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문제 정의
- 최근의 연구결과를 비교하여 보면 한우와 일본의 화우와는 유전적으로 상당히 가까운 것으로 알려져 있으므로 한우에 존재하는 유전병이 화우에서 나타날 확률이 높으며 또한 일본 화우의 유전병이 한우에서 나타날 가능성이 상당히 높은 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구는 일본 화우에서 많이 발병하는 Band 3와 CHS 유전병을 한우에서 조사함과 동시에 앞으로 선발될 후보종모우와 보증종모우에서 이런 유전병을 확인할 수 있는 기초 실험을 하기 위하여 본 연구를 수행하였다.
- 최근에 일본에서는 흑모화우에 존재하는 유전병을 제거하기 위해 많은 노력을 들이고 있다. 본 연구는 일본의 흑모화우에 존재하는 유전병인 Band 3와 CHS의 존재 유무를 혈연관계가 없는 한우 22개체를 이용하여 PCR-RFLP 방법으로 확인하였다. 비록 한우에서 Band 3와 CHS 유전병을 가진 개체는 나오지 않았으나 본 연구에서 확립된 방법을 한우 보증종모우와 후보 종모우에서 확인하여 유전병을 가진 유전자가 다음 세대로 전달되는 것을 막을 필요성이 있다.
제안 방법
- -T easy vector(Promega, USA)를 이용하였다. Ligation 반응액은 PCR product 3㎕, 50ng/㎕ pGEM®-T easy vector 1㎕, 2× ligation reaction buffer 5㎕ 와 5 units T4 DNA ligase 1㎕를 혼합하여 실온에서 3시간 동안 incubation 시킨 후, DH5α cell에 transformation 하였고, 이를 통해 cloning된 vector 들은 Wizard Plus Minipreps DNA Purification system(Promega Co., USA)을 이용하여 plasmid DNA를 추출하였다. 추출된 plasmid DNA는 EcoRI의 처리에 의해 insert의 유무 및 정확한 insert size를 확인하였다.
- PCR 증폭 여부가 확인된 product를 FokI 처리에 의하여 polymorphism을 확인하였다. 제한효소 처리 반응액에는 3 unit의 FokI 0.
- 정확한 insert가 들어간 clone들의 염기서열을 결정하기 위하여 재조합된 plasmid DNA 200ng에 Bigdye terminator(PE Applied Biosystems, USA)를 사용하여 cycle sequencing reaction을 실시하였다. PCR은 PE 9600(PE Applied Biosystems, USA)을 이용하였고, 반응조건은 96℃에서 1초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분간으로 총 25회로 증폭시켰고, 반응이 끝난 PCR product는 ethanol로 정제하여 ABI 377 자동염기서열 분석장치(PE Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하고 분석하였다.
- PCR을 실시한 후 확인된 product는 sequencing으로 염기서열을 확인하기 위하여 cloning을 실시하였고, cloning을 하기 위하여 pGEM®-T easy vector(Promega, USA)를 이용하였다. Ligation 반응액은 PCR product 3㎕, 50ng/㎕ pGEM®-T easy vector 1㎕, 2× ligation reaction buffer 5㎕ 와 5 units T4 DNA ligase 1㎕를 혼합하여 실온에서 3시간 동안 incubation 시킨 후, DH5α cell에 transformation 하였고, 이를 통해 cloning된 vector 들은 Wizard Plus Minipreps DNA Purification system(Promega Co.
- 5㎕를 혼합하여 사용하였다. PCR의 반응조건은 94℃에서 5분 1회 실시한 후, 94℃에서 1분, 56℃에서 1분, 72℃에서 30초 총 35회로 증폭시켰고, 마지막으로 72℃에서 10분간의 조건으로 MJ Research thermocycler (MJ Research, USA)에서 PCR를 수행하였다. PCR이 끝난 후 증폭된 product 5㎕을 2%의 agarose gel에 전기영동하여 증폭여부 및 크기를 확인하였다.
- 5㎕를 혼합하여 사용하였다. PCR의 반응조건은 94℃에서 5분 1회 실시한 후, 94℃에서 40초, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 총 30회로 증폭시켰다. 그리고 마지막으로 72℃에서 10분간의 조건으로 MJ Research thermocycler(MJ Research, USA)에서 PCR를 수행하였다.
- 그리고 마지막으로 72℃에서 10분간의 조건으로 MJ Research thermocycler(MJ Research, USA)에서 PCR를 수행하였다. PCR이 끝난 후 증폭된 product 5㎕을 2%의 agarose gel에 전기영동하여 증폭여부 및 크기를 확인하였다.
- PCR의 반응조건은 94℃에서 5분 1회 실시한 후, 94℃에서 40초, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 총 30회로 증폭시켰다. 그리고 마지막으로 72℃에서 10분간의 조건으로 MJ Research thermocycler(MJ Research, USA)에서 PCR를 수행하였다. PCR이 끝난 후 증폭된 product 5㎕을 2%의 agarose gel에 전기영동하여 증폭여부 및 크기를 확인하였다.
