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문제 정의
- 이러한 기존 연구결과를 바탕으로 본 연구에서는 현재까지 연구되지 않은 크롬의 산화상태에 따른 화장품의 안전성을 연구하고자 수용성의 3가 크롬, 6가 크롬을 대상으로 이들 중금속이 우리가 사용하고 있는 화장품에 얼마나 함유되어 있고, 이 농도는 과연 안전한지에 대해서 알아보았다. 또한 수용성의 3가 크롬과 6가 크롬에 대한 피부안전성을 평가하기 위하여 피부 감작성 시험을 실시하였다.
제안 방법
- 피부에 유해한 작용을 나타내는 중금속에 대한 연구 결과로, 1984년~1988년 및 1989년~1993년에 총 42, 839명을 대상으로 이탈리아에서 실시한 연구 결과에서는 알러지 반응을 일으키는 중금속으로 nickel sulfate, cobalt chloride 및 potassium dichromate 등의 수용성염을 보고하였고, Sainio et al.(200아은 납, 코발트, 니켈 크롬 및 비소의 문제점을 지적하고 49개 제품의 88개 색의 아이새도우에서 해당 중금속의 총 함량 및 수용성 크롬 함량을 분석하였다. Basketter et a/(1993)은 니켈, 코발트, 크롬의 접촉성 알러지 피부염에 미치는 영향에 대해 조사 하였다.
- 이러한 기존 연구결과를 바탕으로 본 연구에서는 현재까지 연구되지 않은 크롬의 산화상태에 따른 화장품의 안전성을 연구하고자 수용성의 3가 크롬, 6가 크롬을 대상으로 이들 중금속이 우리가 사용하고 있는 화장품에 얼마나 함유되어 있고, 이 농도는 과연 안전한지에 대해서 알아보았다. 또한 수용성의 3가 크롬과 6가 크롬에 대한 피부안전성을 평가하기 위하여 피부 감작성 시험을 실시하였다.
- 화장품 중에 함유되어 있는 크롬의 총 함량 분석은 충남대학교의 벤처기업인 (주)아나펙스에서 수행하였다. 시료 약 0.
- 25g을 정밀하게 달아 Microwave digestion vessel에 넣고 질산 · 불산 · 과산화수소수 ·과염소산 혼합액(4 : 3 : 1 )을 넣어 충분히 흔들어 섞은 다음 마개를 막고 Microwave digestion system을 이용하여 맑은 액이 되도록 분해시켰다. 이 액을 3차 증류수로 희석한 다음 각각 ICP-MS(lnductively Coupled Plasma Mass Spectrometer)로 분석하였다.
- 45 µm)로 여과하여 얻은 여액을 검액으로 사용하였다. 분석은 HPLC로 수행하였으며 분석조건은 Table 1과 같았다.
- Induction과 Challenge(무자극 범주의 시험 물질 농도)에 사용할 시험물질 농도를 결정하기 위하여 시험 실시 전, 암 수 각각 3마리의 Guinea Pigs에 대하여 일차 자극을 실시하였다. 각 동물에 대하여 3가지 농도의 시료를 척추를 중심으로 좌우 각각 3부위(2.
- Induction과 Challenge(무자극 범주의 시험 물질 농도)에 사용할 시험물질 농도를 결정하기 위하여 시험 실시 전, 암 수 각각 3마리의 Guinea Pigs에 대하여 일차 자극을 실시하였다. 각 동물에 대하여 3가지 농도의 시료를 척추를 중심으로 좌우 각각 3부위(2.5X25 cm) 부위당 0.5 ml씩 도포하고 가아제로 덮은 다음 비자극성 테이프로 잘 고정하여 24시간 적용하고 일차 자극을 관찰하였다.
