로 표시하였다.
- Diclofenac 투여 48시간 후에 10 mg의 phenolsulfonphthalein (PSE Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA}을 백서에 경구 투여 후 대사케이지에서 PSP 투여 2시간 후부터 24시간 동안 소변을 수집하였다. 채집된 소변에서의 PSP 농도를 구하기 위하여 증류수로 부피를 일정하게 한 후 2, 500 rpm, 10분간 원심분리 하였다.
- 5 및 l.O0kg/day의 용량으로 일일 2차례 금속 경구 투여 관을 이용하여 경구투여 하였으며 대조군과 diclofenac 투여 군은 대조 약물로 생리식염수를 같은 방법으로 경구투여 하였다. 장관 손상과 장내세균전위에 대한 동물실험들에서 대부분 글루타민을 병태 유발 3일 이전부터 투여해야 효과가 있었으며 1.
- 간, 비장, 신장 및 소장의 각 조직을 절단하여 무게를 잰 후 10배의 0.1 M phosphate buffer를 가한 후 Ten Broeck 조직파쇄기를 이용하여 분쇄하여 조직 균질액을 제조하였다. 조직 및 혈장 중 과산화지질은 TBA를 이용한 비색법으로 측정하였다.
- 매일 백서의 물과 사료의 섭취량과 몸무게의 변화를 측정하였다. 밑망을 설치하여 배설물이나 깔집 등 음식물이 아닌 것을 섭취흐}는 것을 방지하였다.
- 백서들은 실험 시작 전 감염이나 기타 이상소견이 관찰되지 않았다. 백서들은 모두 4군으로 나누었으며 대조군, diclofenac 투여군, diclofenac 및 글루타민 0.5 g/kg/day 투여군, diclofenac 및 글루타민 1.0 g/kg/day 투여군으로 하였으며 각 군 당 백서 8마리를 배정하였다.
- , Seoul, Korea)에서 공급받아 실험 전 7일간 적응시켰다. 백서의 사육 시 12시간 간격으로 낮과 밤을 구별하고 사육 온도는 22±1℃로 유지하였으며 고형사료인 Basal diet 5755(PMI Nutrition International, Inc., Richmond, California, USA)와 물을 자유롭게 섭취하게 하였다. 백서들은 실험 시작 전 감염이나 기타 이상소견이 관찰되지 않았다.
- 0以k臥lay 이하의 용량으로 충분한 효과가 보고 되었다. 비스테로이드성 항염제에 의한 장관손상은 diclofenac sodium(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 100㎎/㎏ 용량으로 일회 경구투여 하여 유발하였다.
- 채취한 혈액에서 혈액검사와 지질과산화 측정을 위하여 혈청과 혈장을 분리하였다. 장내세균 전위 유무를 알아보기 위하여 무균조작으로 장간막 림프절, 간, 비장 및 신장 100 mg을 채취하고 지질과산화 측정을 위하여 간, 비장 및 신장을 500 mg 각각 이상 채취하였다. 맹장의 장내세균 수를 측정하기 위하여 맹장을 1 cm 정도 절개한 후 대변 100 mg을 채취하였다.
- 장손상에 따른 장관에서의 단백소실을 측정하기 위하여 백서에서 채취한 혈액으로 총단백, 알부민 수치를 측정하고 총 단백 및 알부민 수치 변화가 diclofenac의 간독성에 의한 것이 아님을 증명하기 위하여 ALT AST 및 총 빌리루빈을 동시에 측정하여 비교하였다.
- 장투과성 검사를 위한 24시간 소변 채취 후 백서는 ketamine hydrochloride 80㎎/㎏ 및 xylazine hydrochloride 8㎎/㎏를 근주하여 마취한 후에 무균조작으로 복부를 정중앙에서 절개하였다. 절개 직후 맹장으로부터 상방 40 cm의 회장에서 장 내용물을 100mg을 채취하였다.
- 이후 횡경막을 절개하고 심장에서 혈액을 채취하여 백서를 사망시켰다. 채취한 혈액에서 혈액검사와 지질과산화 측정을 위하여 혈청과 혈장을 분리하였다. 장내세균 전위 유무를 알아보기 위하여 무균조작으로 장간막 림프절, 간, 비장 및 신장 100 mg을 채취하고 지질과산화 측정을 위하여 간, 비장 및 신장을 500 mg 각각 이상 채취하였다.
- 밑망을 설치하여 배설물이나 깔집 등 음식물이 아닌 것을 섭취흐}는 것을 방지하였다. 투여용량 증가에 따른 글루타민의 효과를 관찰하기 위해 글루타민 투여군은 diclofeanc 투여 시작 5 일 전부터 L-glutamine(Daesang, Co., Ltd., Seoul, Korea)을 각각 0.5 및 l.O0kg/day의 용량으로 일일 2차례 금속 경구 투여 관을 이용하여 경구투여 하였으며 대조군과 diclofenac 투여 군은 대조 약물로 생리식염수를 같은 방법으로 경구투여 하였다.
- 회장 및 맹장에서 획득한 장내용물 100 mg을 연속적으로 희석한 후 장내 호기성균수를 측정하기 위하여 혈액한천배지와 장내 그람 음성균수를 측정하기 위하여 MacConkey 한천배지에 접종하여 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 배지에서 자란 집락 수를 관찰하여 CFU(colony-forming unit)/g 으로 표시하였다.
대상 데이터
- 7주령의 체중 180-210 gm 정도의 수컷 Sprague-Dawley 백서 32마리를 오리엔트(Orient Co., Ltd., Seoul, Korea)에서 공급받아 실험 전 7일간 적응시켰다. 백서의 사육 시 12시간 간격으로 낮과 밤을 구별하고 사육 온도는 22±1℃로 유지하였으며 고형사료인 Basal diet 5755(PMI Nutrition International, Inc.
