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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 패류 중에서도 전 세계적으로 고부가 가치를 창출하는 중요한 수산자원인 전복을 이용하여 급격한 수온변화에 따른 생리학적인 반응을 간부위의 조직을 이용하여 HSP70 mRNA의 발현과 항산화효소인 SOD 및 CAT 등을 측정하여 스트레스에 대한 생리학적 지표를 설정하고자 본 연구를 실시하였다.
제안 방법
- 5 ul를 혼합하여 94℃에서 5분간 predenaturation 시켜준 후 94。(:에서 1분간 denaturation, 50℃에서 45초간 annealing, 7TC에서 1분간 extension 조건으로 30회 증폭하고, 이후 72。(2에서 5분간 더 반응시켰다. HSP70 mRNA에 대한 oligonucleotide primer를 제 작하여 (주)Bioneei에서 합성주문하였고, 양성대조로 사용하기 위해 P-actin mRNA를 제작하였다(Table 1). PCR로 증폭된 산 물은 1% agarose gel에서 100V로 전기영동하여 분리하였으며, lOObp DNA ladder를 size markerS.
- 급격한 수온 스트레스에 따른 HSP70의 변화를 관찰하기 위하여 수온과 시간대 별로 간부위의 조직에서 샘플을 적출하여 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과 RT-PCR를 통한 HSP70 mRNA 의 발현은 30。(2에서는 대조구에 비하여 모든 실험기간동안 HSP70 mRNA가 강하게 발현되는 것이 확인되었다.
- 동결된 간부위 조직에서 total RNA를 (주)Bioneer tissue RNA prep mate kit를 사용하여 추출하였다. 추출된 total RNA는 -7CFC에서 보관하여 실험에 사용하였으며, PROMEGA사의 cDNA합성 kit인 ImProm-II™ reverse transcriptase kit A3800 을 이용하여 cDNA를 합성 하였다.
- 또한 본 실험에서는 스트레스와 대사의 지표로 많이 사용되는 혈액 샘플 (Cho et al., 2002; Vijay an and Moon, 1994) 을 전 복의 심장 옆 혈관에서 주사기를 이용하여 채취한 뒤, 원심 분 리를 통한 혈림프(Hemolymph)를 수거하여 급격한 수온 스트 레스에 따른 글루코오스 및 혈당의 변화를 관찰 하였으나 개체간의 차이가 크게 나타나 스트레스에 대한 일관성 있는 결과를 나타내지 않았다(Data not shown).
- 본 연구는 전복, Haliotis discus hanai 치패를 이용하여 급격한 수온변화 스트레스에 따른 간부위에서의 항산화효소 및 HSP70 mRNA의 변화를 조사하였다. 실험구는 10, 15, 20(대조 구), 25 및 30℃로 설정하였으며, 측정 시간은 0, 6, 12, 24 및 48 h 후에 측정하였다.
- 실험개시 후, 0, 6, 12, 24 및 48 h째에 폐사한 개체를 각각 조사하였다. 펴】사 개체의 계수는 은신처(shelter)와 수조 벽면에 부착능력이 없고, 유리봉으로 발과 촉수를 자극하여도 반응이 없는 개체를 선택하여 조사하였다.
- 본 연구는 전복, Haliotis discus hanai 치패를 이용하여 급격한 수온변화 스트레스에 따른 간부위에서의 항산화효소 및 HSP70 mRNA의 변화를 조사하였다. 실험구는 10, 15, 20(대조 구), 25 및 30℃로 설정하였으며, 측정 시간은 0, 6, 12, 24 및 48 h 후에 측정하였다. 그 결과 HSP70 mRNA의 발현은 다른 실험구들과 비교하여 30℃ 실험구에서만 유의적으로 높게 발 현되었으며, SOD의 경우 모든 실험구에서는 증가하는 경향을 나타내었으나, 고수온에서 12 h 이후 급격한 상승을 나타내었 고, 저수온에서는 수온 스트레스 자극 직후에 증가한 후 회복 되는 경향을 나타내었다.
