닭의 발생 단계별 세포내 Telomere의 양적 분포양상과 Telomerase 활성도 분석 The Amount of Telomeres and Telomerase Activity on Chicken Embryonic Cells During Developmental Stages원문보기
Telomeres locate at the end of chromosomes and consist of a tandem repeat sequence of $(TIAGGG)^{n}$ and associated proteins. Telomerase is a ribonucleoprotein which act as a template for the synthesis of telomeric DNA. Telomeres are essential for chromosome stability and are related with...
Telomeres locate at the end of chromosomes and consist of a tandem repeat sequence of $(TIAGGG)^{n}$ and associated proteins. Telomerase is a ribonucleoprotein which act as a template for the synthesis of telomeric DNA. Telomeres are essential for chromosome stability and are related with cell senescence, apoptosis and cancer. This study was carried out to analyze the amount of telomeres and telomerase activity of chicken cells during embryonic and developmental stages. The whole embryos and prenatal tissues such as brain, heart, liver, kidney and testis at different developmental stages were obtained from Korean Native Chicken. The amount of telomeres on embryonic cells was analyzed by quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH) techniques using the chicken telomeric DNA probe. Telomerase activity was measured by telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay. Results indicated that the amounts of telomeric DNA on the most embryonic cells were gradually decreased during ontogenesis. Furthermore, the quantity of telomeres was quite different among embryonic tissues according to developmental origin. The relative amount of telomeres has more in regenerative cells such as embryonic disc and testicular cells than in non-regenerative cells such as liver, brain, heart and kidney cells. Telomerase activity was also highly detectable in most chicken cells at early embryonic stages. After 9 days of incubation, however, the telomerase activitie W
Telomeres locate at the end of chromosomes and consist of a tandem repeat sequence of $(TIAGGG)^{n}$ and associated proteins. Telomerase is a ribonucleoprotein which act as a template for the synthesis of telomeric DNA. Telomeres are essential for chromosome stability and are related with cell senescence, apoptosis and cancer. This study was carried out to analyze the amount of telomeres and telomerase activity of chicken cells during embryonic and developmental stages. The whole embryos and prenatal tissues such as brain, heart, liver, kidney and testis at different developmental stages were obtained from Korean Native Chicken. The amount of telomeres on embryonic cells was analyzed by quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH) techniques using the chicken telomeric DNA probe. Telomerase activity was measured by telomeric repeat amplification protocol (TRAP) assay. Results indicated that the amounts of telomeric DNA on the most embryonic cells were gradually decreased during ontogenesis. Furthermore, the quantity of telomeres was quite different among embryonic tissues according to developmental origin. The relative amount of telomeres has more in regenerative cells such as embryonic disc and testicular cells than in non-regenerative cells such as liver, brain, heart and kidney cells. Telomerase activity was also highly detectable in most chicken cells at early embryonic stages. After 9 days of incubation, however, the telomerase activitie W
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문제 정의
따라서 닭의 배 발생단계별 텔로미어와 텔로머레이스의 분석은 개체의 발생과 노화에 관한 생물학적 기작을 밝히는데 매우 중요한 자료라 사료되어 본 연구에서는 한국재래계의 초기 배자 및 발생 단계별 각 신생 조직에 대한 텔로머레이스 활성도와 텔로미어의 함량을 분석 고찰하고자 하였다.
제안 방법
1 mg / mg)가 함유된 50 mg 의 2xSSC 용액에 넣고 37 ℃의 항온수조에서 30분간 처리하여 RNA를 제거한 후 초자수로세 척 하고 80 %, 90 %, 100% 에탄올로 탈수시켜 상온에서 건조시켰다. Hybridization액(13 ㎕ formamide, 5 "g hybridization buffer, Dig-labelled chicken telomeric DNA probe 2, ㎕(100ng/㎕), 이상 Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)을 표본 슬라이드에 떨어뜨리고 커버글라스로 덮은 후 가장자리를 종이본드(paper bond)로 밀봉하였다. 이를 72 ℃에서 10분간 처리하여 probe 와 표본 DNA를 변성시키고 다시 38.
