배 경 : 에탐부톨의 내성여부는 결핵 환자 처방 결정에 있어서 중요 변수의 하나가 된다. 에탐부톨 내성의 상당부분이 embB 유전자의 돌연변이와 관계가 있으므로 역교잡반응법으로 이 유전자의 돌연변이를 신속하게 검출하고자 하였다. 방 법 : 에탐부톨 내성에 관련된 embB 유전자의 306번, 406번, 497번 아미노산의 정상적인 염기서열과 돌연변이 염기서열에 대한 probe를 합성하였고, 약제감수성검사에서 에탐부톨 내성균으로 나타난 149균과 전약제 감수성으로 나타난 50개균을 대상으로 조사하였다. 결 과 : 149개의 에탐부톨 내성균 중에서 embB 유전자 전체에서 돌연변이가 나타난 균은 100균주(67.1%)였으며, 그 중 embB 유전자 중 306번 돌연변이를 가진 균주가 75주(50.3%), 406번 돌연변이를 가진 균주가 16주(10.7%), 497번 돌연변이가 있는 균주가 13주(8.7%)였다. 이 중 4균주는 306번과 406번 돌연변이를 동시에 가지고 있었다. 406번 돌연변이 하나만 가지고 있는 균은 12균주(8.1%)로 이는 다른 조사에서 볼 수 없었던 비교적 높은 수치이었다. 한편 에탐부톨 및 11가지 항결핵약제에서 감수성인 50개균에서는 embB 유전자의 돌연변이를 발견하지 못하였다. 결 론 : 역교잡반응법으로 에탐부톨 내성에 관련되어 있는 것으로 알려진 embB 유전자 돌연변이를 찾는 것이 가능하였으며, 에탐부톨 내성기전 및 관련 유전자가 더 발견되어 민감도가 향상된다면 신속한 에탐부톨내성균 검출이 가능할 것으로 본다.
배 경 : 에탐부톨의 내성여부는 결핵 환자 처방 결정에 있어서 중요 변수의 하나가 된다. 에탐부톨 내성의 상당부분이 embB 유전자의 돌연변이와 관계가 있으므로 역교잡반응법으로 이 유전자의 돌연변이를 신속하게 검출하고자 하였다. 방 법 : 에탐부톨 내성에 관련된 embB 유전자의 306번, 406번, 497번 아미노산의 정상적인 염기서열과 돌연변이 염기서열에 대한 probe를 합성하였고, 약제감수성검사에서 에탐부톨 내성균으로 나타난 149균과 전약제 감수성으로 나타난 50개균을 대상으로 조사하였다. 결 과 : 149개의 에탐부톨 내성균 중에서 embB 유전자 전체에서 돌연변이가 나타난 균은 100균주(67.1%)였으며, 그 중 embB 유전자 중 306번 돌연변이를 가진 균주가 75주(50.3%), 406번 돌연변이를 가진 균주가 16주(10.7%), 497번 돌연변이가 있는 균주가 13주(8.7%)였다. 이 중 4균주는 306번과 406번 돌연변이를 동시에 가지고 있었다. 406번 돌연변이 하나만 가지고 있는 균은 12균주(8.1%)로 이는 다른 조사에서 볼 수 없었던 비교적 높은 수치이었다. 한편 에탐부톨 및 11가지 항결핵약제에서 감수성인 50개균에서는 embB 유전자의 돌연변이를 발견하지 못하였다. 결 론 : 역교잡반응법으로 에탐부톨 내성에 관련되어 있는 것으로 알려진 embB 유전자 돌연변이를 찾는 것이 가능하였으며, 에탐부톨 내성기전 및 관련 유전자가 더 발견되어 민감도가 향상된다면 신속한 에탐부톨내성균 검출이 가능할 것으로 본다.
Background : Ethambutol (EMB) is one of important first-line drug in the treatment of tuberculosis. Molecular techniques to detect embB gene mutations have been considered as an method to define the EMB resistance. We investigated the mutation rate within embB gene among EMB resistant strains using ...