- 5%。을 유지시켰고 PVC파이 프(0 20 cm, L 20 cm)를 세로로 절단한 은신처 (shelter)를 넣 어서 공기를 공급하였다. 예비 사육기간에 먹이는 다시마를 충분히 공급하였으며, 실험구당 30마리의 전복을 실험에 사용하 였고, 실험개시 후 각 수조에 넣어진 사육수의 수온이 목표치 에 도달한 순간을 0 h로 정하여 0, 6, 12, 24 및 48 h째에 각각 5마리의 전복으로부터 간부위의 조직 샘플을 채취하여 -70℃로 보관하여 분석에 이용하였다.
- 동결된 간부위 조직에서 total RNA를 (주)Bioneer tissue RNA prep mate kit를 사용하여 추출하였다. 추출된 total RNA는 -7CFC에서 보관하여 실험에 사용하였으며, PROMEGA사의 cDNA합성 kit인 ImProm-II™ reverse transcriptase kit A3800 을 이용하여 cDNA를 합성 하였다. 합성된 cDNA는 PROMEGA 사의 Taq DNA polymerase in storage buffer B kit을 사용하여 증폭하였다.
- 실험개시 후, 0, 6, 12, 24 및 48 h째에 폐사한 개체를 각각 조사하였다. 펴】사 개체의 계수는 은신처(shelter)와 수조 벽면에 부착능력이 없고, 유리봉으로 발과 촉수를 자극하여도 반응이 없는 개체를 선택하여 조사하였다.
- 추출된 total RNA는 -7CFC에서 보관하여 실험에 사용하였으며, PROMEGA사의 cDNA합성 kit인 ImProm-II™ reverse transcriptase kit A3800 을 이용하여 cDNA를 합성 하였다. 합성된 cDNA는 PROMEGA 사의 Taq DNA polymerase in storage buffer B kit을 사용하여 증폭하였다. cDNA를 증폭시키기 위하여 cDNA 2 u:„ lOxPCR buffer 5 ul, MgCl2 (25 mM) 3 ul, dNTP (10 mM) 1 ul, primer (sense) 1 ul (50 pmol), antisense 1 ul (50 pmol), Taq DNA polymerase 0.
- 항산화효소는 간부위를 적출하여 SOD 및 CAT를 각각 분석하였다. 간부위를 적출 후 약 0.
대상 데이터
- 실험에 사용된 전복, Haliotis discus hamiai는 제주수산연구 소 패류육종연구센터에서 분양받은 평균 각장 3.95±0.03 cm, 각고 0.88±0.01 cm, 각폭 2.58±0.02 cm, 전중량 8.88±0.25 g인 개체를 사용하였다. 실험 전복은 미리 20。에서 2개월 동안 사 육하며 순치시킨 후 순환여과가 가능한 30 L 규모의 수조로 옮 겨 10, 15, 20(대조구), 25 및 30。＜2의 수온 스트레스를 각각 주 었으며, 이때 염분농도는 30.
데이터처리
- 각 실험에서 얻어진 자료에 대한 값의 유의차 유무는 SPSS- 통계 패키지에 의한 ANOVA로 분석하여 Duncan's multiple range test로 검정하였다.
이론/모형
- SOD는 pyrogallol의 자동 산화율이 억제되는 양을 측정하는 Marklund and Marklund (1974)의 방법으로 측정하였으며, 50 mM phosphate buffer (pH 8.24) 1.3 ml에 간장 균질액 25 ul을 넣 은 후 45 ul의 3 mM pyrogallol 용액을 첨가하여 spectrophotometer 를 이용하여 325 nm의 파장에서 측정하였고, 효소활성의 1단 위는 반응액 중의 pyrogallol의 산화를 50% 억제하는 효소의 양으로 정하였다. CAT활성도 측정은 HQ를 기질로 사용하여 spectrophotometer에 의해 240 nm 파장에서 H2O2가 환원되어 감소하는 흡광도로서 효소 활성도를 측정하는 Nelson and Kiesow (1972)의 방법에 의하여 측정하였으며, 효소 활성도의 단위는 1 분간에 1 mg의 단백질이 반응하여 환원시킨 氏6를 nmol로 나타내었다.
