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문제 정의
- 본 연구는 임플랜트 재료로 널리 사용되고 있는 상용 순 티타늄 표면에 골 유사 아파타이트 층을 형성하여 생체활성을 부여할 목적으로 시행되었다. 준비한 시편을 48% HF, 62% HNO3 및 증류수의 혼합액으로 상온에서 2분 동안 산세 처리한 다음 97% H2SO4와 30% 压。2의 혼합 수용액에서 40°C로 1시간 동안 화학적으로 처리하고 400°C에서 1시간 동안 열처리하였다.
- 그러나 생체 내에서 이들 표면처리한 금속 시편에 대한 생체적합성에 관한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 이에 본 연구에서는 현재 인공 임플랜트 재료로 널리 사용되고 있는 상용순 Ti의 표면에 활성을 부여하기 위해 97% H2SO4와 30% H2O2의 혼합수용액으로 표면처리를 실시하여 생체활성도에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 상용순 티타늄 및 화학적으로 표면처리한 티타늄에 대하여 마우스 복부 피하조직에 이러한 시편을 삽입하여 시편 매식체 주위에 형성된 섬유성 결합조직 막을 조직학적인 방법으로 분석하여 생체적합성에 대한 평가를 하였으며, 시편의 구조적인 변화는 OM, XRD, SEM-EDX 및 XPS 등을 이용, 분석하였다.
제안 방법
- 또한 금속 시편이 주입된 실험동물들의 염증을 방지하기 위하여 항생제 doxycycline (tetracycline 계열)을 20 mg/kg 농도로 3일간 복강에 주사하였다. 금속 1종류마다 3개의 시편을 만들었고 마우스 1마리에 시편 1개를 삽입하였기 때문에 금속 1 종류에는 마우스 3마리가 배당되어 본 실험에 사용된 마우스는 총 12마리를 배당하여 4주간 사육하였다.
- 봉합하였다. 또한 금속 시편이 주입된 실험동물들의 염증을 방지하기 위하여 항생제 doxycycline (tetracycline 계열)을 20 mg/kg 농도로 3일간 복강에 주사하였다. 금속 1종류마다 3개의 시편을 만들었고 마우스 1마리에 시편 1개를 삽입하였기 때문에 금속 1 종류에는 마우스 3마리가 배당되어 본 실험에 사용된 마우스는 총 12마리를 배당하여 4주간 사육하였다.
- 시편의 표면활성을 조사하기 위해 유사 체액에 침적 처리하였고, 표면층의 변화를 조사하기 위해 TF-XRD, SEM, EDX 및 XPS로 분석하였다. 또한 본 실험에서 적용한 화학적인 표면처리 및 열처리를 실시한 시편의 생체적합성을 조사하기 위해 알루미늄과 스테인레스강 316L을 대조 군으로 하여 실험동물인 마우스의 복부 결합조직에 4주 동안 매식하였으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 5°C로 하였다. 또한, HBSS의 농도 변화를 방지하기 위해 2일 간격으로 용액을 교환하여 사용하였다. Table I은 실험조건에 대한 내용을 나타낸 것이다.
- 이에 본 연구에서는 현재 인공 임플랜트 재료로 널리 사용되고 있는 상용순 Ti의 표면에 활성을 부여하기 위해 97% H2SO4와 30% H2O2의 혼합수용액으로 표면처리를 실시하여 생체활성도에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 상용순 티타늄 및 화학적으로 표면처리한 티타늄에 대하여 마우스 복부 피하조직에 이러한 시편을 삽입하여 시편 매식체 주위에 형성된 섬유성 결합조직 막을 조직학적인 방법으로 분석하여 생체적합성에 대한 평가를 하였으며, 시편의 구조적인 변화는 OM, XRD, SEM-EDX 및 XPS 등을 이용, 분석하였다.
- Table I은 실험조건에 대한 내용을 나타낸 것이다. 소정의 실험이 종료된 시편에서 아파타이트 형성과정은 thin film 장치가 부착된 X-선회절기(XRD, Rigaku DmaxHI-A type)를 이용하여 분석하였고, 표면의 거칠기는 표면 조도 측정기 (Mitutoyo, SV-3000) 로, 형태학적 미세구조는 EDX가 부착된 주사전자현미경 (SEM, JEOL, JSM-6400)^-, 표면원소의 화학적 조성 및 전자구조를 X-선 광전자분석기 (XPS, MX-PEOBEX 이용, 분석하였다.