Background : Ethambutol (EMB) is one of important first-line drug in the treatment of tuberculosis. Molecular techniques to detect embB gene mutations have been considered as an method to define the EMB resistance. We investigated the mutation rate within embB gene among EMB resistant strains using reverse hybridization techniques. Methods : We made 11 probes that had wild or mutated sequences containing codons 306, 406, or 497 within embB gene respectively. These probes were reverse-hybridized with PCR products amplified from embB gene which were isolated from 149 ethambutol resistant strains and 50 pan-susceptible strains. Results : Out of 149 ethambutol resistant strains, one hundred (67.1%) had mutation at least one base at codon 306, 406, or 497 in embB gene. Mutation at codon 306, 406, 497 were demonstrated in 75 (50.3%), 16 (10.7%), and 13 strains (8.7%) respectively. There were four strains that showed multi-mutation at codon 306 and codon 406 simultaneously. A high proportion (8.1%) had single mutation at codon 406. There was no mutation observed in embB gene among 50 pan-susceptible strains. Conclusion : Reverse hybridization will be useful technique for detection of gene mutation correlated to ethambutol resistance.
Background : Ethambutol (EMB) is one of important first-line drug in the treatment of tuberculosis. Molecular techniques to detect embB gene mutations have been considered as an method to define the EMB resistance. We investigated the mutation rate within embB gene among EMB resistant strains using reverse hybridization techniques. Methods : We made 11 probes that had wild or mutated sequences containing codons 306, 406, or 497 within embB gene respectively. These probes were reverse-hybridized with PCR products amplified from embB gene which were isolated from 149 ethambutol resistant strains and 50 pan-susceptible strains. Results : Out of 149 ethambutol resistant strains, one hundred (67.1%) had mutation at least one base at codon 306, 406, or 497 in embB gene. Mutation at codon 306, 406, 497 were demonstrated in 75 (50.3%), 16 (10.7%), and 13 strains (8.7%) respectively. There were four strains that showed multi-mutation at codon 306 and codon 406 simultaneously. A high proportion (8.1%) had single mutation at codon 406. There was no mutation observed in embB gene among 50 pan-susceptible strains. Conclusion : Reverse hybridization will be useful technique for detection of gene mutation correlated to ethambutol resistance.
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문제 정의
이 연구에서는 우리나라에서 분리된 에탐부톨내성인 결핵균의 embB 유전자 내 306번, 406번, 497번 아미노산의 돌연변이 분포 상태를 파악하고자 하였으며, 향후 이를 이용하여 신속한 에탐부톨 내성균 검출 가능성을 검토하고자 하였다.
전체 항결핵약제에 감수성인 균과는 달리 에탐부톨에는 감수성이나 기타 항결핵약제는 내성을 나타낸 결핵균 중에서는 embB 유전자 돌연변이가 발견된 경우가 있어서10, 본 연구에서는 에탐부톨 내성균 중에서 리팜핀 내성과 에탐부톨 embB 유전자 돌연변이와의 관련성 여부를 확인해보았다. 리팜핀에는 감수성이지만, 아이소니아짓과 에탐부톨에 동시 내성인 균 또는 이 두가지 약제 내성을 포함하여 기타 항결핵약제에도 내성을 갖는 균주가 20균주였다.
제안 방법
embB 유전자의 증폭을 위한 primer 및 돌연변이를 검출하기 위한 probe는 Table 1에 나타내었다. 돌연변이 검출을 위한 probe는 embB 유전자의 돌연변이를 잘 일으키는 306번 아미노산을 포함하는 codon 304-310, 406번 아미노산을 포함하는 codon 404-410, 그리고 497번 아미노산을 포함하는 codon 495-481 부위에서 정상적인 염기서열과 돌연변이 염기서열을 바탕으로 합성하였다. 이 probe들을 검출하기 위한 3종의 primer를 합성하였다.
돌연변이 검출을 위한 probe는 embB 유전자의 돌연변이를 잘 일으키는 306번 아미노산을 포함하는 codon 304-310, 406번 아미노산을 포함하는 codon 404-410, 그리고 497번 아미노산을 포함하는 codon 495-481 부위에서 정상적인 염기서열과 돌연변이 염기서열을 바탕으로 합성하였다. 이 probe들을 검출하기 위한 3종의 primer를 합성하였다.
, 각 primer 20 pM, 2 mM의 4가지 dNTP, 1 U의 Taq polymerase(AP-Biotech, Uppsala, Sweden) 및 50-200 ng의 DNA로 구성되었다. 중합효소 연쇄반응은 Perkin-Elmer 480 DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT. 06859 USA) 제품으로 실시하였다. 처음 denaturation 반응은 95℃ 에서 10분 하였고, 이후 95℃ 1분, 65℃ 1분, 72℃ 2분씩 중합효소 연쇄반응을 30회 반복하였으며 마지막 extention 반응으로 72℃ 10분을 실시하였다.