- 5%가 CHS를 나타남을 확인하였다. 이와 같은 결과를 참조하여 한우에서도 CHS가 나타나는지의 여부를 확인하기 위해 Yamakuchi 등(2000)이 사용한 primer를 이용하여 165 bp의 PCR product를 확인할 수 있었으며 CHS 유전병 원인 polymorphism 유무를 조사하기 위하여 PCR-RFLP를 실시하였다. PCRRFLP는 FokI으로 확인할 수 있는데, 165 bp가 나타나는 경우에는 CHS를 나타내는 것이고, 정상인 경우에는 106 bp와 59 bp의 두개의 band만을 나타내는 것으로 Fig.
- 3㎕, 10× buffer 2㎕ 그리고, PCR product 15㎕를 첨가하여 최종부피를 20㎕가 되도록 하였고, 이 반응액을 37°C에서 overnight으로 incubation하여 PCR products가 완전히 절단되도록 하였다. 절단된 DNA단편은 3% agarose gel에 전기영동을 하여 polymorphism 여부를 확인하였다.
- 정확한 insert가 들어간 clone들의 염기서열을 결정하기 위하여 재조합된 plasmid DNA 200ng에 Bigdye terminator(PE Applied Biosystems, USA)를 사용하여 cycle sequencing reaction을 실시하였다. PCR은 PE 9600(PE Applied Biosystems, USA)을 이용하였고, 반응조건은 96℃에서 1초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분간으로 총 25회로 증폭시켰고, 반응이 끝난 PCR product는 ethanol로 정제하여 ABI 377 자동염기서열 분석장치(PE Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하고 분석하였다.
- PCR 증폭 여부가 확인된 product를 FokI 처리에 의하여 polymorphism을 확인하였다. 제한효소 처리 반응액에는 3 unit의 FokI 0.3㎕, 10× buffer 2㎕ 그리고, PCR product 15㎕를 첨가하여 최종부피를 20㎕가 되도록 하였고, 이 반응액을 37°C에서 overnight으로 incubation하여 PCR products가 완전히 절단되도록 하였다. 절단된 DNA단편은 3% agarose gel에 전기영동을 하여 polymorphism 여부를 확인하였다.
- , USA)을 이용하여 plasmid DNA를 추출하였다. 추출된 plasmid DNA는 EcoRI의 처리에 의해 insert의 유무 및 정확한 insert size를 확인하였다.
대상 데이터
- 이 연구에서 Band 3와 CHS 유전병을 확인하기 위해 사용된 공시재료는 축산연구소에서 사육된 근연관계가 먼 한우 22개체가 이용되었으며, 각 개체로부터 추출한 genomic DNA를 사용하였다.
이론/모형
- Band 3 유전자를 증폭하기 위해서 Inaba 등(1996)에 의해 보고된 primer를 사용하였고 (표 1), PCR reaction은 총 부피를 25㎕로 10ng 농도의 template genomic DNA 5㎕, 10 pmol oligonucleotide primer 1㎕, 2.5 mM dNTP 2㎕, 10× PCR buffer 2.5㎕ 그리고 2.5 units Taq polymerase(Genet bio, Korea) 0.5㎕를 혼합하여 사용하였다. PCR의 반응조건은 94℃에서 5분 1회 실시한 후, 94℃에서 40초, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 총 30회로 증폭시켰다.
- CHS의 PCR product를 얻기 위해 Yamakuchi 등(2000)에 의해 보고된 primer를 사용하였으며 (표 1), PCR reaction은 total volume을 25㎕로 10ng 농도의 template genomic DNA 5㎕, 10 pmol oligonucleotide primer 1㎕, 2.5 mM dNTP 2㎕, 10× PCR buffer 2.5㎕ 그리고 2.5 units Taq polymerase(Genet bio, Korea) 0.5㎕를 혼합하여 사용하였다. PCR의 반응조건은 94℃에서 5분 1회 실시한 후, 94℃에서 1분, 56℃에서 1분, 72℃에서 30초 총 35회로 증폭시켰고, 마지막으로 72℃에서 10분간의 조건으로 MJ Research thermocycler (MJ Research, USA)에서 PCR를 수행하였다.
성능/효과
- Band 3 유전자의 경우 유전자의 polymorphism은 PCR-RFLP로 확인할 수 없어 우선 PCR product들을 cloning하였고 이 cloning된 vector들을 sequencing하여 얻어진 염기서열을 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에서 확인한 결과 기존에 보고된 염기서열(NM_181036)과 100% 상동성을 보이며 한우의 167 bp 안에는 어떠한 polymorphism도 발견할 수 없었다. 일본 흑모화우에서도 Band 3의 이상은 수컷에서 0.