이후 4 ℃에서 12,000 X g로 20분간 원심분리하고 상층액을 새 튜브로 옮긴 후 단백질 정량을 시행하였고(Bradford, 1976), 정량된 추출물은 급속 냉동시킨 후 -70 ℃ 에 보관하였다. Polymerase chain reaction(PCR) 을 위해 10 X TRAP reaction buffer 5 50 x dNTP mix 1 ㎕, , TS primer 1 ㎕, TRAP primer mix 1 nl, Taq polymerase(2.5 units /㎕) 1 ㎕를 섞은 PCR 혼합물을 준비하고, 각 튜브에 혼합물을 9㎕씩 분주하여 여기에 초자수 40.5㎕와 세포 및 조직 추출물 0.5㎕(1 mg/㎕)를 섞어 총량이 50㎕이 되게 하였다. PCRe 30 ℃ 에서 30분간 TS-telomerase product를 확장시킨 다음 94 ℃ 30초, 59 ℃ 30초, 72 ℃ 에서 30초간 3단계로 35 사이클을 시행하였다.
9% sodium citrate(Sigma Chem, St Louis, MO, USA) 용액을 첨가하여 15분간 저장 처리하고 이후 고정액을 10방울 정도 첨가하여 원심분리 시켰다. 고정처리는 methanol과 acetic acid가 3: 1로 혼합된 고정액을 이용하고 이를 3회 반복 처리한 후 세포액을 3~ 5방울 정도 떨어뜨려 슬라이드 표본을 제작하였다.
닭의 초기 배자 표본은 산란 직후, 부화 1일, 2일 및 3일령 수정란을 파각하여 배반을 채취하였고, 발생 조직 표본은 부화 7일, 9일, 13일, 18일째 및 부화 직후 발생 개체의 간, 뇌, 심장, 신장, 정소를 대상으로 이들 각 조직들을 실체 현미경하에서 일부를 떼어 준비하였다. 채집된 조직들은 D-PBS(Gibco, Invitrogen Corp.
분석할 발생 개체의 각 조직은 실체현미경 하에 채집한 후, 표본을 제작하여 FISH 를 수행하고, 형광현미경하에서 5~6개의 세포 간 기상을 한 개의 프레임으로 이미지를 획득하였다. 획득한 50개 이상의 이미지상을 이미지 분석 프로그램을 이용하여 각 조직별 세포 내 텔로미어 함량을 분석하였다
1 % Nonidet P-40)로 실온에서 2분간 세척한다. 접합 탐지를 위하여 슬라이드에 20 ㎕의 anti-digoxigenin-fluorescein(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)을 떨어뜨리고 38.5 ℃에서 30분간 반응시켰다 배경 염색을 위해 propidium iodide solution(PI, Sigma Chem, St Louis, MO, USA)을 이용하였으며, 형광 접합 발현 양상은 523 nm 파장대의 필터를 부착한 형광 현미경 (Model AX-70, Olympus, Tokyo, Japan)으로 검경하고, 최소 50여개의 상을 획득하였다. 획득한 각각의 상은 디지털 카메라(Model DP-70, Olympus, Tokyo, Japan) 로 촬영하고, 이미지 분석 프로그램(MetaMorph, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 배경 염색된 붉은 색(PI)의 핵 면적 대비, 핵 내 녹색 (FTTC)의 형광 시그널의 분포 비를 계산하였으며, 분석 상들의 평균값으로 세포 당 telomeric DNA의 상대적 함량을 나타내었다.
변형하여 적용하였다. 준비된 슬라이드 표본을 10 ㎕ RNase A(0.1 mg / mg)가 함유된 50 mg 의 2xSSC 용액에 넣고 37 ℃의 항온수조에서 30분간 처리하여 RNA를 제거한 후 초자수로세 척 하고 80 %, 90 %, 100% 에탄올로 탈수시켜 상온에서 건조시켰다. Hybridization액(13 ㎕ formamide, 5 "g hybridization buffer, Dig-labelled chicken telomeric DNA probe 2, ㎕(100ng/㎕), 이상 Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)을 표본 슬라이드에 떨어뜨리고 커버글라스로 덮은 후 가장자리를 종이본드(paper bond)로 밀봉하였다.
PCRe 30 ℃ 에서 30분간 TS-telomerase product를 확장시킨 다음 94 ℃ 30초, 59 ℃ 30초, 72 ℃ 에서 30초간 3단계로 35 사이클을 시행하였다. 증폭된 텔로머레 이스는 15 % polyacrylamide 겔 전기 영동을 통해 75^21] 이어 100V에서 2시간동안 실시하고 ethidium bromide(EtBr, Sigma Chem, St Louis, MO, USA)로 염색한 후 결과를 관찰하였다.