- 3가 크롬의 경우, 보고된 안전성 시험 결과를 감안하여 임상 사용 예정량을 200 ㎎/㎏으로 하였고, 보유하고 있는 stock solution의 최고 농도가 1000 ㎎/㎏임을 감안 할 때, induction 농도는 임상 사용 예정량의 5배인 1000 ㎎/㎏, challenge 적용 농도를 200 ㎎/㎏ 이하로 잠정 설정하여 1000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏ 농도로 피부 일차 자극을 실시하였다. 6가 크롬의 경우는, 여러안전성 보고 자료에 따라 MET(Minimum Elicitation Threshold)가 9~10 ㎎/㎏인 것을 감안하여 임상적으로 사용 가능한 농도를 5 ㎎/㎏ 정도로 정하여 induction 농도는 임상 사용 예정량의 10배인 50 ㎎/㎏, challenge 적용 농도를 5 ㎎/㎏ 이하로 잠정 설정 하였고, 50 mg/ kg, 10 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏ 농도에서 일차 자극 유발 여부를 관찰하였다.
- 3가 크롬의 경우, 보고된 안전성 시험 결과를 감안하여 임상 사용 예정량을 200 ㎎/㎏으로 하였고, 보유하고 있는 stock solution의 최고 농도가 1000 ㎎/㎏임을 감안 할 때, induction 농도는 임상 사용 예정량의 5배인 1000 ㎎/㎏, challenge 적용 농도를 200 ㎎/㎏ 이하로 잠정 설정하여 1000 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏ 농도로 피부 일차 자극을 실시하였다. 6가 크롬의 경우는, 여러안전성 보고 자료에 따라 MET(Minimum Elicitation Threshold)가 9~10 ㎎/㎏인 것을 감안하여 임상적으로 사용 가능한 농도를 5 ㎎/㎏ 정도로 정하여 induction 농도는 임상 사용 예정량의 10배인 50 ㎎/㎏, challenge 적용 농도를 5 ㎎/㎏ 이하로 잠정 설정 하였고, 50 mg/ kg, 10 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏ 농도에서 일차 자극 유발 여부를 관찰하였다.
- 일차 감작을 위해 제모된 Guinea Pig의 견갑 간부에 시료, FCA( Freund's Adjuvant Complete), 시료 + FC A를 2열로 0.1 ml씩 피내주사하고, 이차 감작은 피내주사 7일째에 동일 부위를 제모한 뒤 10% SLS(Sodium Lauryl Sulfate) 용액(기제: Petrolatume을 도포하여 전처리하고 24시간 후에 시험물질을 동일 부위에 부위 당 0.5 g씩 도포하고 가아제로 덮은 다음 비자극성 테이프로 잘 고정하여 48시간 적용하고 관찰하였다.
- 감작성 유발(challenge)은 최종 감작 2주후 제모된 실험동물의 왼쪽 등부위에 시험물질을 3가지 농도로 1(1 cm patch를 이용하여 24시간 동안 폐쇄첩포한 다음, 적용 종료 후 생리식염수로 가볍게 세정하고 첩포를 제거한 다음 24, 48 및 72시간 경과시 홍반, 가피, 부종 등의 자극성 유무를 관찰하였다. 피부 반응의 평가는 식품의약품안전청 고시 제 1999-61호 의약품 등의 독성 시험 기준을 이용하여 판정(Table 4)하고, 감작성 유발 가능성에 대한 판정은 Kligman의 등급(Table 5)을 따라 실시하여, 양성반응률(Grade I 이상인 것의 백분율)이 29 %(Grade Ⅲ) 이 상일 때 allergen으로 판정하였다.
- 감작성 유발(challenge)은 최종 감작 2주후 제모된 실험동물의 왼쪽 등부위에 시험물질을 3가지 농도로 1(1 cm patch를 이용하여 24시간 동안 폐쇄첩포한 다음, 적용 종료 후 생리식염수로 가볍게 세정하고 첩포를 제거한 다음 24, 48 및 72시간 경과시 홍반, 가피, 부종 등의 자극성 유무를 관찰하였다. 피부 반응의 평가는 식품의약품안전청 고시 제 1999-61호 의약품 등의 독성 시험 기준을 이용하여 판정(Table 4)하고, 감작성 유발 가능성에 대한 판정은 Kligman의 등급(Table 5)을 따라 실시하여, 양성반응률(Grade I 이상인 것의 백분율)이 29 %(Grade Ⅲ) 이 상일 때 allergen으로 판정하였다.
