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제안 방법
- Native condition에서는 단백질 발현이 인정되지 않았기 때문에 순수분리는 시도되지 않았다. Denaturing condition으로 준비된 상층액 시료는 8M urea가 포함된 binding buffer, washing buffer 그리고 elution buffer를 이용하는 Ni2+-charged resin affinity purification kit(Probond; Invitrogen, USA)를 이용하여 순수분리 하였고 eluted fraction을 SDS-PAGE를 통해 분리정도를 알아보았다. 순수분리된 단백질의 농도는 Bradford법에 기초한 Bio-Rad Protein assay kit(BioRad, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 8 kb)를 확인하였고 PCR purification kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 gel elution을 실시하였다. Elution한 증폭 산물을 제한효소 BamHI과 HindIII 또는 EcoRI(Promega, USA)를 사용하여 PCR 산물 양단에 restriction site를 sticky-end로 만든 다음, 위의 각각의 두 제한효소로 처리한 prokaryotic expression vector인 pRSET와 ligation을 실시하여 2개의 construct(pRSET-Apx I과 pRSET-Apx II)를 생산하였다. pRSET vector는 affinity binding을 위해 N-terminal fusion peptide로 6개의 Histidine을 발현하도록 되어 있다.
- Sequencing을 통해 insert의 존재 및 ORF의 확인을 마친 transformant로부터 분리된 construct는 재조합 단백질 발현을 위해 대장균 발현용 competent cell인 BL21(DE3)pLysS에 transformation 시켰다. Transformant는 100 ug/ml ampicillin과 35 ug/ml chloramphenicol이 함유된 LB agar plate에서 배양 후 단독 colony를 선택하였다.
- coli JM109에 transformation 시키고 100 ug/ml ampicillin이 첨가된 LB agar plate에서 배양하였다. 배양된 colony에서 QIAprep Spin Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 plasmid를 추출한 다음 각각 2개의 제한효소(Apx I은 BamHI+HindIII, Apx II는 BamHI+EcoRI)로 처리하여 insert 유무를 확인하고 insert의 size가 확인된 것은 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 sequencing을 실시하여 vector내의 open reading frame(ORF)의 shift 여부를 확인하였다.
- Transformant는 100 ug/ml ampicillin과 35 ug/ml chloramphenicol이 함유된 LB agar plate에서 배양 후 단독 colony를 선택하였다. 선택된 colony는 LB broth에서 배양 후 단백질 발현을 위해 IPTG 첨가하고 0, 1, 2, 3시간 간격으로 1ml씩 시료를 채취하였다. 채취된 시간별 시료는 native condition 및 denaturing condition의 조건으로 구분하여 단백질 발현 여부를 검사하였다.
- 유전자의 cloning을 위한 DNA 염기 서열 정보는 GenBank accession number AF363361과 AF363362를 기초로 하여 Apx I은 5’에 BamHI, 그리고 3’에 HindIII site를, Apx II의 경우는 5’에 BamHI, 그리고 3’에 EcoRI site를 만들어서 PCR로 증폭하였다. PCR에 사용된 각각의 primer의 정보는 Table 1에 명시하였다.
- 1A과 같이 3069 bp(Apx I) 및 2871 bp(Apx II) 크기의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 이들을 pRSET vector와 ligation하여 생산된 두 개의 construct, pRSET-Apx I과 pRSET-Apx II를 제한효소로 처리하여 insert의 size를 확인하였고(Fig. 1B), sequencing을 통하여 ORF의 frame shift 여부를 확인하였다.
- 국내에서도 신 등 [1]이 Apx I, Apx II 그리고 Apx III에 대한 재조합 단백질 발현 실험을 실시하였으나 그 발현량이 너무 소량이어서 Western blot을 이용한 실험에서 검출될 정도여서 재조합 단백질 백신으로써의 응용에 어려움이 있었다. 이에 본 실험은 재조합 단백질을 이용한 백신 연구의 일환으로 먼저 대장균 발현 시스템을 이용하여 Apx I과 Apx II를 발현시키고 높은 회수율을 위해 guanidium을 이용, denaturing condition 하에서 다량의 재조합 Apx toxin을 확보하는 방법을 확립하였다.
- Native condition은 다음과 같이 실시하였다. 준비된 배양액 시료를 원심분리(10,000×g/10 min) 후 상층액을 버리고 pellet을 100 ul의 PBS에 재부유 후 2X sample buffer(125 mM Tris-Cl, 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0.2% bromophenol blue, pH 6.8) 100 ul를 첨가하고 5분간 boiling한 뒤 SDS-PAGE를 통해 단백질을 전개하였다.
- 먼저 94℃/3분간 pre-denature후, 94℃/40초, 55℃/40초, 72℃/4 min을 30회 반복하고 최종 72℃/7분간 final extension을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% agarose gel에서 그 size (각각 3.0 kb와 2.8 kb)를 확인하였고 PCR purification kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 gel elution을 실시하였다. Elution한 증폭 산물을 제한효소 BamHI과 HindIII 또는 EcoRI(Promega, USA)를 사용하여 PCR 산물 양단에 restriction site를 sticky-end로 만든 다음, 위의 각각의 두 제한효소로 처리한 prokaryotic expression vector인 pRSET와 ligation을 실시하여 2개의 construct(pRSET-Apx I과 pRSET-Apx II)를 생산하였다.
- 선택된 colony는 LB broth에서 배양 후 단백질 발현을 위해 IPTG 첨가하고 0, 1, 2, 3시간 간격으로 1ml씩 시료를 채취하였다. 채취된 시간별 시료는 native condition 및 denaturing condition의 조건으로 구분하여 단백질 발현 여부를 검사하였다.
대상 데이터
- pleuropneumoniae serotype 5 표준균주를 분양받아 실험에 이용하였다. Cloning 및 expression에 사용된 competent E. coli JM109 및 BL21(DE3)pLysS 균주는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 균주에서 genomic DNA의 분리 및 단백질 분리 등의 작업은 Sambrook 등 [13]과 Ausubel 등 [2]에 준하여 실시하였다.
- 연구에 사용된 균주는 국립수의과학검역원에서 A. pleuropneumoniae serotype 5 표준균주를 분양받아 실험에 이용하였다. Cloning 및 expression에 사용된 competent E.
이론/모형
- coli JM109 및 BL21(DE3)pLysS 균주는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 균주에서 genomic DNA의 분리 및 단백질 분리 등의 작업은 Sambrook 등 [13]과 Ausubel 등 [2]에 준하여 실시하였다.
- Denaturing condition으로 준비된 상층액 시료는 8M urea가 포함된 binding buffer, washing buffer 그리고 elution buffer를 이용하는 Ni2+-charged resin affinity purification kit(Probond; Invitrogen, USA)를 이용하여 순수분리 하였고 eluted fraction을 SDS-PAGE를 통해 분리정도를 알아보았다. 순수분리된 단백질의 농도는 Bradford법에 기초한 Bio-Rad Protein assay kit(BioRad, USA)를 이용하여 측정하였다.
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