초기 배자 및 발생 개체 각 조직들의 텔로미어 함량 분석을 위하여 산란 직후 수정란 및 1 일령, 2일령 배반과 부란 7일령, 13일령 및 부화 직후 병아리의 간, 뇌, 심장, 신장, 정소 조직을 대상으로 양적형광접합보인법 (quantitative fluorescence in situ hybridization; Q-FISH)을 수행하였다. 분석할 발생 개체의 각 조직은 실체현미경 하에 채집한 후, 표본을 제작하여 FISH 를 수행하고, 형광현미경하에서 5~6개의 세포 간 기상을 한 개의 프레임으로 이미지를 획득하였다.
형광접합보인법 (Fluorescence in situ Hybridization; FISH)은 Kobayashi 등(1998)의 방법을 다소 변형하여 적용하였다. 준비된 슬라이드 표본을 10 ㎕ RNase A(0.
분석할 발생 개체의 각 조직은 실체현미경 하에 채집한 후, 표본을 제작하여 FISH 를 수행하고, 형광현미경하에서 5~6개의 세포 간 기상을 한 개의 프레임으로 이미지를 획득하였다. 획득한 50개 이상의 이미지상을 이미지 분석 프로그램을 이용하여 각 조직별 세포 내 텔로미어 함량을 분석하였다
대상 데이터
닭의 발생단계별 텔로미어 함량 분석 및 텔로머레이스 활성도 분석을 위하여 진주산업대학교 동물사육장에 사육중인 한국재래계를 이용하였고, 이들이 생산한 수정란으로서 부화 시기별 발생 개체의 조직을 채취하여 분석하였다.
데이터처리
5 ℃에서 30분간 반응시켰다 배경 염색을 위해 propidium iodide solution(PI, Sigma Chem, St Louis, MO, USA)을 이용하였으며, 형광 접합 발현 양상은 523 nm 파장대의 필터를 부착한 형광 현미경 (Model AX-70, Olympus, Tokyo, Japan)으로 검경하고, 최소 50여개의 상을 획득하였다. 획득한 각각의 상은 디지털 카메라(Model DP-70, Olympus, Tokyo, Japan) 로 촬영하고, 이미지 분석 프로그램(MetaMorph, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 배경 염색된 붉은 색(PI)의 핵 면적 대비, 핵 내 녹색 (FTTC)의 형광 시그널의 분포 비를 계산하였으며, 분석 상들의 평균값으로 세포 당 telomeric DNA의 상대적 함량을 나타내었다.
이론/모형
닭의 배 발생단계별 각 신생 조직에 대한 텔로머레이스 활성도를 TRAP법으로 비교 분석하였다. Fig.
텔로머레이스 활성도 분석은 Kim과 Wu(1997) 제시한 telomeric repeat amplification protocol (TRAP) 방법으로 상업용 telomerase detection kit(TRAPEZE®, Intergen Co., Purchase, NY, USA)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 다음과 같이 실시하였다. 분석할 조직들은 3-cholamidopropyl dimethylammonio-1 -propane-sulfanate(CHAPS) lysis buffer를이용하여 단백질을 분리하고, 30분 동안 얼음 위에 정치시켰다.
성능/효과
분석 결과, 초기배자에서는 지속적으로 강한 텔로머레이스의 활성도를 보이며, 7~9일령 부란 개체의 모든 조직에서도 비교적 강한 활성을 나타내었다 하지만 9일령 이후 간. 노], 심장 조직의 텔로머레이스 활성도는 현저하게 떨어지는 반면 신장, 정소 조직에서는 지속적인 활성을 보였다. 이러한 결과는 초기 배자 및 생식선 조직은 증식성 세포들로서 분열능력이 높고 많은 세포들이 미분화 단계임에 따라 텔로머레이스의 지속적인 활성을 나타내고, 간, 노I, 심장 조직의 경우 거의 비 증식성 세포들로 구성되어 있으므로 분화가 완료되는 시점에서부터 텔로머레이스의 활성도가 떨어지는 것으로 보인다.
닭의 초기 배 및 발생 과정 중 각 조직별세포내 텔로미어의 함량을 Q-FISH 방법에 의해 분석한 것은 본 연구가 처음 시도한 것으로 분석 결과에서 나타난 발생 시기별, 조직별 텔로미어 함유율의 차이는 세포적 특이성을 설명할 수 있는 훌륭한 표지 (marker)로 사료된다.