- 피부에 유해한 작용을 나타내는 수용성 크롬을 그 산화 상태에 따라 분리하여 3가 크롬 및 6가 크롬으로 검출하였다. 분석할 때 6가 크롬은 쉽게 3가 크롬으로 환원되기 때문에 산화상태를 유지할 수 있는 전처리법이 중요하다.
- 6가 크롬은 대부분 chromate anion(#) 또는 dichromate anion(#)으로 존재하므로, 3가 크롬의 경우 complexation reagent를 사용하여 negatively charged complex ion으로 바꾸어 주면 HPLC에서 6가 크롬과 분리할 수 있다. 이러한 분석원리를 이용하여 본 실험에서는 3가 크롬의 경우 complexation reagent인 DCTA와 반응시켜 음이온으로 만들어 검출하였다(Padarausk et al., 1995). 검출한계는 3가 크롬의 경우 0.
- 피부 일차 자극 시험 결과, 3가 크롬의 경우 1,000 mg/ kg 이하의 농도에서 자극이 거의 관찰되지 않아 induction 은 1,000 ㎎/㎏ 농도를 사용하였으며 , challenge는 200 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏, 그리고 cross reaction 여부를 관찰하기 위하여 6가 크롬 5 ㎎/㎏을 시험에 사용하였다. 6가 크롬의 경우에는 50 ㎎/㎏ 이하의 농도에서 자극이 거의 관찰되지 않아 inductione 50 ㎎/㎏ 농도를 사용하였으며 , challenge는 5 ㎎/㎏ 및 1 ㎎/㎏ 그리고 cross reaction을 보기 위하여 3가 크롬 200 ㎎/㎏을 시험에 사용하였다.
- 피부 일차 자극 시험 결과, 3가 크롬의 경우 1,000 mg/ kg 이하의 농도에서 자극이 거의 관찰되지 않아 induction 은 1,000 ㎎/㎏ 농도를 사용하였으며 , challenge는 200 ㎎/㎏ 및 100 ㎎/㎏, 그리고 cross reaction 여부를 관찰하기 위하여 6가 크롬 5 ㎎/㎏을 시험에 사용하였다. 6가 크롬의 경우에는 50 ㎎/㎏ 이하의 농도에서 자극이 거의 관찰되지 않아 inductione 50 ㎎/㎏ 농도를 사용하였으며 , challenge는 5 ㎎/㎏ 및 1 ㎎/㎏ 그리고 cross reaction을 보기 위하여 3가 크롬 200 ㎎/㎏을 시험에 사용하였다.
- 3가 크롬과 6가 크롬의 농도 분석용 표준액은 Fluca사의 1,000 mg/l 크롬(Ⅲ)이온 표준액(chromic nitrate) 및 1,000 mg/l 크롬(VI)이온 표준액(potassium chromate)을희석하여 사용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 시료는 국내 7개 화장품 제조사와 국내에 판매되는 수입 5개사의 메이크업 화장품으로 16개 브랜드 48개 품목을 대상으로 하였다.
- 시료 용해용 산으로는 질산(69~71%, Electronic grade, Dongwoo fine-chem co.), 불산(40%, Suprapur, Merck Inc.), 과산화수소수(30~32%, Electronic grade, Dongwoo fine-chem co.) 및 과염소산(70%, Suprapur, Merck Inc.)을 사용하였으며, 화장품에 함유된 유용성 성분을 제 거하기 위한 헥산과 에탄올은 Fisher사의 HPLC grade 용매를 사용하였다. 수용성 크롬 분석용 시약인 TBAOH (Tetrabutylammonium Hydroxide)는 Dionex사에서, DCTA (1,2-diamine cyclohexane-N, N, N1, N1-tetraacetic acid)는 Fluka사에서 구입하였다.