- 절개 직후 맹장으로부터 상방 40 cm의 회장에서 장 내용물을 100mg을 채취하였다. 이후 횡경막을 절개하고 심장에서 혈액을 채취하여 백서를 사망시켰다.
데이터처리
- 모든 수치는 평균土표준편차로 표시하고 각 군 간의 차이는 SPSS 11.0 프로그램 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용하여 Mann-Whitney 검정법으로 p value가 0.05 이하인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 반응액을 3000 rpm, 15분간 원심분리한 후 상등액을 분광광도계로 535nm에서 흡광도를 측정하여 MDA(malondialdehyde) 양을 구하였다. MDA 표준물질로 1, 1, 3, 3, -tetramethoxy propane을 人}용하였으며 MDA 양은 nmol/ing protein으로 표현하고 간, 비 장, 신장 및 소장의 단백질양은 bovine serum albumiii을 표준으로 하여 Bradford 법23)을 이용하여 측정하였다.
- 1 M phosphate buffer를 가한 후 Ten Broeck 조직파쇄기를 이용하여 분쇄하여 조직 균질액을 제조하였다. 조직 및 혈장 중 과산화지질은 TBA를 이용한 비색법으로 측정하였다.22) 각 조직 균질액 및 혈장 Im/에 TBA 시액 2m2를 혼합한 후 100℃의 항온조에서 15분간 가열하여 발색시켰다.
성능/효과
- Diclofenac에 의한 간, 비장, 신장 및 혈장에서 산화적 스트레스인 지질과산화를 보기 위해 측정한 MDA 수치는 diclofenac 투여 군에서 대조군보다 상승하였다。<0.001).
- 001). 글루타민을 투여한 군에서는 소장의 그람음성균의 과증식이 감소되었고 (/><0.01), 대장의 호기성 균 및 그람음성균의 과증식이 개선되는 양상을 보였다。<0.05)(lhble IU).
- 0 g/ kg 투여군 과는 차이가 없었다. 이에 비해 비장에서는 0.5geg 의 투여량게서는 효과가 없었으나 1.0g/kg 투여시 diclofenac 단독 투여군보다 그람음성 세균수가 감소하였으며<0.01), 신장에서도 같은 양상이 관찰되었다S<0.05)(Table IV). 이와 같이 비스테로이드성 항염제에 의한 장관손상과 장내세균의 과증식을 억제흐).
- 장관장벽의 손상을 측정하기 위한 PSI를 이용한 장투과성 검사에서는 대조군보다 diclofeanc을 단독 투여한 군에서 4배 이상 증가소견을 보였으며S<0.001), 글루타민의 투여에 의해 diclofenac에 의한 장투과성의 증가가 감소하였다0vO.OOl)(Fig. 1). Diclofenac 투여에 의한 소장에서의 지질고}산화의 증가도 같은 양상을 보였다。<0.
- 장내세균전위를 관찰하기 위한 간, 비장 및 신장에서의 그람음성 세균수의 측정결과 diclofenac 투여군에서 대조군보다 장간막 림프절, 간, 비장 및 신장에서 그람음성 세균수의 증가를 관찰 할 수 있었다(»<0.001). 글루타민 투여군에서는 diclofenac 단독 투여군보다 장간막 림프절, 간, 비장 및 신장에서 그람음성 세균수가 감소하였는데, 간에서는 글루타민 투여 용량의 증가에 따라 그람음성 세균수가 감소하였으며 0.
- 001) diclofeanc을 단독 투여한 군과 차이를 보이지 않았다(Eble I). 혈액검사에서는 diclofenac 투여군에서 AST, ALT 및 총 빌리루빈 수치의 증가소견 없이 대조군보다 혈청의 총단백 및 알부민 수치가 감소하였고0VO.OO1), 글루타민을 투여한 군에서는 diclofenac을 단독 투여한 군에 비해 저단백혈증 개선0<0.05)과 저알부민혈증 개선이 관찰되었다(Eble II). 이는 diclofenac에 의한 장관손상으로 유발된 장관에서의 단백 소실이 글루타민의 투여에 의하여 개선됨을 의미한다.
후속연구
- 생각된다. 그러나 비스테로이드성 항염제에 의한 장내세균 전위와 각 장기에서의 산화적 스트레스와의 연관성에 대한 추가적인 연구가 필요하며 동물실험결과를 기초로 한 임상연구가 병행 되어야 할 것-?로 생각된다.
- 비스테로이드성 항염제 사용 전의 글루타민의 투여는 상기 약제에 의한 장관손상, 장내세균 과증식 및 장내세균전위와 지질 과산화를 억제하며, 비스테로이드성 항염제에 의한 감염성 합병증 및 다발성 장기부전의 발생과 악화의 예방에 효과적일 것으로 생각된다. 그러나 비스테로이드성 항염제에 의한 장내세균 전위와 각 장기에서의 산화적 스트레스와의 연관성에 대한 추가적인 연구가 필요하며 동물실험결과를 기초로 한 임상연구가 병행 되어야 할 것-?로 생각된다.
- 001)(Eble V). 이와 같이 각 장기에서의 MDA 변화의 차이는 각 장기의 비스테로이드성 항염제에 의한 지질과산화 및 글루타민 효과의 차이를 그 원인을 생각할 수도 있으나 아직 이에 대한 구체적인 보고가 없으므로 추가적인 연구가 필요하다.
- 는 글루타민은 상기 약제에 의한 장내세균전위를 억제하였다. 하지만 투여 용량에 따른 글루타민의 장내세균전위에 대한 효과는 각 장기에서 다양하게 관찰되며 이에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
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