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문제 정의
- 본 연구는 내분비계 장애물질이 수중내 1차 생산자인식물플랑크톤의 성장에 어떠한 영향을 주는 지를 파악하고자, 매년 한강과 낙동강에서 우점하는 남조 Microcystis aeruginosa와 규조 Stephanodiscus hantzschii 단일 배양계에 NP와 DEHP를 각각 다양한 농도별로 처리하고 각 개체군의 현존량 및 형태적 변화를 추적하였다.
제안 방법
- 00ppm 의 acetone를 처리하였다. 2차 실험은 exponential phase 인 11 일째 두 조류에 NP를 0.01, 0.05, 0.10 및 1.00 ppm이 되도록 처리하였고, 용매로서 1차 실험과 같은 농도의 acetone을 처리하였다. 또한 NP을 넣지 않은 대조군을 포함하여 모든 실험은 3회씩 반복 수행하였다.
- acetone의 농도는 사전 예비실험을 통하여 조류에 영향이 없는 농도를 선택하였고 EDs의 양에 비례하여 증가하였다. 2차 실험은 exponential phase인 배양 11 일째 약제를 0.01, 0.05, 0.10 및 1.00 ppm씩 처리하였고, 용매의 영향을 알아보기 위해 3.00 ppm Acetone을 각각 처리하였다. 또한 DEHP을 넣지 않은 대조군을 포함하여 모든 실험은 3회 반복하였다.
- hantzschii의개체군 성장에 미치는 독성효과를 조사하기 위하여, NP 와 같은 동일한 방법으로 세포배양 및 약제처리를 실시하였다. DEHP 처리는 두 조류의 log phase 에 각각 1.00, 2.00, 2.50 및 3.00 ppm이 되도록 처리하였고, 용매의 영향을 확인하기 위하여 6.00 ppm의 acetone를 처리하였다. acetone의 농도는 사전 예비실험을 통하여 조류에 영향이 없는 농도를 선택하였고 EDs의 양에 비례하여 증가하였다.
- 또한 DEHP을 넣지 않은 대조군을 포함하여 모든 실험은 3회 반복하였다. DEHP가 두 조류세포의 성장에 미치는 영향을 확인하기 위한 NP처리 실험과 동일하게 매일 세포계수 및 형태변화를 조사하였다.
- DEHP가 유해조류 M. aeruginosa와 S. hantzschii의개체군 성장에 미치는 독성효과를 조사하기 위하여, NP 와 같은 동일한 방법으로 세포배양 및 약제처리를 실시하였다. DEHP 처리는 두 조류의 log phase 에 각각 1.
- EDs의균질화를 위해 생물체에 비교적 독성효과가 적은 100%acetone을 이용하였다 (Meregalli et al, 2001; Kwak andLee, 2004). EDs의 투여농도를 결정하기 위하여 일반적으로 자연수 또는 하천수 중에서 검출되는 농도(Frommeet al, 2002; Li et al, 2004)를 고려하여 이보다 높은 4 단 계 농도 (X 1, X 10, X 100, X 1,000)을 제조하여 배양중 인 조류세포에 각각 처리한 후 개체군의 성장 및 형태 변화를 조사하였다.
- hantzschii UTCC 267을 접종한 후 앞에서 언급한 것과동일한 배양조건에서 배양하였다. EDs처리는 1차 실험에서는 배양시작과 함께 NP를 0.01, 0.05, 0.10 및 1.00ppm 씩 처리하였고, 용매의 영향을 확인하기 위하여 3.00ppm 의 acetone를 처리하였다. 2차 실험은 exponential phase 인 11 일째 두 조류에 NP를 0.
- 세포 계수는 약제를 처리한 후 매일 배양계로부터 20 |L씩 꺼내 Lugol solution으로 고정한 다음 광학현미경 (Olympus, Japan) 400배 하에서 계수하였다. NP처리 이후 조류세포의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 광학현미경 (Olympus, Japan) 1,000배 하에서 검경하였다.
- Nonlyphen이이 유해조류 M. aeruginosa와 S. hantzschii의 개체군 성장에 미치는 독성효과를 조사하기 위하여,직경 25 mm test tube에 CB배지와 DM배지를 20 mL씩각각 분주하고 2 mL의 M. aeruginosa NIES 44와 S. hantzschii UTCC 267을 접종한 후 앞에서 언급한 것과동일한 배양조건에서 배양하였다. EDs처리는 1차 실험에서는 배양시작과 함께 NP를 0.
- 00 ppm의 acetone를 처리하였다. acetone의 농도는 사전 예비실험을 통하여 조류에 영향이 없는 농도를 선택하였고 EDs의 양에 비례하여 증가하였다. 2차 실험은 exponential phase인 배양 11 일째 약제를 0.