- )을 사용하였으며, 화장품에 함유된 유용성 성분을 제 거하기 위한 헥산과 에탄올은 Fisher사의 HPLC grade 용매를 사용하였다. 수용성 크롬 분석용 시약인 TBAOH (Tetrabutylammonium Hydroxide)는 Dionex사에서, DCTA (1,2-diamine cyclohexane-N, N, N1, N1-tetraacetic acid)는 Fluka사에서 구입하였다. 아세토니트릴은 Fisher사의 HPLC grade 용매를 사용하였다.
- 수용성 크롬 분석용 시약인 TBAOH (Tetrabutylammonium Hydroxide)는 Dionex사에서, DCTA (1,2-diamine cyclohexane-N, N, N1, N1-tetraacetic acid)는 Fluka사에서 구입하였다. 아세토니트릴은 Fisher사의 HPLC grade 용매를 사용하였다.
- , MLS-1200 MEGA)을 사용하였다. 시료 내 중금속 총함량 분석은 Perkin-Elmer사의 ICP-MS Elan 6000을 사용하였다. 수용성 3가 크롬과 6가 크롬의 분석은 Waters사의 515 pump, 717 Autosampler, 996 PDA로 구성된 HPLC system을 사용하였다.
- 시료 내 중금속 총함량 분석은 Perkin-Elmer사의 ICP-MS Elan 6000을 사용하였다. 수용성 3가 크롬과 6가 크롬의 분석은 Waters사의 515 pump, 717 Autosampler, 996 PDA로 구성된 HPLC system을 사용하였다.
- 실험동물은 Hartley albino Guinea Pig을 한림실험동물(경기도 화성시 봉담읍 유리 254-1)에서 구입하여 사용 하였고, 사용개시시의 체중범위는 250~300 g이었다. 각 시험물질에 대하여 암수 각각 5마리씩 총 10마리의 동물을 사용하였다.
- 실험동물은 Hartley albino Guinea Pig을 한림실험동물(경기도 화성시 봉담읍 유리 254-1)에서 구입하여 사용 하였고, 사용개시시의 체중범위는 250~300 g이었다. 각 시험물질에 대하여 암수 각각 5마리씩 총 10마리의 동물을 사용하였다.
- 3가 크롬에 대한 시험군의 구성은 다음 Table 2와 같았으며 6가 크롬에 대한 시험군의 구성은 다음 Table 3과 같았다. 음성대조물질로는 Vehicle인 주사용증류수를 사용하였으며, 양성대조물질로는 Benzocaine을 사용하였다.
이론/모형
- 기니픽을 이용한 3가 크롬과 6가 크롬의 피부 감작성 시험은 대표적인 피부 감작성 시험법인 GPMT(Guinea Pig Maximization Test)법 (Magnusson and Kligman, 1969H 따라 태평양 기술연구원 전임상연구센타에서 수행하였다.
성능/효과
- 상기 논문들을 비롯한 관련 자료들을 바탕으로 피부 안전성에 영향을 줄 수 있는 중금속으로는 니켈, 크롬, 납, 비소 및 코발트 등이 있으며, 불용성화합물이 아닌 수용성 염의 형태가 피부를 투과할 수 있어 유해한 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있었다. 이들 금속 중 특히 크롬은 분자구조에 따라 성질 및 독성에 대한 안전성이 판이하게 달라, 3가 크롬은 인체 대사에 필요한 필수 원소이지만 6가 크롬은 폐, 간장, 신장 등에 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다.
- 이들 금속 중 특히 크롬은 분자구조에 따라 성질 및 독성에 대한 안전성이 판이하게 달라, 3가 크롬은 인체 대사에 필요한 필수 원소이지만 6가 크롬은 폐, 간장, 신장 등에 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다. 두 산화상태의 크롬을 서로 비교하면 물리적인 성질, 특히 피부 투과도면에서도 6가 크롬이 월등히 높아 피부에 대한 유해성이 매우 크다는 것을 알 수 있다. 따라서, 화장품 내 크롬 함량을 분석하여 인체 유해성 여부를 정확하게 판단하기 위해서는 총크롬의 양은 무의미하며 크롬을 3가와 6가로 나누어 분석할 필요가 있다.