- 표면처리 후 시편을 증류수에서 세척한 후 60°C에서 24시간 건조하여, 승온 속도를 5 °C/min으로 400°C에서 1시간 동안 열처리하였다. 시편에서 아파타이트상 형성에 따른 생체활성 평가실험은 pH와 이온 농도가 사람의 혈장과 거의 유사하게 제조된 HESS (Hanks' Balanced Salts Solution, Sigma, H2387)에 calcium chloride dihydrate 0.185 g/L, magnesium sulfate 0.09767 g/L, sodium hydrogen carbonate 0.350 g/L를 첨가하여 사용하였다. 준비한 시편은 121°C에서 20분간 고압멸균 처리 및 건조 후, 5% CO2 Incubatoi■에서 15일 동안 침적하였으며, pH는 7.
- 준비한 시편을 48% HF, 62% HNO3 및 증류수의 혼합액으로 상온에서 2분 동안 산세 처리한 다음 97% H2SO4와 30% 压。2의 혼합 수용액에서 40°C로 1시간 동안 화학적으로 처리하고 400°C에서 1시간 동안 열처리하였다. 시편의 표면활성을 조사하기 위해 유사 체액에 침적 처리하였고, 표면층의 변화를 조사하기 위해 TF-XRD, SEM, EDX 및 XPS로 분석하였다. 또한 본 실험에서 적용한 화학적인 표면처리 및 열처리를 실시한 시편의 생체적합성을 조사하기 위해 알루미늄과 스테인레스강 316L을 대조 군으로 하여 실험동물인 마우스의 복부 결합조직에 4주 동안 매식하였으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 염색한 복부 조직 절편을 광학현미경으로 관찰하고 현미경에 부착된 IMT 디지털 카메라로 촬영 하여 Adobe Photoshop (Adobe System, Inc., San Jose, CA)에 저장하였다. 조직적합성을 평가하기 위하여 현미경상에 나타난 금속 시편 매식재료를 둘러싸는 섬유성 결합조직막의 두께를 IMT Software (Size Analysis Program)를 이용 측정하였다.
- 0 伽 두께의 절편을 만들어 슬라이드에 올렸다. 조직 염색방법인 hematoxylin-eosin을 사용하여 염색하고 현미경으로 관찰하였다.
- 한편 본 실험에서는 화학적 표면처리의 영향에 의한 상호 생체 활성을 평가하기 위해 상용순 티타늄에 대해 97% H2SO4와 30% H2O2의 l:l(vol %) 혼합 수용액에서 40°C로 1시간 동안 화학적으로 표면처리를 실시하였다. 표면처리 후 시편을 증류수에서 세척한 후 60°C에서 24시간 건조하여, 승온 속도를 5 °C/min으로 400°C에서 1시간 동안 열처리하였다.
- 한편 실험동물에 대한 시편의 주입은 완전히 마취된 쥐의 복부 털을 제거한 다음, 소독용 가위를 이용 피부 한 군데를 금속 시편이 들어갈 수 있는 3 mm 크기로 절개하여 , 피부와 복부 근육의 결합조직 부위에 멸균된 시편 1개를 넣었으며, 절개부위를 봉합사로 봉합하였다. 또한 금속 시편이 주입된 실험동물들의 염증을 방지하기 위하여 항생제 doxycycline (tetracycline 계열)을 20 mg/kg 농도로 3일간 복강에 주사하였다.
- 희생된 쥐를 눕혀서 고정하고 다시 자라난 복부의 털을 제거한 다음 시편이 들어있는 부위를 중심으로 복부 피부와 근육을 동시에 잘라내어 4% glutaralde hyde 용액에 48시간 고정하였다. 핀셋으로 결합조직에 있는 금속 시편을 빼낸 다음 잘라낸 복부 조직을 동일한 고정 용액인 4% glutaraldehyde에 , 포매하기전까지 보관하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 실험동물은 평균 무게가 33 g인 생후 10주된 ICR계 마우스 암컷 12마리로 사육 상자당 3마리씩 넣어 사육하였다. 실험동물의 먹이로는 실험용 펠레트 사료와 식이용 물로서 일차 증류수를 공급하였다.
- 본 연구에 사용한 시편은 공업용 순 티타늄 판(N 0.006, C 0.014, H 0.002, Fe 0.08, 0 0.130, Tibal., Titania Co, ITALY)을 10x 10x1 mm의 크기로 절단하여 사용하였다. 준비한 시편을 #240-#1200의 emery paper로 연마 후 모든 시편을 48% HF, 62% HNO3 및 증류수 1 : 1.
- 멸균처리하여 사용하였다. 실험동물에 사용된 마취제는 sodium pentobarbital로 50 mg/kg의 농도로 복강에 주입하여 마취시켰다.
- 실험동물에 주입된 시편들은 3x3x1 mm의 크기로 표면처리하지 않은 순 티타늄, 본 실험에서 적용한 화학적 표면처리를 실시한 순 티타늄, 비교군으로 알루미늄 및 스테인레스강 316LS] 4종이었으며 , 상기 시편들을 실험동물에 주입하기 전에 70% 에탄올에 2시간 담가두어 소독한 다음 멸균기에 넣어 가압 멸균처리하여 사용하였다. 실험동물에 사용된 마취제는 sodium pentobarbital로 50 mg/kg의 농도로 복강에 주입하여 마취시켰다.
