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문제 정의
- 아직 국내에는 사염화에틸렌과 트리클로로에틸렌의 탈염소화 분해에 관여하는 토착 미생물에 대한 정보가 전무하다. 따라서 본 연구에서는 국외에서 보고된 환원성 탈염소화 미생물의 국내 사염화에틸렌 오염 지하수내 존재 유무와 전자공여체 주입 시 사염소화에틸렌 탈염소화 분해 활성도를 평가하였다.
제안 방법
- 사염화에틸렌 혹은 트리클로로에틸렌으로 오염된 창원 A, 창원 B, 부천 및 양산, 4개의 지역에서 지하수 시료를채취하여, 시료 내 사염화에틸렌, 트리클로로에틸렌, 시스-1, 2-디클로로에틸렌, 염화비닐 및 에틸렌의 농도를 측정하여 자연 상태에서의 환원성 탈염소화 분해 여부를 평가하였다.
- 마이크로코즘 테스트는 오염 대수층 토양시료 채취가 난이하여 오염 지하수를 이용하여 수행하였다. 혐기조건을 유지하기 위하여 anaerobic glove box에서 156 mLserum 병을 사용하여 마이크로코즘을 제작하였다.
- 오염 지하수를 이용하여 수행하였다. 혐기조건을 유지하기 위하여 anaerobic glove box에서 156 mLserum 병을 사용하여 마이크로코즘을 제작하였다. 마이크로코즘 병에 지하수(110 mL)와 미생물 성장을 돕기 위한ALSM (anaerobic low salt media)을 넣은 후(L6flfler et al.
- 혐기조건을 유지하기 위하여 anaerobic glove box에서 156 mLserum 병을 사용하여 마이크로코즘을 제작하였다. 마이크로코즘 병에 지하수(110 mL)와 미생물 성장을 돕기 위한ALSM (anaerobic low salt media)을 넣은 후(L6flfler et al., 2000), 최종농도가 약 5 ppm이 되게 사염화에틸렌을 주입하였다. 그 후 사염화에틸렌을 에틸렌으로 완전히 변환시키는데 필요한 전자 공여체 [sodium lactate (147 mg/L), sodium propionate (104 mg/L), sodium butyrate (87 mg/L) 및 sodium fiimarate (188 mgg사를 주입하였다.
- , 2000), 최종농도가 약 5 ppm이 되게 사염화에틸렌을 주입하였다. 그 후 사염화에틸렌을 에틸렌으로 완전히 변환시키는데 필요한 전자 공여체 [sodium lactate (147 mg/L), sodium propionate (104 mg/L), sodium butyrate (87 mg/L) 및 sodium fiimarate (188 mgg사를 주입하였다.
- 각 전자공여체 당 탄소원을 주입한 active 마이크로코즘 병 3개와 4종류의 control 마이크로코즘 병 (poison control, autoclave control, carbon source control, nutrient control)을 제작하였다. Poison controle 미생물에 독성이 있는 sodium azide (50 mg/L)를 주입하였고, autoclave controle 지하수를 24시간 간격으로 3회 autoclave 하였다.
- control, carbon source control, nutrient control)을 제작하였다. Poison controle 미생물에 독성이 있는 sodium azide (50 mg/L)를 주입하였고, autoclave controle 지하수를 24시간 간격으로 3회 autoclave 하였다. Carbon source control 탄소원을 주입하지 않고 사염화에틸렌만 주입하여 자연변환을 평가하였다.
- Poison controle 미생물에 독성이 있는 sodium azide (50 mg/L)를 주입하였고, autoclave controle 지하수를 24시간 간격으로 3회 autoclave 하였다. Carbon source control 탄소원을 주입하지 않고 사염화에틸렌만 주입하여 자연변환을 평가하였다. Nutrient controle 탄소원을 주입하지 않고, ALSM에 함유되어 있는 YE (yeast extract, 20 mg/L) 와 Vitamin B12 (0.