- 국내외 메이크업 화장품의 수용성 3가 및 6가 크롬의 분리 분석 결과와 총 크롬 함량을 다음 Table 6에 나타내었다. 분석한 제품 중에서 피부에 직접적인 자극을 일으킬 수 있는 수용성 6가 크롬은 어떤 제품에서도 검출되지 않았으며, 수용성 3가 크롬은 8개 브랜드의 9개 제품에서 10 ㎎/㎏ 이하로 검출되었다. 총 크롬 함량은 10개 브랜드의 12개 제품에서 300 ㎎/㎏ 이상이었으며 그 외 제품에서는 최고 55 ㎎/㎏ 이하로 비교적 낮은 수준이었다.
- 분석한 제품 중에서 피부에 직접적인 자극을 일으킬 수 있는 수용성 6가 크롬은 어떤 제품에서도 검출되지 않았으며, 수용성 3가 크롬은 8개 브랜드의 9개 제품에서 10 ㎎/㎏ 이하로 검출되었다. 총 크롬 함량은 10개 브랜드의 12개 제품에서 300 ㎎/㎏ 이상이었으며 그 외 제품에서는 최고 55 ㎎/㎏ 이하로 비교적 낮은 수준이었다. 이것은 크롬화합물을 색소 원료로 사용하였는지 여부와 그 사용량에 따라 함량 차이가 크게 나타났기 때문이다.
- 총 크롬 함량이 낮은 경우에 수용성 크롬은 검출되지 않았으나 총 크롬 함량과 수용성 크롬 함량이 반드시 비례하는 것은 아니었다. 따라서, 총 크롬 함량이 높다고 무조건 위험한 것이 아니라 수용성 크롬의 함량 분석이 중요하며 특히, 인체에 위해를 미칠 수 있는 6가 크롬 함량의 분석이 중요함을 알 수 있었다.
- 임상실험 결과에서 크롬에 대한 알러지 반응을 일으킨 환자의 MET(Minimum 티icitation Threshold)는 6가 크롬에 대해 9 ㎎/㎏인 반면 3가 크롬에 대해서는 8,850 ㎎/㎏ 이었다(Allenby and Basketter, 1993). 화장품을 대상으로 실험한 다른 연구 결과에서는 아이새도우 제품을 대상으로 25개 브랜드 49개 제품의 88가지 색을 분석한 결과, 9개의 제품에서 수용성 크롬 함량이 2 ㎎/㎏을 넘었으며 2개 제품에서 10 ㎎/㎏을 초과하는 값을 나타냈다. 그 중 수용성 크롬 함량이 가장 높았던 제품은 그 함량이 318 ㎎/㎏이었으며 , 이때 총 크롬 함량은 5, 470 ㎎/㎏이었다.
- Challenge를 실시한 후 도포 부위를 관찰한 결과, 3가 크롬은 200 ㎎/㎏에서 양성률이 0%로 나타나 사용 가능 범위인 Grade I에 해당하였고, 50 ㎎/㎏에서도 양성률 0%로 사용 가능 범위인 Grade I에 해당하였으므로, 3가 크롬은 피부 감작성 측면에서 안전성이 높은 원료로 200 ㎎/㎏ 이하 농도에서 사용 가능하다고 판단되었다(Table 7). 6가 크롬 5 ㎎/㎏으로 challenge를 실시한 경우, 양성률이 15%로 나타나 Grade Ⅱ에 해당하였으나, 이는 사용 가능 범위에 포함되어 3가 크롬과 6가 크롬의 교차반응은 우려하지 않아도 될 것으로 판단되었다(Table 7).
