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문제 정의
- 따라서 본 연구는 분자염증와 관련한 산화적 스트레스를억제하는 기능성 식품소재로서 곤충이 갖는 약용생물자원으로서의 중요성과 높은 이용가능성을 고찰하고자 시도하였으며, 이를 위해 먼저 (1)항산화제와 관련된 HTS system 을 구축하고, 이를 이용하여 (2)식품소재 라이브러리로부터 활성이 인정되는 몇 가지의 추출물을 확보하였기에 이를보고하고자 한다.
- 더구나 일련의 단계로 진행되는 신경염증 반응, 특히 노인성 치매에 있어서의 산화 질소 (nitric oxide) 와 같은 산화스트레스는 신경세포의 단백질, DNA, 지방 등의 대사에 영향을 주어 중추신경세포사를 유발시켜 기억력과 같은 정신기능을 퇴화시킨다. 이러한 관점에서 본 연구는 지금까지 많은 연구가 이루어져 있지 않은 약용곤충추출물로부터 산화스트레스 유발 물질인 superoxide 를 억제하여 뇌 손상 억제와 보호 효과를 가져오는 식품소재를 HTS 시스템을 이용하여 알아보고자 하였다(26). 이상의 결과를 종합하면 HTS 스크리닝 시스템의 구축과 이 시스템을 사용하여 가장 뛰어난 항산화 활성을 가지고 분자염증에 유효하리라 판단되는 추출물질은 사마귀, 무당벌레였으며, 특히 무당벌레는 대량적으로 확보가 용이하다는 점이 향후 산업화에 매우 유리하다고 판단된다.
- 이상의 결과를 종합하면 HTS 스크리닝 시스템의 구축과 이 시스템을 사용하여 가장 뛰어난 항산화 활성을 가지고 분자염증에 유효하리라 판단되는 추출물질은 사마귀, 무당벌레였으며, 특히 무당벌레는 대량적으로 확보가 용이하다는 점이 향후 산업화에 매우 유리하다고 판단된다. 이에 위의 실험에서 나온 몇 가지 물질을 이용하여 더 구체적인 메커니즘에 대해 연구해 볼 계획이다.
제안 방법
- Hydroxyl radical 소거 활성은 Fe" 와 H2O2 가 반응하는 Fenton 반응을 이용하여 2-deoxyribose 를 산화시켜 MDA(malondialdehyde) 로 분해시킬 때 나오는 MDA 를 530 nm 에서 측정하였다. 반응액으로는 50 mM 의 FeSO4, 7H2O, 50 mM EDTA (ethylenediaminetctraacetic acid), 50 mM 2-deoxyrebose 를 1 : 1 : 2의 비율로 섞은 다음 반응액(190 L)과 시료(10 L)를 섞었다.
- DPPH radical 소거활성능 측정은 Tagashira 의 방법을 변형하여 실험을 하였다 (18). 각 추출물의 시료 10 ul 를 0.
- Linoleic acid 항산화 실험은 Takao 방법과 linoleic acid를 기질로 하는 반응 시스템 (reaction system) 에서 과산화물의 생성을 억제하는 Nakatani 의 ferric thiocyanate 방법을 변형하여 사용하였다. 과산화 지질 (linoleic acid) 에 의해 Fe 가 Fe" 가 Fee 로 산화되게 되고 Fee는 ammonium thiocyanate 와 반응해서 붉은색으로 변하게 되는데 이것을 490 nm 에서 정량한 것이다.
- Linoleic acid 항산화 활성 실험은 linoleic acid를 기질로하여 과산화 지질을 억제하는 방법을 이용하여 실험에 사용하였다. 과산화지질 (Linoleic acid) 에 의해 FeII 가 FeⅢ 로산화가 되고 이때 Fe" 의 반응물인 ammonium thiocyanate을넣어 이를 ELISA 에서 정량을 한 것이다.
- 개의 library를 제작하였다. distilled water (DW), dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, methanol 을 이용하여 24 시간 추출과정을 거쳤으며, DW 추출물은 섭씨 60℃에서 열수 추출하였다. 이후 HTS 가 적용 가능한 96-well plate로 옮긴 다음 -20C 에 보관 후 실험에 사용하였다(Table 1).