- Carbon source control 탄소원을 주입하지 않고 사염화에틸렌만 주입하여 자연변환을 평가하였다. Nutrient controle 탄소원을 주입하지 않고, ALSM에 함유되어 있는 YE (yeast extract, 20 mg/L) 와 Vitamin B12 (0.05 mg/L)를 주입하여 nutrient가 PCE 분해에 미치는 영향을 평가하였다.
- 마이크로코즘 병을 20℃항온기에서 배양하면서, 전자공여체와 염화에틸렌의 농도를 일주일 간격으로 측정하였다. 마이크로코즘 제작에 사용된 모든 실험기구는 호일로 싸서 120℃에서 60분간 autoclave하여 무균 상태를 유지하였다.
- DNA SPIN kit에서 추출된 DNA가 포함된 silica matrix가 본래 색(횐색)이 될때까지 3번 이상 세척하였다. FastDNA SPIN Sample kit는 토양 내에 있는 DNA의 추출을 위해 고안되었는데, 이 범위를 확대시켜 지하수에 적용시키기 위하여 각각의 시료를 전 처리된 유리섬유여과지(0.45 ㎛ of pore size)가 설치된 멸균된 여과장치를 통하여 여과시켰다. 충분한 DNA 를 얻기 위해 한 여과지 당 2 L 이상의 지하수 시료를 여과 시켰으며, 오염에 의한 영향을 최소화하기 위해서 여과과정은 laminar flow hood에서 수행하였다.
- 45 ㎛ of pore size)가 설치된 멸균된 여과장치를 통하여 여과시켰다. 충분한 DNA 를 얻기 위해 한 여과지 당 2 L 이상의 지하수 시료를 여과 시켰으며, 오염에 의한 영향을 최소화하기 위해서 여과과정은 laminar flow hood에서 수행하였다. 여과를 마친 후, 멸균한 가위와 핀셋을 가지고 유리섬유여과지를 잘게 잘라서 kit에 있는 Matrix Tubbe에 넣었다.
- 추출한 DNA를 주형으로 해서 PCR을 실시하였다. PCR 반응물 20 µL 안에는 20 mM Tris-Cl (pH=8.
- PCR 반응물 20 µL 안에는 20 mM Tris-Cl (pH=8.0), 100 mM 염화칼슘, 6 mM 염화마그네슘, 0.02% 젤라틴, 각각5 mM dNTP (Deoxynucleoside Triphosphate, Pomega, USA), 0.2 pmol 프라이머, 10 ng DNA 주형, 1U Taq 중합효소 (Pomega, USA)를 첨가하였다. 16s rDNA를 증폭하기 위해 사용된 프라이머는 forward 프라이머(General Biosystem, Korea)로 5'-GATTTGGATCCTGGC- TCAG-3 (27F), reverse 프라이머는 5'-AAGGAGGGG- ATCCAGCC-3' (1492R)을 사용하였다.
- 1분 30초 동안 16S rDNA를 증폭하는 반응을 30번 반복하고, 마지막으로 72℃에서 7분 동안 16s rDNA를 증폭한 후, 반응물을 4℃ 에서 보관하였다. PCR 증폭 산물은 QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen, German)를 아용하여 정제하였다.
- 1M)를 넣은 배지에 배양되었다. 배양액 내의 횐색의 군체 (colony)를 확인한 다음, 반복 복제 (replication)에 의해 재확인된 군체를 액체배지에 접종하여 플라스미드(plasmid) 정제에 이용할 수 있도록 12-16 시간 정도 배양하였다. 형질전환에 의해 배양된 군체는 원심 분리를 이용하여 농죽하였고, Plasmid Spin Kit (Genenmed, Korea)을 사용하여 군체 미생물 내의 플라스미드를 추출하였다.
- 배양액 내의 횐색의 군체 (colony)를 확인한 다음, 반복 복제 (replication)에 의해 재확인된 군체를 액체배지에 접종하여 플라스미드(plasmid) 정제에 이용할 수 있도록 12-16 시간 정도 배양하였다. 형질전환에 의해 배양된 군체는 원심 분리를 이용하여 농죽하였고, Plasmid Spin Kit (Genenmed, Korea)을 사용하여 군체 미생물 내의 플라스미드를 추출하였다.