- Challenge 실시한 후 도포 부위를 관찰한 결과, 6가 크롬은 5 ㎎/㎏에서 양성률이 10%로 나타나 사용 가능 범위인 Grade Ⅱ에 해당하였으며, 1 ㎎/㎏에서도 양성률 5~15%로 사용 가능 범위인 Grade Ⅱ에 해당하여 피부 감작성 측면에서 화장품에 5 ㎎/㎏ 이하 농도로 함유될 경우 안전하다고 판단되었다(Table 8). 3가 크롬 200 ㎎/㎏으로 challenge를 실시한 경우, 양성률 25%를 보였으나, 이것도 사용 가능한 Grade Ⅱ에 해당하는 범위이므로, 6가 크롬과 3가 크롬의 교차반응은 우려하지 않아도 될 것으로 판단되었다(Table 8).
- Challenge 실시한 후 도포 부위를 관찰한 결과, 6가 크롬은 5 ㎎/㎏에서 양성률이 10%로 나타나 사용 가능 범위인 Grade Ⅱ에 해당하였으며, 1 ㎎/㎏에서도 양성률 5~15%로 사용 가능 범위인 Grade Ⅱ에 해당하여 피부 감작성 측면에서 화장품에 5 ㎎/㎏ 이하 농도로 함유될 경우 안전하다고 판단되었다(Table 8). 3가 크롬 200 ㎎/㎏으로 challenge를 실시한 경우, 양성률 25%를 보였으나, 이것도 사용 가능한 Grade Ⅱ에 해당하는 범위이므로, 6가 크롬과 3가 크롬의 교차반응은 우려하지 않아도 될 것으로 판단되었다(Table 8). Benzocaine 군에서는 총5마리의 10개 적용부위 모두에서 홍반이 적용부에 흩어져 나타남(Score of skin reaction "1, 중등도의 홍반 (Score of skin reaction "2 및 강한 홍반 및 부종 (Score of skin reaction "3이 관찰되었다.
- 크롬에서 피부 자극에 영향을 주는 것은 수용성 크롬이며 3가 크롬보다 6가 크롬이 피부에 더 큰 독성을 나타내는데 피부 감작성 시험을 통하여 3가 크롬은 200 ㎎/㎏ 이하, 6가 크롬은 5 ㎎/㎏ 이하에서는 자극을 나타내지 않음을 알 수 있었다. 국내 시판 48개 메이크업 화장품에 대하여 시험한 결과, 수용성 6가 크롬은 검출되지 않았고 수용성 3가 크롬은 10 ㎎/㎏ 이하로 검출되어 모두 수용성 크롬에 대하여 안전함을 확인하였다.
- 크롬에서 피부 자극에 영향을 주는 것은 수용성 크롬이며 3가 크롬보다 6가 크롬이 피부에 더 큰 독성을 나타내는데 피부 감작성 시험을 통하여 3가 크롬은 200 ㎎/㎏ 이하, 6가 크롬은 5 ㎎/㎏ 이하에서는 자극을 나타내지 않음을 알 수 있었다. 국내 시판 48개 메이크업 화장품에 대하여 시험한 결과, 수용성 6가 크롬은 검출되지 않았고 수용성 3가 크롬은 10 ㎎/㎏ 이하로 검출되어 모두 수용성 크롬에 대하여 안전함을 확인하였다. 그러나, 6가 크롬은 피부 독성이 강하므로 지속적인 품질 관리를 위하여 가이드라인을 제시할 필요가 있으며 본 연구 결과가 수용성 크롬에 대한 기준 확립에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
후속연구
- 국내 시판 48개 메이크업 화장품에 대하여 시험한 결과, 수용성 6가 크롬은 검출되지 않았고 수용성 3가 크롬은 10 ㎎/㎏ 이하로 검출되어 모두 수용성 크롬에 대하여 안전함을 확인하였다. 그러나, 6가 크롬은 피부 독성이 강하므로 지속적인 품질 관리를 위하여 가이드라인을 제시할 필요가 있으며 본 연구 결과가 수용성 크롬에 대한 기준 확립에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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