- 또한 NP을 넣지 않은 대조군을 포함하여 모든 실험은 3회씩 반복 수행하였다. 각 조류의 개체군 성장에 미치는 NP의 독성효과를 확인하기 위하여 약제처리 이후 매일 조류세포의 현존량 변화를 조사하였다. 세포 계수는 약제를 처리한 후 매일 배양계로부터 20 |L씩 꺼내 Lugol solution으로 고정한 다음 광학현미경 (Olympus, Japan) 400배 하에서 계수하였다.
- 내분비계 장애물질이 조류성장에 미치는 독성 영향을 조사하기 위하여 조류의 성 장시 기 에 따라 log phase (1차 실험), exponential phase (2차 실험)로 나누어 실시하였 으며 , 성장시 기 별 조류 밀도는 남조 M. aeruginosa (1 X107 cells mL-1, 1 X 106 cells mL-1), 규조 S. hantzschii(4 X 105 cells mL-1, 1 X 105 cells mL-1) 이 었다.
- 00 ppm이 되도록 처리하였고, 용매로서 1차 실험과 같은 농도의 acetone을 처리하였다. 또한 NP을 넣지 않은 대조군을 포함하여 모든 실험은 3회씩 반복 수행하였다. 각 조류의 개체군 성장에 미치는 NP의 독성효과를 확인하기 위하여 약제처리 이후 매일 조류세포의 현존량 변화를 조사하였다.
- 배양 중인 유해조류 M. aeruginosa와 S. hantzschii에다양한 농도로 조절된 DEHP를 처리한 후 형태적 변화를 관찰하였다. 두 조류 모두 다양한 농도의 DEHP 처리에 대해 형태적인 변화는 거의 나타나지 않았으며, 대조군과 실험군간의 차이 또한 보이지 않았다.
- 배양 중인 유해조류 M. aeruginosa와 S. hantzschii에다양한 농도의 NP를 처리한 다음, 광학현미경하에서 매일 관찰하였다. 두 조류 모두 NP처리 초기에는 뚜렷한형태적 변화는 관찰되지 않았다.
대상 데이터
- , 1997), 배양조건은 25~28℃, 40~80 μmoL photons m-2 s-1, 12 : 12 (Light: Dark) cycle, 150 rpm이 었다. 규조 Stephanodiscus hantzschii UTCC 267는 캐나다 토론토 대학(UTCC; University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria) 에서 제공받아 사용하였다. 세포는 소형 원반형으로 크기는 10~12 ILm이며, 계대횟수가 증가할수록 점차 크기가 감소하였고, 군체를 형성하지 않았다.
- 독성실험에 사용된 남조 Microcystis aeruginosa NIES 44는 일본국립환경 연구소 (National Institute for Environmental Studies, Japan)에서 분양받아 사용하였다. 본균주는 가장 독성 이 약한 배양주로서 (Yasuno et al.
- 세포는 소형 원반형으로 크기는 10~12 ILm이며, 계대횟수가 증가할수록 점차 크기가 감소하였고, 군체를 형성하지 않았다. 배양은 DMa배지(Diatom Media: Ca(NO3)2.4H2O 4.000 g, KH2PO4 2.480 g, MgSO4.7H2O 5.0 g, NaHCO3 3.180 g, EDTA-FeNa 0.450 g, EDTA-Na2, H3BO3 0.496 g MnCl2.4H2O 0.278 g, (NH4)6Mo7O2.4H2O 0.200 g, Cyanocobalamin 0.008 g, Thiamine HCl 0.008 g, Biotin 0.008 g, NaSO3.9H2O 11.400 g 200 mL-1, Make up 1 liter with Distilled water, pH 6.9)를 이용하였으며 (Beakes et al., 1988), 배양조건은 15℃, 50 ILmoL photons m-2 s-1, 12 : 12 (L : D) cycle 조건에서 정치 배양하였다.
데이터처리
- 두 가지 내분비계 장애물질 NP, DEHP처리가 조류 성장에 미치는 독성효과를 확인하기 위하여, 모든 실험은 3 회씩 실시하였으며, 대조군과 처리군의 평균간의 차이에대한 유의성 검증은 SPSS package v 12.0를 이용하여 Student t-test를 실시하였다(SPSS, 2003).
성능/효과
- Diethythexyl phthalate (DEHP)는 M. aeruginosa 및 S.hantzschii의 성장시기 및 처리농도에 상관없이 독성효과는 주지 않았으며, 오히려 고농도(3.00ppm) 처리시 대조군보다 10% 이상 조류성장을 촉진하였다. 실험에 사용된 DEHP농도는 어류를 포함한 수서곤충 Chironomus (Meregalli et al, 2001; 곽과 이, 2005)보다 10~100배 이상 높은 수준으로서 DEHP가 자연계에 노출됨으로서 상위 및 최종소비자들의 성장은 억제되는 반면, 1차 생산자인 식물플랑크톤이나 내성이 강한 생물들의 대발생을 일으켜 결국 수서생태계를 교란할 것으로 사료된다.