- , 2000)인데, 본 실험에 이용된 효소는 범용적인 Rsa I을 사용하였다. RFLP에 의해 그룹화 된 플라스미드를 염기서열분석 전문회사인 마크로젠(주)에 의뢰해서, T7과 SP6 프라이머를 가지고 16s rDNA를 증폭하여 염기서열을 분석하게 흐]였다. 마크로젠 (주)으로부터 얻은 16s rDNA의 염기서열을 BLAST와 FASTA 프로그램으로 GenBank에있는 염기서열정보와 비교하였다.
- RFLP에 의해 그룹화 된 플라스미드를 염기서열분석 전문회사인 마크로젠(주)에 의뢰해서, T7과 SP6 프라이머를 가지고 16s rDNA를 증폭하여 염기서열을 분석하게 흐]였다. 마크로젠 (주)으로부터 얻은 16s rDNA의 염기서열을 BLAST와 FASTA 프로그램으로 GenBank에있는 염기서열정보와 비교하였다.
- PCE, TCE, c-DCE, VC 및 ethylene 측정은 Hamilton 1710N gas-tight syringe를 이용하여 마이크로코즘 병의 headspace에서 200 μL를 채취하여 GC에 직접 주입하여 분석하였다. GC는 GSQ-PLOT 컬럼 (J&W Scientific, Folsom, 미국)과 불꽃이온화검줄기 (flame ionization detector, FID)가 설치된 Shimadzu 17-A를 사용하였다.
- 전자공여체로 사용된 유기산은 다량의 시료분석을 위한자동시료주입기(autosampler, Waters® 717 plus), 펌프(Waters™ 600 Controller), 컬럼 (BIO-RAD Aminex HPX-87H), 검출기(WatersTM 486 Tunable AbsorbaneDetecter) 및 크로마토그램 데이터 시스템으로 구성된 HPLC (WatersTM)를 이용하여 분석하였다.
- 사염화에틸렌 탈염소화 정도가 상이한, 창원 B와 양산 지역 지하수 내 미생물 군집의 구조와 다양^을 비교하기 위해, RFLP& 수행하였다. Table 4는 두 지역 지하수 내 미생물 군집의 종이 계통 발생적으로 다양하다는 것을 보여주고 있다.
- 우점하는 RFLP 형태를 계통 발생학적으로 분석하여, 두 지역(창원 B, 양산 지역) 미생물 군집에 있는 미생물종을 동정하였다(Fig. 1). 창원 B 지역 클론 라이브러리로부터는 우점 종은 아니지만 사염화에틸렌을 완전 탈염소화시키는 미생물과 유사한 염기서열을 보이는 두 개의 클론 1-5와 1-6을 확인하였다.
대상 데이터
- 채취된 시료는 FastDNA SPIN Sample kit (Qbiogene)을 이용하여 추출하였으며 DNA> 증폭하기 위한 PCR 반응에 저해요소로 작용하는 humic acid를 제거하기 위해서 5.5 M Guanidine Thiocyanate (Fluka Chemical Corp., USA) 용액을 이용하였다. DNA SPIN kit에서 추출된 DNA가 포함된 silica matrix가 본래 색(횐색)이 될때까지 3번 이상 세척하였다.
- 2 pmol 프라이머, 10 ng DNA 주형, 1U Taq 중합효소 (Pomega, USA)를 첨가하였다. 16s rDNA를 증폭하기 위해 사용된 프라이머는 forward 프라이머(General Biosystem, Korea)로 5'-GATTTGGATCCTGGC- TCAG-3 (27F), reverse 프라이머는 5'-AAGGAGGGG- ATCCAGCC-3' (1492R)을 사용하였다. PCR 반응 조건은, 첫 번째 반응은 94℃에서 1분, 다음 각 단계에서는 94℃ 1분, 57℃에서 50초, 72℃에서.