- CAT활성도 측정은 HQ를 기질로 사용하여 spectrophotometer에 의해 240 nm 파장에서 H2O2가 환원되어 감소하는 흡광도로서 효소 활성도를 측정하는 Nelson and Kiesow (1972)의 방법에 의하여 측정하였으며, 효소 활성도의 단위는 1 분간에 1 mg의 단백질이 반응하여 환원시킨 氏6를 nmol로 나타내었다. 단백질 함량은 Lowry et al. (1951)의 방법에 따라 표준 단백질로서 BSA (bovine serum albumin)를 사용하여 spectrophotometer를 이용 540 nm에서 즉정하였다.
성능/효과
- 급격한 수온 스트레스에 따른 HSP70의 변화를 관찰하기 위하여 수온과 시간대 별로 간부위의 조직에서 샘플을 적출하여 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과 RT-PCR를 통한 HSP70 mRNA 의 발현은 30。(2에서는 대조구에 비하여 모든 실험기간동안 HSP70 mRNA가 강하게 발현되는 것이 확인되었다. 그러나 25。。에서는 뚜렷한 HSP70 mRNA의 발현이 나타나지 않았으 며, 1CFC의 경우 0 h째와 12 h째에 HSP70 mRNA가 약하게 발 현되었으며, 15。(2의 경우 0 h째에 HSP70 mRNA가 약하게 발현되었다(Fig.
- CAT효소 활성의 경우는 0 h째에서는 모든 실험구가(10, 15, 25 및 30。0가 대조구보다 낮은 활성을 나 타내었으나, 시간이 경과함에 따라 1CTC 실험구를 제외한 모든 실험구(15, 25 및 30。0에서 대조구와 비교했을 때 높은 활성을 나타내었다. 15。(2의 경우 6 h째까지 급격한 활성의 증가를 보였으며 6 h째 이후에는 큰 폭의 변동을 나타내지는 않았고, 25와 30。(2의 경우에서는 시간이 경과함에 따라서 활성이 꾸준 히 증가하는 경향을 나타내었고, 특히 3(TC의 경우에서는 24 h 째 이후로 급격한 활성의 증가를 나타내었다(Fig. 3, F<0.05).
- 급격한 수온 스트레스에 따른 생존율에서는 대조구(20。0를 비롯한 다른 실험구(10, 15 및 25。0에서는 실험종료시 까지 폐 사된 개체가 발견되지 않아 100%의 생존율을 나타내었으나, 30℃ 실험구에서만 12 h 이후 폐사된 개체가 발견되었고, 최종 적으로 2마리가 폐사하여 92%의 생존율을 나타내었다(Fig. 1).
- 급격한 수온 스트레스에 따른 SOD 활성은 시간이 경과함에 따라 모든 실험구(10, 15, 25 및 30℃)에서 대조구(20。0보다 높게 나타났으며, 특히, 10 및 15。。실험구에서는 12 h째까지 급격한 활성 증가를 보이다가 24 h째에 감소하였고 48 h째에 는 다시 증가하는 경향을 보였다. 25℃ 실험구에서는 12 h짜] 까지는 큰 활성의 증가를 보이지 않았으나 12 h 이후 급격히 증가하여 48 h째에 모든 실험구와 비교하여 가장 높은 수치를 나타내었고, 30℃ 실험구에서는 24 h째 까지는 뚜렷한 활성의 변화를 보이지 않다가 24 h 이후 급격한 활성의 증가를 나타내 었다(Fig. 2, P<0.05). CAT효소 활성의 경우는 0 h째에서는 모든 실험구가(10, 15, 25 및 30。0가 대조구보다 낮은 활성을 나 타내었으나, 시간이 경과함에 따라 1CTC 실험구를 제외한 모든 실험구(15, 25 및 30。0에서 대조구와 비교했을 때 높은 활성을 나타내었다.
- 실험구는 10, 15, 20(대조 구), 25 및 30℃로 설정하였으며, 측정 시간은 0, 6, 12, 24 및 48 h 후에 측정하였다. 그 결과 HSP70 mRNA의 발현은 다른 실험구들과 비교하여 30℃ 실험구에서만 유의적으로 높게 발 현되었으며, SOD의 경우 모든 실험구에서는 증가하는 경향을 나타내었으나, 고수온에서 12 h 이후 급격한 상승을 나타내었 고, 저수온에서는 수온 스트레스 자극 직후에 증가한 후 회복 되는 경향을 나타내었다. CAT에서는 실험 개시 후부터 고수온 실험구에서 지속적인 상승을 나타내었다.