- 결국 DEHP는 두 유해조류의 성장에 대해 억제효과는보이지 않았으며, 고농도로 갈수록 유해조류의 성장을 촉진함으로써 현장에서 조류대발생의 중요한 유발인자인영양물질로 작용할 수 있다고 판단되었다.
- 1-A, B). 결국, NPe M. aeruginosa의 성장초기에 더욱 뚜렷한 성장억제를 보인 반면, 대수성장기에는 농도의존적인독성 영향을 보였다. 규조 Stephanodiscus hantzschii는전체적으로 M.
- 3-A, B). 규조 Stephanodiscus hantzschii에 DEHP가 미치는 독성 영향은 전체적으로 M. aeruginosa와 유사한 패턴을 보였으며, 모든 농도의 처리군은 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다.
- , 2003), 동물플랑크톤(65~85 Rg L-1, Tanaka and Nakanishi, 2002) 등에 대하여 비교적 낮은 독성 (LC50) 을 갖는다. 다만 하절기를중심으로 한강에서 남조 Microcystis (Han et al, 1995) 고과저온기 낙동강 Stephanodiscus 대발생 (Ha et al, 2002)을감안한다면, 0.10 ppm 이상의 현장 NP농도에서도 조류성장이 억제되지 않은 것은 단일 배양주를 이용한 실내실험과 자연수중의 식물플랑크톤과의 약제에 대한 감수성의 차이로 사료되며, 따라서 현장수에 존재하는 다양한 수중생물들의 간섭에 의해 특정조류가 받는 영향은 단일배양 주보다 크게 감소될 것으로 판단되었다.
- 대수성장기 (exponential phase)에 처리한 2차 실험에서는 가장 높은 농도 (1.00ppm)에서도 조류는 완벽하게 사멸하지 않았으며 배양 7일째부터 다시 증가하는 특징을 나타냈다. 다만, 0.
- hantzschii에다양한 농도로 조절된 DEHP를 처리한 후 형태적 변화를 관찰하였다. 두 조류 모두 다양한 농도의 DEHP 처리에 대해 형태적인 변화는 거의 나타나지 않았으며, 대조군과 실험군간의 차이 또한 보이지 않았다. 한편, DEHP를 배양중인 조류 M.
- 2-A, B). 따라서, NPe 두 유해조류의 성장에 뚜렷한 제어효과를 나타냈으며, 성장초기와대수성장기 모두 M. aeruginosa가 S. hantzschii보다 더욱 민감하게 영향을 받는 것으로 밝혀졌다.
- 4- A). 또한 대수성장기 (exponential phase)에 처리할 경우, M. aeruginosa처럼 농도의존적 성장은 뚜렷하지 않았으나 역시 고농도 DEHP 처리군에서 높은 성장을 보였다 (Fig. 4-B). 용매 acetone처리의 경우 성장시기에 상관없이 대조군과 크게 차이를 보이지 않았다 (Fig.
- hantzschii의 log, exponential phase에 처리한 후 개체군 성장은 다음과같다. 먼저 DEHP를 남조 Microcystis aeruginosa 배 양초기 (log phase)에 처리한 실험에서는 모든 농도에서 대조군보다 더 높은 성장을 나타냈다 (Fig. 3-A).
- 두 조류세포의 log, exponential phase에 NP를 처리한 후 조류세포의 성장 변화를 조사한 결과는 다음과 같다. 먼저, 남조 Microcystis aeruginosa 성장초기 (log phase) 에 NP를 처리할 경우, 낮은 농도(0.01 ppm NP)처리에도 조류성장이 억제되었으며, 0.05 ppm 이상의 농도에서는 배양 10일째 부터 조류세 포가 관찰되 지 않았다 (Fig. 1-A).
- 앞에서 언급한 바와 같이 국내외의 NP, DEHP의 수중 분포가 지역이나 나라에 따라 매우 큰 범위를 나타내지만, 이들이 비록 저농도로 수계에 노출되더라도 먹이연쇄과정을 거쳐상위 또는 최종소비자의 체내에 고농도로 축적됨으로서피해현상이 일어나는게 일반적이다. 본 실험에서 NP는 DEHP에 비해 동일농도에서 뚜렷한 조류성장 저해를 가져왔으나, 수중내 대형어류, 무척추동물 등을 포함한 타가영양 생물들에게 동일한 형태의 독성을 보일지는 미지수다. 뿐만 아니라 본 실험에서는 단일 배양주를 이용한실내실험의 결과로서 현장수에 분포하는 다양한 생물들의 독성반응을 단순하게 추정하기는 매우 어렵고, 따라서현장수에 대한 실험이 필요하다.