- RFLP는 특정부위의 염기서열을 잘라내는 제한효소를 이용하여 같은 패턴을 그룹화 하는 절차(Braker et al., 2000)인데, 본 실험에 이용된 효소는 범용적인 Rsa I을 사용하였다. RFLP에 의해 그룹화 된 플라스미드를 염기서열분석 전문회사인 마크로젠(주)에 의뢰해서, T7과 SP6 프라이머를 가지고 16s rDNA를 증폭하여 염기서열을 분석하게 흐]였다.
- , 2001)을 이용하여 계통수를 그렸다. 본 연구에서 연구된 미생물의 염기서열 등록번호(assession number)는 AY625135~AY625151 이다. 이 등록번호는 EMBL 뉴클레오타이드 염기서열 정보에서 찾을 수 있다.
- 주입하여 분석하였다. GC는 GSQ-PLOT 컬럼 (J&W Scientific, Folsom, 미국)과 불꽃이온화검줄기 (flame ionization detector, FID)가 설치된 Shimadzu 17-A를 사용하였다. GC 주입부와 검출부의 온도는 각각 25℃를 유지하였고, 오븐의 온도는 승온분석을 위하여 40℃에서 2분간 유지후, 40℃에서 80℃로 5℃/분으로 승온하고, 80℃에서 200℃까지 10℃/분으로 승온하였다.
데이터처리
- 81 로 정렬되었다. 이렇게 정렬된 염기서열정보는 DNA STAR 프로그램을 사용하여 편집되었고, 최종적으로 MEGA version 2.1 (Sudhir et al., 2001)을 이용하여 계통수를 그렸다. 본 연구에서 연구된 미생물의 염기서열 등록번호(assession number)는 AY625135~AY625151 이다.
이론/모형
- PCR 증폭 산물의 라이게이션(ligation)은 pGEM-T Easy vector system II (Pomega, USA) 즉, 발현벡터를 사용하여 Sambrook 등의 방법 (Sambrook et al., 1989)에 따라 수행하였으며, 형질전환(transformation)은 Mandel과 Higa의 방법 (Mandel and Higa, 1970)으로 수행하였다. 이후에, 형질전환 산물은 선택적 배지(암피실린 60 mg/ mL, X-gal 20 mg/mL)에 유도물질 역할을 하는 IPTG(0.
성능/효과
- 그러나 염화비닐과 에틸렌은 전혀 검출되지 않았다. 이 결과를 통해, 전 지역의 대수층에 트리클로로에틸렌을 시스-1, 2디클로로에틸렌으로 분해하는 미생물 존재 가능성을 확인 하였다. 현장에서 채취한 시료에서의 염화비닐과 에틸렌 불검출은 트리클로로에틸렌을 에틸렌으로 완전 분해하는 미생물이 존재하지 않거나, 존재하더라도 전자공여체 부족 등의 현장조건이 완전 분해에 적합하지 않은것으로 사료된다.
- 4 종류의 control에서는 90일 이후에 사염화에틸렌의 분해가 일어나지 않았으나, 전자공여체를 주입한 모든 마이크로코즘 병에서 사염화에틸렌이 탈염소화되는 것을 확인할수 있었다. 그러나 탈염소화 정도는 지역별로 상이하였다.
- 그러나 중간생성물질인 시스-1, 2디클로로에틸렌과 염화비닐은 검출되지 않았다. 한편, 부천과 양산 지역 지하수를 이용한 마이크로코즘 병에서는, 90일이 지나도 염화비닐과 에틸렌이 검출되지 않았고 시스-1, 2디클로로에틸렌만 검출되었다. 이 결과로부터 다음의 사항들을 추론 할 수 있다.
- 이 결과로부터 다음의 사항들을 추론 할 수 있다. 첫째, 사염화에틸렌을 트리클로로에틸렌으로 탈염소화시키는 미생물이 전 조사 지역에 존재하고, 둘째로, 창원 A와 창원 B 지역의 지하수 내에 사염화에틸렌을 에틸렌으로 완전 분해하는 미생물이 존재하고, 마지막으로, 부천과 양산 지역의 미생물은 중간생성물질인 시스-1, 2디클로로에틸렌을 염화비닐로 탈염소화하는 효소가 없거나, 시스-1, 2디클로로에틸렌분해 속도가 느려 실험기간 (90일) 이내에 생분해가 관찰되지 않았다고 추정된다.