- 먼저, 주변에서 용이하게 확보할 수 있는 42여 종의 약용곤충을 DW, DMSO, ethanol, methan이로 각각 추출하여 DPPH, FRAP, linoleic acid 항산화 assay, 그리고 hydroxyl radical 소거활성실험과 같은 항산화 실험을 HTS 시스템화하여 실시하였다. 그리고 MTT assay를 통해 hydrogen peroxide (H2O2) 에 의한 세포손상을 억제하는 활성을 검토하였다.
- 그 중 하나는 천연에서 얻을 수 있는 약용곤충추출물로부터 신경염증과 관련한 산화적 스트레스를 억제할 수 있는 물질을 찾는 것이며, 다른 하나는 이러한 실험을 대량으로 하기 위해 HTS 시스템을 이용하여 보다 빠른 시간에 보다 적은 비용으로 실험을 수행하는 시스템을 구축하는 것이었다. 먼저, 주변에서 용이하게 확보할 수 있는 42여 종의 약용곤충을 DW, DMSO, ethanol, methan이로 각각 추출하여 DPPH, FRAP, linoleic acid 항산화 assay, 그리고 hydroxyl radical 소거활성실험과 같은 항산화 실험을 HTS 시스템화하여 실시하였다. 그리고 MTT assay를 통해 hydrogen peroxide (H2O2) 에 의한 세포손상을 억제하는 활성을 검토하였다.
- 배양액으로는 RPMI 1640 (Gibco, U.S.A) 에 10% fetal bovine serum (Gibco)과 penicilline G(25 unit/ml), streptomycin(0.25% ng/ml) 를 첨가하여 사용하였고 각 세포의 배양은 온도 37C, 습도 95%, 탄산가스 농도 5%의 배양기에서 하였다. MTT 정량분석은 Mosmann 의 방법에 따라, 세포를 5x104 cells/well이 되도록 조절하여 200 nL씩 96-well plate 에 분주하고 각 시료를 1 nL 씩 넣어 24시간 배양한 후 530 nm 에서 흡광도를 측정하였다(22).
대상 데이터
- 42여 종의 곤충을 각각 용매 별로 다르게 추출하여 약 168여 개의 library를 제작하였다. distilled water (DW), dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, methanol 을 이용하여 24 시간 추출과정을 거쳤으며, DW 추출물은 섭씨 60℃에서 열수 추출하였다.
- 6, 300 mM): 10 mM 의 TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine): 20 mM 의 FeCl3 . 6H2O를 10 : 1 : 1의 비율로 섞어 실험 직전에 만들어 사용하였다. 반응액(190 l)과 추출물(10 l)을 혼합한 후 150초 간격으로 약 25분 간 590 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
- HTS 를 이용한 hit 검색을 위하여 한국생명공학연구원에 설치되어 운용하고 있는 시스템을 사용하였다 Liquid handler (CyBio, Jena, Germany), multi-label counter (VICTOR2, Wallac, Turku, Finland) 와 robotic arm (Thermo-CRS, Burlington, Canada) 등이 사용되었다. 이 3종의 기기는 automation software (POLARA) 로 조합되어 있어서 작은 공간에서 대량의 물질을 검색하기에 최적으로 설치되어 있으며, 아래의 여러가지 assay 를 신속하게 수행할 수 있었다.
- Hydrogen peroxide (H2O2) 에 의한 세포사멸 억제 실험은 서울대 암세포은행에서 분양받은 SHSY-5Y cell line 을 사용하였다. 배양액으로는 RPMI 1640 (Gibco, U.
- 본 실험에 사용한 곤충은 대전대 생명과학과로부터 제공받았으며 실험에 사용된 시약으로는 1, 1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH: St. Louis, MO), ferric tripyridyltriazine (Fe(Ⅲ)-TPTZ: Sigma), linoleic acid (Sigma), butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), 6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetra methyl chroman-2-carboxylic acid (Trolox) 등이었다.