- (1996, 1997)는 온도 증가에 의한 스트레스로 실험 후 4 h까지 SOD 효소활성 등이 증가한다고 보고하였다. 본 실험에서는 패류인 전복을 이용하여 실험한 결과, SOD의 경우 모든 실험구에서는 증가하는 경향을 나타내었으나, 고수온에서 12 h 이후 급격한 상승을 나 타내었고, 저수온에서는 수온 스트레스 자극 직후에 증가한 후 감소하는 경향을 나타내었다. CAT에 있어서는 고수온에 있어서 지속적인 상승을 나타내었다.
- (2001)는 3IP에서 1 h의 열충격을 가한 전복의 소화샘을 Western blot 한 결과 세 개의 밴드(HSP67, HSP70 및 HSP74)가 나타난다고 보고하고 있다. 본 연구진에서 아가미 샘플을 이용하여 HSP70의 항체를 사용한 결과에서 도 30℃ 실험구의 Western blot의 결과에서 HSP70의 밴드 외 에 HSP67 및 HSP74가 확인되었다(Data not shown). 이처럼 전복의 다양한 장기에서 HSP의 발현이 이루어지는 것을 알 수 있으며, Amro et al.
- 10 및 15℃ 실험구의 경우에는 설정 수온에 도달하는 0 相 에 HSP70 mRNA가 약하게 발현되었다. 이러한 결과는 전복이 급격한 수온 스트레스에 의한 HSP70의 발현은 저수온으로의 변화에서는 생리적으로 스트레스에 대한 빠른 순응을 하는 것으로 판단되나, 10℃ 이상의 수온 상승이 이루어졌을 때에는 HSP70 의 발현량이 급속도로 증가 되어 HSP의 생성 기 작이 급속도로 진행되고 이러한 스트레스가 12 h 이상 지속될 경우 생리학적 방어 기작이 한계에 도달하여 폐사에 이르게 될 것으로 추정된다.
- 이상의 결과로, 20忙에서 순치된 전복은 저수온 스트레스에 대한 생리학적 방어기작이 약 5℃ 내외의 고수온 스트레스에 대한 생리학적 방어기작과 비교하여 보다 빠르게 작용하여 순 응하는 것으로 나타나며 , 일정 수온 이상의 고수온에 노출되었 을 경우 생체 내 과도한 생리학적 방어기작이 작용하여 항산화 효소 및 HSP 발현을 증가시키는 것으로 판단된다. 그러나, 이러한 변화에 대한 종합적인 검토를 위해서는 좀 더 장기간에 걸친 연구와 각 장기간의 발현 양상에 대한 세부적인 연구가 추가되어야 할 것으로 판단된다.
- CAT에 있어서는 고수온에 있어서 지속적인 상승을 나타내었다. 이상의 결과를 보면 20℃에서 순치된 전복에서의 항산화효소는 저수온으로의 급격한 변화가 보다 빠른 생리적인 순응을 위해 작용하는데 반하여 고수온에 서는 스트레스 초기의 변화에는 생리적인 순응 반응이 나타나 지 않지만 12 h 이후에는 급격한 스트레스로 작용하여 순응하기 위해 작용하는 것으로 판단된다. 그러나 이러한 급격한 생 리적인 순응에도 불구하고 30℃ 이상의 수온에서는 생리적인 방어 기작을 능가하여 폐사에 이르게 하는 것으로 판단된다.
후속연구
- 이상의 결과로, 20忙에서 순치된 전복은 저수온 스트레스에 대한 생리학적 방어기작이 약 5℃ 내외의 고수온 스트레스에 대한 생리학적 방어기작과 비교하여 보다 빠르게 작용하여 순 응하는 것으로 나타나며 , 일정 수온 이상의 고수온에 노출되었 을 경우 생체 내 과도한 생리학적 방어기작이 작용하여 항산화 효소 및 HSP 발현을 증가시키는 것으로 판단된다. 그러나, 이러한 변화에 대한 종합적인 검토를 위해서는 좀 더 장기간에 걸친 연구와 각 장기간의 발현 양상에 대한 세부적인 연구가 추가되어야 할 것으로 판단된다.
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