- , Titania Co, ITALY)을 10x 10x1 mm의 크기로 절단하여 사용하였다. 준비한 시편을 #240-#1200의 emery paper로 연마 후 모든 시편을 48% HF, 62% HNO3 및 증류수 1 : 1.5 : 6(vol%)으로 용액을 제조하여 상온에서 2분 동안 산세한 후, 증류수에서 초음파 세척하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 섬유성 막 두께 측정은 1마리의 마우스 복부조직 절편에서 10군데씩 측정하여 한 시편 당 총 30군데의 섬유성 결합조직막의 두께를 측정하여 Excel 프로그램을 이용, 그 평균값과 표준편차 값을 구하였다. 각 금속 종류간의 유의한 차이는 one-way ANOVA 방법을 이용하였으며 t-test에서 R0.05 일 때 유의한 차이가 있는 것으로 하였다.
- 조직적합성을 평가하기 위하여 현미경상에 나타난 금속 시편 매식재료를 둘러싸는 섬유성 결합조직막의 두께를 IMT Software (Size Analysis Program)를 이용 측정하였다. 섬유성 막 두께 측정은 1마리의 마우스 복부조직 절편에서 10군데씩 측정하여 한 시편 당 총 30군데의 섬유성 결합조직막의 두께를 측정하여 Excel 프로그램을 이용, 그 평균값과 표준편차 값을 구하였다. 각 금속 종류간의 유의한 차이는 one-way ANOVA 방법을 이용하였으며 t-test에서 R0.
이론/모형
- , San Jose, CA)에 저장하였다. 조직적합성을 평가하기 위하여 현미경상에 나타난 금속 시편 매식재료를 둘러싸는 섬유성 결합조직막의 두께를 IMT Software (Size Analysis Program)를 이용 측정하였다. 섬유성 막 두께 측정은 1마리의 마우스 복부조직 절편에서 10군데씩 측정하여 한 시편 당 총 30군데의 섬유성 결합조직막의 두께를 측정하여 Excel 프로그램을 이용, 그 평균값과 표준편차 값을 구하였다.
성능/효과
- 또한 Fig. 1의 (e)는 97% H2SO4와 30% H2O2의 l:l(vol %) 혼합수용액에서 40°C로 1시간 동안 화학적으로 표면처리한 후 HBSS에 15일 동안 침적한 시편의 EDX 분석 결과로서 , 시편 표면에 아파타이트의 주성분인 Ca과 P 이온이 검출되고 있음을 확인할 수 있다. Fig.
- 1. 상용 순 티타늄의 화학적 표면처리로 생체 내에서 아파타이트 석출에 기여할 수 있는 비정질의 titania hydrogel 층이 형성 되었으며 , 평균 표면 거칠기는 2.175 伽로 증가된 양상을 보였다
- 2. 400°C에서 1시간 열처리 시 비정질의 titania hydrogel 층이 성장한 anatase 상으로 변화되 었으며 , HBSS에 침적 시 시편 표면에 Ca과 P의 성분을 가진 구형의 균일한 아파타이트가 석출되었다.
- 또한, Lee"* H2O2와 TaC*의 금속염 화물이 혼합된 수용액에서 티타늄 및 티타늄 합금에 대하여 화학적인 표면처리를 실시하여, 그 표면에 티타니아 겔 층을 형성하였으며, 400°C에서 1시간 동안 열처리 시 비정질의 티타니아 겔층이 결정질로 변하며, 이렇게 표면처리 한 시편을 유사 체액에 침적 시 표면에 구형의 아파타이트층이 형성되어 생체 활성을 띤다고 하였다. 본 실험에서도 97% H2SO4와 30% 压。2의 l:l(vol %) 혼합수용액에서 40°C로 1시간 동안 화학적으로 표면처리와 열처리를 수행한 시편에서 결정립 내에 표면의 조도가 증가된 조직이 관찰되며, HBSS에 15일 동안 침적한 시편에서 구형의 아파타이트가 표면 전체에 형성되었고, EDX 및 XPS 분석 결과 기지의 Ti와 Ca 및 P의 이온이 검출된 것으로 보아 화학적 표면처리가 생체활성도에 영향을 미친다고 판단할 수 있다. 또한, Wang 등期은 열처리 온도가 400P에서부터 rutile의 피크가 생성되기 시작하여 온도가 증가될수록 anatase 피크의 회절강도가 감소하는 반면 rutile의 상대적 강도는 증가한다고 하였다.