여러 유전자 돌연변이 검출을 위한 역교잡반응은 Kox 등의 방법을 적용하였다8,9. 즉 probe들을 dTTP로 tailing하여 나일론막 (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)에 고착시키고 cross blotter 기구(Accutran-Cross ACC 100/0; Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)를 이용하여 중합효소연쇄반응 산물을 역교잡으로 반응시켰다.
0 mcg/ml으로 하였으며, 대조배지 상 균 집락 수와 비교하여 1% 이상의 균이 발육 시 각 약제에 내성인 것으로 판정하였다. 피라지나마이드는 pyrazinamidase test로 내성 여부를 결정하였다7.
성능/효과
, 이 연구에서는 에탐부톨 내성균중에서 리팜핀 내성과 embB 유전자 돌연변이율은 관련이 없는 것으로 나타났지만, 향후 타 약제 내성이면서 에탐부톨 감수성인 균주들을 대상으로 이에 대한 조사가 추구 되어야 할 것이다. 그러나 이 연구에서 에탐부톨을 포함한 11가지 항결핵약제에서 감수성인 50개균에서는 embB 유전자의 돌연변이를 발견하지 못하였으며, 이는 전체 항결핵약제에 감수성균주에서는 embB 유전자 돌연변이를 발견한 경우가 없다는 다른 보고와 일치하였다.
1). 따라서 리팜핀내성과 embB 유전자 돌연변이 발생 간에 연관이 없는 것으로 나타났다. 실험에 사용된 에탐부톨 단독 내성인 균주 수는 너무 적었기에 비교하지 않았다.
3%로 이 연구 결과 보다 높았다19. 본 연구에서 406번 돌연변이는 10.7%이었는데, 이 중에 4균주는 306번 돌연변이를 동시에 가지고 있었으며, 406번 돌연변이 하나만 가지고 있는 균은 8.1%이었다. 이는 다른 연구결과들과 비교시에 매우 높은 수치이었다.
본 연구에서 Löwenstein-Jensen 배지를 이용한 기존 약제감수성 검사 방법으로 에탐부톨에서 내성인 것으로 밝혀진 149개 결핵균 중에서 embB 유전자 전체에서 돌연변이가 나타난 균주는 67.1%로 이는 Ramsawamy의 조사 결과인 68%와도 비슷하였다6. 또 본 연구에서 embB 유전자 중 306번 돌연변이는 50.
에탐부톨 내성균 149균주 중에서는 각 probe에 대한 돌연변이를 조사한 결과, embB 유전자의 306번째 아미노산인 Met의 돌연변이는 75균주(50.3%)였다. 그 중에서 Met → Val (atg → gtg) 돌연변이는 53균주(35.
에탐부톨 내성균 149주중 embB 유전자돌연변이를 나타낸 균은 모두 100균주(67.1%)였으며, 그 중 4균주는 중복돌연변이를 가지고 있었다(Table 2).
7%)에서 나타났다 (Table 3). 전체적으로 에탐부톨 내성인 균주 중에서, 리팜핀 내성인 그룹과 리팜핀 감수성인 그룹간에 통계적으로 유의한 차이는 없었다(p > 0.1). 따라서 리팜핀내성과 embB 유전자 돌연변이 발생 간에 연관이 없는 것으로 나타났다.
후속연구
Mokrousov 등의 보고에 따르면 타약제 내성이면서 에탐부톨 감수성인 균주중에서 embB 유전자 돌연변이가 존재한다는 보고도 있는 바10, 이 연구에서는 에탐부톨 내성균중에서 리팜핀 내성과 embB 유전자 돌연변이율은 관련이 없는 것으로 나타났지만, 향후 타 약제 내성이면서 에탐부톨 감수성인 균주들을 대상으로 이에 대한 조사가 추구 되어야 할 것이다. 그러나 이 연구에서 에탐부톨을 포함한 11가지 항결핵약제에서 감수성인 50개균에서는 embB 유전자의 돌연변이를 발견하지 못하였으며, 이는 전체 항결핵약제에 감수성균주에서는 embB 유전자 돌연변이를 발견한 경우가 없다는 다른 보고와 일치하였다.
역교잡반응법으로 에탐부톨 내성에 관련되어 있는 것으로 알려진 embB 유전자 돌연변이를 찾는 것은 가능하지만, 앞으로 에탐부톨 내성 기작과 연관된 유전자가 정확하게 규명되고 여러 유전자가 더 발견되어 민감도가 높아지면, 역교잡 방법을 이용한 결핵균의 에탐부톨 내성의 검출법의 활용도가 높아질 수 있을 것으로 예견된다.
참고문헌 (19)
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