이론/모형
- Hydroxyl radical 소거활성 실험은 2-deoxyribose 산화 방법을 이용하여 MDA 생성농도를 530 nm 에서 측정하였다. Fe"와 H2O2가 반응하는 Fenton 반응에 의해 생성되어진 hydroxyl radical 이 2-deoxyrebose 를 산화시켜 MDA (malondaldehyde) 로 분해시키며 이때 생성된 MDA는 세포막 지질성분인 불포화 지방산이 산화스트레스를 받으면생성되는 대표적인 과산화지질 물질로서 세포 손상이나세포막 구성 물질들의 변형을 야기시키는 원인이 된다.
- 25% ng/ml) 를 첨가하여 사용하였고 각 세포의 배양은 온도 37C, 습도 95%, 탄산가스 농도 5%의 배양기에서 하였다. MTT 정량분석은 Mosmann 의 방법에 따라, 세포를 5x104 cells/well이 되도록 조절하여 200 nL씩 96-well plate 에 분주하고 각 시료를 1 nL 씩 넣어 24시간 배양한 후 530 nm 에서 흡광도를 측정하였다(22).
성능/효과
- Hydrogen peroxide 에의한 세포사멸을 억제하는 것으로 다음과 같은 결과를 얻을수 있었다. DW 추출물의 경우 섬서구메뚜기 Atractomorpha lata Motschulsky), 방아깨비, 팥중이, 무당벌레, DMSO 추출물의 경우 애매미(Meimuna opalifera (Walker)), 무당벌레, 그리고 ethanol 과 methan이의 경우 좀사마귀, 사마귀, 왕사마귀, 늦반딧불이, 왕오색나비 등에서 세포사멸 억제효과가 높게 나타났다(Fig. 5).
- 실험 결과, DW와 DMSO 추출물에서 좋은 활성을 보였다. DW 추출물의 경우 좀사마귀, 물땡땡이, 배 추흰나비 , 남방노랑나비 , 왕오색 나비 (Sasakia charonda (Hewitson)) 등이 활성이 높게 나타났으며, DMSO 추출물에 있어서는 사마귀, 왕사마귀, 방아깨비, 팥중이, 참뜰길앞잡이 등이 높은 활성을 보였다. 상대적으로 낮은 활성을보인 ethanol 과 methanol 주줄물에 있어서는 사마귀, 왕사마귀 등이 좋은 활성을 나타내었다 (Fig.
- 실험 결과, methanol 추출물에서 전반적으로 높은 활성을 나타냈으며 그 중 왕잠자리, 물사마귀, 사마귀, 섬서구메뚜기, 벼메뚜기, 끝검은메뚜기, 팥중이, 늦반딧불이 등이 특히 높은 활성을 보였다. DW 추출물의 경우에는 좀사마귀, 사마귀, 왕사마귀, 방아깨비 (Acrida cinerea cinerea (Thunberg)), 장수쐐기나방, 호랑나비 (Papilio xuthus Linn) 등이, DMSO 추출물의 경우는 사마귀, 왕사마귀, 팥중이, 게아재비 (Ranatra chinensis Mayr), 장수쐐기나방, 산제비나비, 호랑나비 등이, 그리고 ethanol 추출물에서는 왕잠자리 (Anax parthenope Julius Brauer), 물사마귀, 사마귀, 팥중이, 장수풍뎅이, 늦반딧불이 등이 좋은 활성을 나타냈다. 전체적으로 추출 용매에 관계없이 활성이 높게 나온 것으로는 사마귀, 왕사마귀, 늦반딧불이 등이었으며, 이들은 수용성 비타민 E성분으로서 항산화 효과가 뛰어나 널리 사용되고 있는 Trolox 보다 더 좋은 활성을 가지는 것으로 나타났다(Fig.
- DMSO 의 추출물에서는 활성이낮게 나왔으나, 욍사마귀 (Tenodera aridifolia (Stoll)), 물땡땡이 (Hydrophilus acuminatus Motschulsky) 등에서 비교적높은 활성을 나타냈다. Ethanol 과 methanol 추출물에서는비슷하게 높은 활성 경향을 나타냈으며 특히 사마귀, 팥중이 (Odealeus infernalis Saussure), 검정물방개 (Cybister (Meganectes) brevis Aube), 장수풍뎅 이, 늦반딧불이, 왕바구미 (Sipalinus gigas gigas(Fabricius)), 산제비 나비 등이 높은 활성을 보여 주었다. 추출물질에 따라 차이를 보였으나비교적 높은 극성을 가진 용매인 ethan이과 methan이에 녹인추출물에서 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈다 (Fig.