- 3.마우스의 복부 결합조직 내 매식된 금속 시편들을 둘러싼 섬유성막의 평균 두께는 화학적 표면처리를 실시한 티타늄에서 46.98 伽로 무처리 상용시편인 티타늄, 알루미늄 및 스테인레스 스틸 316L에서 각각 52.20 Km, 168.65 四 및 100.95 四 보다 막의 평균 두께가 감소함으로써 생체적합성이 우수하였다.
- 또한, Wang 등期은 열처리 온도가 400P에서부터 rutile의 피크가 생성되기 시작하여 온도가 증가될수록 anatase 피크의 회절강도가 감소하는 반면 rutile의 상대적 강도는 증가한다고 하였다. 따라서 이들의 연구 결과들을 비교해 볼 때, 상용 순 Ti를 97% H2SO4와 30% H2O2의 l:l(vol %) 혼합수용액에서 40°C로 1시간 동안 화학적으로 표면처리를 한 후, 400°C에서 1시간 동안 열처리 공정을 적용한, 본 실험의 경우, 沖가 25° 및 48° 부근에서 titania의 비정질 층의 형성은 화학적 표면처리에 의해 생성된 것이며, 이러한 비정질층이 400°C에서 1시간 동안의 열처 리에 의해 anatase의 결정상으로 성장한 것으로 판단된다.
- 따라서 이러한 X-선회절 및 조직 사진 결과로 미루어 볼 때, 상용 금속 시편에 아무런 처리를 하지 않고 유사 체액인 HBSS에 침적할 경우, 인체 내의 골 및 조직과의 용이한 결합을 촉진하는 아파타이트 상의 형성을 기대하기 어려운 반면, 본 실험에서 적용한표면처 리를 실시할 경우, 시편 표면에 생체활성을 부여하여 아파타이트 상의 유도가 용이하며 생체적합성도 우수한 것으로 판단된다.
- 따라서 이 막의 구조는 아래의 느슨한 기존의 결합조직과 명확하게 구별되었으며 막의 섬유를 형성하는 섬유모세포 및 세포 활동성이 적은 섬유세포가 막내에 존재하였다. 또한 비교군으로 삽입 한 알루미늄과 스테인레스강 316L을 삽입한 경우, 각각 168.65 yin 및 100.95 伽로 나타나 실험군인 티타늄에 비해 유의한 차이를 보였다.(Fig.
- 细> 이 처럼 매식체를 둘러싸는 섬유성막은 생체적합성 평가에 잘 이용될 수 있다. 본 실험에서는 표면 처 리 하지 않은 순수한 티타늄 시편을 삽입한 경우, 형성된 막의 두께는 52.20 伽이며, 97% H2SO4와 30% H2O2 의 l:l(vol %) 혼합수용액에서 40°C로 1시간 동안 화학적인 표면처리를 실시한 후, 400°C에서 1시간 동안 열처리한 시편의 경우, 표면 처리하지 않은 시편보다 더 얇은 46.93 四로 나타나 유의한 차이를 보이지 않았다.(Fig.
- 비교적 섬유성막의 두께가 얇게 형성된 티타늄 및 화학적으로 표면 처리한 시편의 조직을 보면 막의 두께가 얇은 것은 물론 막 자체의 결합 조직도 두꺼운 막이 형성된 알루미늄이나 스테인레스강에 비해서 섬유 조직이 성글고 또 섬유 사이에 있는 섬유 모세포나 혹은 섬유세포의 수량도 적게 나타났다.
- 위에서 넓은 비정질 피크가 형성된 것으로 보아 본 실험에 적용한 표면처리에 의해 비정질 titania가 형성되었음을 알 수 있다. 더욱 이 비정질층을 400°C 에서 1시간 동안 열처리를 하면 anatase 결정상으로 변화됨을 Fig.
- 이런 결과는 Lee"" 가 보고한 내용에서도 볼 수 있는데 순수한 티타늄보다 티타늄 합금이나 대조군인 스테인레스 강 주위에 형성된 막의 두께가 더 두꺼운 경향을 보여 적합성이 떨어지는 것으로 되어 있다. 이런 결과로 볼 때본 실험에서 적용한 화학적 표면처리의 티타늄의 생체적합성이 더 우수한 것으로 생각된다.
- 마우스의 복부 부위에서는 피부와 결합조직으로 구성된 피하조직이 hematoxylin과 eosin에 이중 염색되어 잘 관찰되었다. 전체적으로 삽입된 금속 시편을 둘러싸는 새롭게 형성된 결합조직막은 시편 삽입 전의 기존 결합조직과는 뚜렷하게 구분되었다. 새롭게 형성된 결합조직 막에는 섬유 사이사이에 비교적 규칙적으로 섬유모세포 혹은 섬유세포가 배열되어 있었으며 대식세포도 관찰되었다.
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