- Table 4는 두 지역 지하수 내 미생물 군집의 종이 계통 발생적으로 다양하다는 것을 보여주고 있다. 창원 B 지역의 클론 라이브러리의 RFLP 결과를 BLAST 데이터베이스로 확인하여 기존에 밝혀진 클론과 비교한 결과 시료 내 미생물의 16s rDNA 유사성이 높은 10개의 상이한 RFLP 형태가 확인되었다. 이들은 5개의알려진 문(Phyla)인 Low G+C Gram positive, r-Proteobacteria, p-Proteobacteria, High G+C Gram positive와 a-Proteobacteria에 속하는 것을 알 수 있었다.
- 이들은 5개의알려진 문(Phyla)인 Low G+C Gram positive, r-Proteobacteria, p-Proteobacteria, High G+C Gram positive와 a-Proteobacteria에 속하는 것을 알 수 있었다. 한편, 양산 지역의 클론 라이브러리에서 7개의 상이한 RFLP 형태가 확인되었고, 이들은 3개의 알려진 문인 P-Proteobacteria, r-ProteobacteriaeJ- a-Proteobacteria0]] 속하는 것을 알 수 있었다. 이 결과를 통해, 양산 지역보다 창원 B 지역의 지하수 내에 더 다양한 미생물이 존재함을 확인 하였다.
- 한편, 양산 지역의 클론 라이브러리에서 7개의 상이한 RFLP 형태가 확인되었고, 이들은 3개의 알려진 문인 P-Proteobacteria, r-ProteobacteriaeJ- a-Proteobacteria0]] 속하는 것을 알 수 있었다. 이 결과를 통해, 양산 지역보다 창원 B 지역의 지하수 내에 더 다양한 미생물이 존재함을 확인 하였다.
- 창원 B 지역 클론 라이브러리로부터는 우점 종은 아니지만 사염화에틸렌을 완전 탈염소화시키는 미생물과 유사한 염기서열을 보이는 두 개의 클론 1-5와 1-6을 확인하였다. 1-5 와 1-6 클론은 사염화에틸렌을 에틸렌으로 완전 탈염소화시키는 미생물, Uncultured bacterium DCE 47 (Gu et al., 2004)의 염기서열과 상관성이 높은 것으로 나타났다. 그러나 양산 지역의 클론 라이브러리에서는 기존의 보고된 탈염소화 미생물과 염기서열이 유사한 클론이 발견되지 않았다.
- 그러나 양산 지역의 클론 라이브러리에서는 기존의 보고된 탈염소화 미생물과 염기서열이 유사한 클론이 발견되지 않았다. 이 결과로 국내 사-염화에틸렌 혹은 트리클로로에틸렌 오염 지하수에 사염화에틸렌 혹은 트리클로로에틸렌을 혐기성조건에서 완전 탈염소화하는 미생물 존재를 확인하였다.
- 본 연구결과를 통하여 국내 일부 지역의 지하수 내에 사염화에틸렌을 완전 탈염소화하여 무해한 에틸렌을 생성하는 미생물이 존재함을 확인하였으며, 적절한 전자공여체를 공급하는 경우 그 활성도도 증대되는 것을 확인하였다. 이 결과는 사염화에틸렌 또는 트리클로로에틸렌으로 오염된 국내 지하수를 경제적인 공법으로 보고되고 있는 환원성 탈염소화 생물학적 공정으로 복원할 수 있는 가능성을 보여주는 중요한 지표라고 사료된다.
후속연구
- 향후 연구로는 창원 A와 B 지역 지하수에서 어떠한 미생물이 사염화 에틸렌을 에틸렌으로 변환시키는데 결정적인 역할을 하는지 분리 동정해야 하며, 이를 위해서 마이크로코즘 테스트를 통하여 사염화에틸렌의 완전 탈염소화가 확인된 미생물배양액을 이용하여 분리 동정 실험이 수행되어야 한다고 사료된다.
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