- DW 추출물의 경우 좀사마귀, 물땡땡이, 배 추흰나비 , 남방노랑나비 , 왕오색 나비 (Sasakia charonda (Hewitson)) 등이 활성이 높게 나타났으며, DMSO 추출물에 있어서는 사마귀, 왕사마귀, 방아깨비, 팥중이, 참뜰길앞잡이 등이 높은 활성을 보였다. 상대적으로 낮은 활성을보인 ethanol 과 methanol 주줄물에 있어서는 사마귀, 왕사마귀 등이 좋은 활성을 나타내었다 (Fig. 4). 이들은 강력한항산화제인 BHA, BHT 와 비교해 봤을 때 나은 산화 억제효과를 보였다.
- DPPH(1, 1-Diphenyl- 2-picrylhydrazyl) 화합물로서 그 자체가 매우 안정한 화합물인데 hydroxyl proton radical scavenger 에 의해서 색이 바뀌는 성질을 이용한 것으로 눈으로 쉽게 그 활성을 관찰할수 있을 뿐만 아니라, Optical Density(OD) 를 측정하여 그활성 정도를 비교할 수 있다. 실험 결과 DW 추출물에 있어서는 사마귀 (Teodene angustipennis Saussure), 장수풍뎅 이 (Allomyrina dichotoma Linn), 늦반딧불이 (fyrocoela rupa Olivier), 산제 비 나비 (JOpilio maaki Mntris) 등이 상대적으로 높은 활성을 나타났다. DMSO 의 추출물에서는 활성이낮게 나왔으나, 욍사마귀 (Tenodera aridifolia (Stoll)), 물땡땡이 (Hydrophilus acuminatus Motschulsky) 등에서 비교적높은 활성을 나타냈다.
- 과산화 지질 (linoleic acid) 에 의해 Fe 가 Fe" 가 Fee 로 산화되게 되고 Fee는 ammonium thiocyanate 와 반응해서 붉은색으로 변하게 되는데 이것을 490 nm 에서 정량한 것이다. 실험 결과, DW와 DMSO 추출물에서 좋은 활성을 보였다. DW 추출물의 경우 좀사마귀, 물땡땡이, 배 추흰나비 , 남방노랑나비 , 왕오색 나비 (Sasakia charonda (Hewitson)) 등이 활성이 높게 나타났으며, DMSO 추출물에 있어서는 사마귀, 왕사마귀, 방아깨비, 팥중이, 참뜰길앞잡이 등이 높은 활성을 보였다.
- 실험 결과, methanol 추출물에서 전반적으로 높은 활성을 나타냈으며 그 중 왕잠자리, 물사마귀, 사마귀, 섬서구메뚜기, 벼메뚜기, 끝검은메뚜기, 팥중이, 늦반딧불이 등이 특히 높은 활성을 보였다. DW 추출물의 경우에는 좀사마귀, 사마귀, 왕사마귀, 방아깨비 (Acrida cinerea cinerea (Thunberg)), 장수쐐기나방, 호랑나비 (Papilio xuthus Linn) 등이, DMSO 추출물의 경우는 사마귀, 왕사마귀, 팥중이, 게아재비 (Ranatra chinensis Mayr), 장수쐐기나방, 산제비나비, 호랑나비 등이, 그리고 ethanol 추출물에서는 왕잠자리 (Anax parthenope Julius Brauer), 물사마귀, 사마귀, 팥중이, 장수풍뎅이, 늦반딧불이 등이 좋은 활성을 나타냈다.