- 규조 Stephanodiscus hantzschii UTCC 267는 캐나다 토론토 대학(UTCC; University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria) 에서 제공받아 사용하였다. 세포는 소형 원반형으로 크기는 10~12 ILm이며, 계대횟수가 증가할수록 점차 크기가 감소하였고, 군체를 형성하지 않았다. 배양은 DMa배지(Diatom Media: Ca(NO3)2.
- 00ppm) 처리시 대조군보다 10% 이상 조류성장을 촉진하였다. 실험에 사용된 DEHP농도는 어류를 포함한 수서곤충 Chironomus (Meregalli et al, 2001; 곽과 이, 2005)보다 10~100배 이상 높은 수준으로서 DEHP가 자연계에 노출됨으로서 상위 및 최종소비자들의 성장은 억제되는 반면, 1차 생산자인 식물플랑크톤이나 내성이 강한 생물들의 대발생을 일으켜 결국 수서생태계를 교란할 것으로 사료된다. 특히 DEHP처리에 의한 조류의 성장 촉진은 지금까지 조류대발생이 주로 cultural eutrophication에 의한 수중내 증가된 영 양물질 (N, P, Si) 이나 환경요인 (빛, 온도, 바람) 에의해서 유도된다는 단순한 영양론적 해석에서 벗어나 수계에 유입된 EDs가 1차 생산자인 식물플랑크톤 위 인자들의 성장억제를 통한 포식압 회피 및 성장유도 등의 과정을 거쳐 지속적인 조류대발생을 유도할 수 있다는 점에서 의미가 크다.
후속연구
- 특히 DEHP처리에 의한 조류의 성장 촉진은 지금까지 조류대발생이 주로 cultural eutrophication에 의한 수중내 증가된 영 양물질 (N, P, Si) 이나 환경요인 (빛, 온도, 바람) 에의해서 유도된다는 단순한 영양론적 해석에서 벗어나 수계에 유입된 EDs가 1차 생산자인 식물플랑크톤 위 인자들의 성장억제를 통한 포식압 회피 및 성장유도 등의 과정을 거쳐 지속적인 조류대발생을 유도할 수 있다는 점에서 의미가 크다. 따라서 EDs가 수서생태계에 미치는 영향을 정확하게 이해하기 위하여 1) 수중내 EDs 분포 및 식물플랑크톤과의 상관성, 2) 수중 및 생물요인 -박테리아, 식물플랑크톤, protozoa, 동물플랑크톤, 고등동물 체내의 EDs 조사를 통한 생태학적 농축과정의 규명, 그리고 3) DEHP와 같은 조류성장 요인들에 의한 수서 생태 계교란 형태 조사 등 기초생태학적 연구가 동반되어야 할 것으로 사료되었다.
- 내분비계 장애물질의 높은 농도에도 불구하고 이러한 조류대발생 이 계속되는 이유에 대해서는 잘 알려지지 않고 있다. 따라서 EDs와 식물 플랑크톤 간의 관계를 연구하는 것은 수중 내 생물학적 농축과정을 이해함으로써 어류나 패류와 같은 상위소비자는 물론 사람이나 포유류 수준에서의 내분비계 교란의 위험을 사전에 예방하고 수자원 관리를 위한 기초적 자료로써 제공할 수 있다고 판단된다.
- 본 실험에서 NP는 DEHP에 비해 동일농도에서 뚜렷한 조류성장 저해를 가져왔으나, 수중내 대형어류, 무척추동물 등을 포함한 타가영양 생물들에게 동일한 형태의 독성을 보일지는 미지수다. 뿐만 아니라 본 실험에서는 단일 배양주를 이용한실내실험의 결과로서 현장수에 분포하는 다양한 생물들의 독성반응을 단순하게 추정하기는 매우 어렵고, 따라서현장수에 대한 실험이 필요하다. 특히 EDs가 "생물체나그 자손에 부정적 건강장애를 주고 내분비 기능의 변화를 초래하는 외 인성 물질”로 규정되고 있으나 (SIDS,1995; OECD, 1996; EPA, 1998), 작용면에서 본 실험결과처럼 수중에 도출될 경우, 포식압을 줄임으로써 조류대발생의 가능성을 시사하고 있으나 실제 동물의 내분비계장애요인으로 작용되는 것이 과연 먹이연쇄과정에 의하여 동물장기내 축적되는 과정을 거치는 것인지, 수중내분포하는 저농도 EDs가 수중동물에게 장기간 직접 섭취됨으로 체내 농도가 증가되는지, 아니면 두 가지 요인이혼합된 것인지 아직 정확하지 않다.
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