- 이와 같은 결과를 참조하여 한우에서도 CHS가 나타나는지의 여부를 확인하기 위해 Yamakuchi 등(2000)이 사용한 primer를 이용하여 165 bp의 PCR product를 확인할 수 있었으며 CHS 유전병 원인 polymorphism 유무를 조사하기 위하여 PCR-RFLP를 실시하였다. PCRRFLP는 FokI으로 확인할 수 있는데, 165 bp가 나타나는 경우에는 CHS를 나타내는 것이고, 정상인 경우에는 106 bp와 59 bp의 두개의 band만을 나타내는 것으로 Fig. 2의 결과에서 보면 모든 개체에서 polymorphsim이 없는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구에서 이용된 샘플에서는 CHS관련 유전자의 변이가 나타나지 않았으나, 이 결과만으로는 우리나라 전체 한우 집단 내에서 CHS가 없다고는 단정을 지을 수 없다.
- 2의 결과에서 보면 모든 개체에서 polymorphsim이 없는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구에서 이용된 샘플에서는 CHS관련 유전자의 변이가 나타나지 않았으나, 이 결과만으로는 우리나라 전체 한우 집단 내에서 CHS가 없다고는 단정을 지을 수 없다. 최근 Sasaki 등(2004)에 의해 일본 흑모화우의 CHS를 조사한 결과 수컷에서 4.
- 이미 밝혀진 nucleotide polymorphism 이외에 다른 부분의 polymorphism 존재 여부와 PCR-RFLP의 결과를 재확인하기 위해서 우선 PCR product들을 cloning하였고 이 cloning된 vector들을 sequencing하여 얻어진 염기서열을 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에서확인한 결과 AF114785와 100% 상동성으로 한우의 165 bp안에는 어떠한 polymorphism도 발견할 수 없었다. 그러나 본 연구에서 확립된 방법을 이용하여 한우의 보증종모우가 선발되기 전에 유전병에 관한 DNA test를 선발에 이용함으로서 유전병을 가진 유전자가 다음 세대로 전달되는 것을 막는데 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
- Band 3 유전자는 Inaba 등(1996)에 의해 일본 흑모화우에서 선천적으로 유전되는 구형적혈구증(spheocytosis)을 가지는 몇몇의 개체를 조사한 결과 Band 3 발현이 적음을 확인하였는데, 이 양상은 Band 3 유전자에 polymorphism으로 stop codon이 형성되어 완전한 Band 3 유전자를 만들지 못하게 되므로 나타나는 병증임을 보고하였다. 이와 같은 Band 3 유전자의 polymorphism을 한우에서 확인하기 위하여 Band 3 유전자를 증폭시키기 위해 PCR를 실시하였고, 전기영동하여 확인한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 한우 22개체 모두에서 Inaba 등(1996)이 보고한 것과 같은 크기의 145 bp의 PCR products가 증폭됨을 확인할 수 있었다.
- gov/BLAST/)에서 확인한 결과 기존에 보고된 염기서열(NM_181036)과 100% 상동성을 보이며 한우의 167 bp 안에는 어떠한 polymorphism도 발견할 수 없었다. 일본 흑모화우에서도 Band 3의 이상은 수컷에서 0.03%, 암컷에서 0.01%로 현저히 낮은 빈도를 나타내므로(Sasaki 등, 2004) 본 연구에서 사용된 22개체의 한우를 가지고는 이와 같은 polymorphism을 찾기가 어려웠던 것으로 판단되며, CHS와 마찬가지로 샘플의 수를 늘릴 경우에이 유전병을 가진 개체를 확인할 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- gov/BLAST/)에서확인한 결과 AF114785와 100% 상동성으로 한우의 165 bp안에는 어떠한 polymorphism도 발견할 수 없었다. 그러나 본 연구에서 확립된 방법을 이용하여 한우의 보증종모우가 선발되기 전에 유전병에 관한 DNA test를 선발에 이용함으로서 유전병을 가진 유전자가 다음 세대로 전달되는 것을 막는데 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
- 04%만이 발병하였다. 따라서 한우 집단에서도 이런 유전병의 원인유전자가 낮은 빈도로 존재할 가능성이 충분히 있으므로 더 많은 샘플을 가지고 연구를 해 볼 필요가 있으며 본 연구를 통해 CHS 유전병을 발견할 수 있는 기초자료를 수집한 것이 본 연구의 성과라고 할 수 있다.
- 본 연구는 일본의 흑모화우에 존재하는 유전병인 Band 3와 CHS의 존재 유무를 혈연관계가 없는 한우 22개체를 이용하여 PCR-RFLP 방법으로 확인하였다. 비록 한우에서 Band 3와 CHS 유전병을 가진 개체는 나오지 않았으나 본 연구에서 확립된 방법을 한우 보증종모우와 후보 종모우에서 확인하여 유전병을 가진 유전자가 다음 세대로 전달되는 것을 막을 필요성이 있다.
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