- Fe"와 H2O2가 반응하는 Fenton 반응에 의해 생성되어진 hydroxyl radical 이 2-deoxyrebose 를 산화시켜 MDA (malondaldehyde) 로 분해시키며 이때 생성된 MDA는 세포막 지질성분인 불포화 지방산이 산화스트레스를 받으면생성되는 대표적인 과산화지질 물질로서 세포 손상이나세포막 구성 물질들의 변형을 야기시키는 원인이 된다. 실험을 통해 나타난 MDA 농도 변화를 살펴보면, 시료를 넣지않은 것에 비해 methanol 추출물을 넣은 실험군의 농도가대부분 낮게 나타난 것을 볼 수 있으며, 좀사마귀, 풀색꽃무지 (Gametis jucunda Faldermann), 칠성무당벌레 (Coccinella septempunctata Linn), 무당벌레 (Harmonia axyridis (Pallas)), 열점박이별잎벌레(Oides decempunctatus (Billberg)), 남방노랑나비 등을 넣은 실험군에서는 추출용매에 상관없이공통적으로 MDA 농도가 낮은 것을 볼 수 있다(Fig. 3). 이를 통해 약용곤충추출물이 혈중 과산화지질 수준을 저하시킨다는 것을 알 수 있다.
- 이러한 관점에서 본 연구는 지금까지 많은 연구가 이루어져 있지 않은 약용곤충추출물로부터 산화스트레스 유발 물질인 superoxide 를 억제하여 뇌 손상 억제와 보호 효과를 가져오는 식품소재를 HTS 시스템을 이용하여 알아보고자 하였다(26). 이상의 결과를 종합하면 HTS 스크리닝 시스템의 구축과 이 시스템을 사용하여 가장 뛰어난 항산화 활성을 가지고 분자염증에 유효하리라 판단되는 추출물질은 사마귀, 무당벌레였으며, 특히 무당벌레는 대량적으로 확보가 용이하다는 점이 향후 산업화에 매우 유리하다고 판단된다. 이에 위의 실험에서 나온 몇 가지 물질을 이용하여 더 구체적인 메커니즘에 대해 연구해 볼 계획이다.
- DW 추출물의 경우에는 좀사마귀, 사마귀, 왕사마귀, 방아깨비 (Acrida cinerea cinerea (Thunberg)), 장수쐐기나방, 호랑나비 (Papilio xuthus Linn) 등이, DMSO 추출물의 경우는 사마귀, 왕사마귀, 팥중이, 게아재비 (Ranatra chinensis Mayr), 장수쐐기나방, 산제비나비, 호랑나비 등이, 그리고 ethanol 추출물에서는 왕잠자리 (Anax parthenope Julius Brauer), 물사마귀, 사마귀, 팥중이, 장수풍뎅이, 늦반딧불이 등이 좋은 활성을 나타냈다. 전체적으로 추출 용매에 관계없이 활성이 높게 나온 것으로는 사마귀, 왕사마귀, 늦반딧불이 등이었으며, 이들은 수용성 비타민 E성분으로서 항산화 효과가 뛰어나 널리 사용되고 있는 Trolox 보다 더 좋은 활성을 가지는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- Ethanol 과 methanol 추출물에서는비슷하게 높은 활성 경향을 나타냈으며 특히 사마귀, 팥중이 (Odealeus infernalis Saussure), 검정물방개 (Cybister (Meganectes) brevis Aube), 장수풍뎅 이, 늦반딧불이, 왕바구미 (Sipalinus gigas gigas(Fabricius)), 산제비 나비 등이 높은 활성을 보여 주었다. 추출물질에 따라 차이를 보였으나비교적 높은 극성을 가진 용매인 ethan이과 methan이에 녹인추출물에서 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈다 (Fig. 1).
후속연구
- 그러나 현대 생활에서는 스트레스, 음주, 과식, 흡연, 자외선 등의 외부 요인에 의해 영향을 받아 산화 스트레스의 정도가 증가되어 인체의 자체적인 항산화 기능만으로는 증가된산소유리기를 처리하기 어렵다. 따라서 그 대안으로 비타민 E, 비타민 C, 베타-카로틴, 셀레늄과 같은 추가적인 항산화물을 식품을 통해 섭취하는 것이 필요하다고 여겨진다. 더구나 일련의 단계로 진행되는 신경염증 반응, 특히 노인성 치매에 있어서의 산화 질소 (nitric oxide) 와 같은 산화스트레스는 신경세포의 단백질, DNA, 지방 등의 대사에 영향을 주어 중추신경세포사를 유발시켜 기억력과 같은 정신기능을 퇴화시킨다.
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