그 윗증은 36bp 위치의 substrate internal control (S-IC)을 나타내며, 이후 50 bp부터 텔로머레이스 활성도가 증가할 때마다 6 bp씩 telomeric DNA의 band가 부가하여 나타난다. 분석 결과, 초기배자에서는 지속적으로 강한 텔로머레이스의 활성도를 보이며, 7~9일령 부란 개체의 모든 조직에서도 비교적 강한 활성을 나타내었다 하지만 9일령 이후 간. 노], 심장 조직의 텔로머레이스 활성도는 현저하게 떨어지는 반면 신장, 정소 조직에서는 지속적인 활성을 보였다.
즉, 초기 배자 단계에서 강한 텔로머레이스의 활성도를 보이다가부란 10일경부터 뇌, 간, 심장, 근육 조직의 텔로머레이스의 활성이 감소하기 시작하여 부란 17일 이후부터 거의 없어지며, 폐와 신장 조직은 부화시까지 감소가 지속되다가 신생자 이후 없어지고, 증식성 조직이라 할 수 있는 면역조직과 생식선조직은 생후에도 지속적 활성을 나타낸다고 하였다. 이러한 결과는 본 연구에서 분석된 결과와 거의 일치되는 것으로 부란 9일령 이후 발생 조직들의 텔로머레이스 활성도가 급격히 감소하는 양상은 닭의 배 발육 과정 중 부란 10일이 지나면 모든 조직이 형성되고 이후 분화 조직들이 발달단계에 들어감에 따라 세포 증식이 비 활성화되는 것과 밀접한 관련이 있는 것으로 생각된다.
이상의 분석 결과로부터 닭의 초기 배자상태에서는 발생 일령에 따른 배반 세포의 텔로미어 함량의 변화는 거의 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 배반의 경우 조직 분화의 잠재성을 가진 증식성 세포이기 때문에 초기 분열단계에서 양적 변화 없이 지속적으로 높은 함유율을 나타내는 것으로 사료된다.
특히, 조직별 세포의 분화 및 증식성 특이성과 텔로머레이스 활성도 간에는 매우 밀접한 관련이 있으며, 더불어 본 분석에서 나타난 텔로미어의 양적 분석과도 매우 높은 상관관계가 있는 것으로 보여 닭의 경우 세포 내 텔로미어의 함량은 텔로머레이스의 활성도에 절대적으로 영향을 받는 것으로 사료된다.
하지만 비 증식성 세포인 신장 조직의 특이적인 양상은 신장 조직 중 사구체 세포가 표본의 대부분을 차지한 것에 기인된 것이라 사료되어 신장 조직을 구성하고 있는 세포의 특이성에 대해서는 또 다른 생리학적 연구가 뒷받침되어 야 한다고 생각된다. 한편 동일 발생시점의 조직 간 텔로미어 함유율에서도 유의적 차이를 나타내고 있는데 정소 및 초기 배자의 세포가 신장, 심장, 간, 뇌에 비해 월등히 높게 나타났다. 이러한 결과는 Taylor와 Delany(2000)가 텔로미어 제한 단편 길이 측정법 (telomere restriction fragment; TRF)으로 닭발생 시 조직별 분석에서 텔로미어의 길이가 생식선 조직이 체세포 조직에 비해 평균 0.
참고문헌 (30)
Ahmed, A. and Tollefsbol, T. 2001. Telomeres and telomerase: basic science implications for aging. J. Am. Geriatr. Soc. 49(8):1105-1109
Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anim. Biochem. 72:248-254
Byant, J. E., Hutchings, K. G., Moyzis, R. K. and Griffith, J. K. 1997. Measurement of telomeric DNA content in human tissues. Biotech. 23:476-478
Cottliar, A. S. and Slavutsky, I. R. 2001. Telomeres and telomerase activity: their role in aging and in neoplastic development. Medicina 61(3):335-342
Delany, M. E., Daniels, L. M., Swanberg, S. E. and Taylor, H. A. 2003. Telomeres in the chicken: genome stability and chromosome ends. Poul. Sci. 82:917-926
Ferlicot, S., Youssef, N., Feneux, D., Delhommeau, F., Paradis, V. and Bedossa, P. 2003. Measurement of telomere length on tissue sections using quantitative fluorescence in situ hybridization(Q-FISH). J. Path. 200:661-666
Forsyth, N. R., Wright, W. E. and Shay, J. W. 2002. Telomerase and differentiation in multicellular organisms: Turn it off, turn it on, and turn it off again. Differentiation 69:188-197
Hultdin, M., Gronlund, E., Norrback, K., Erikasson- Lindstrom, E., Just, T. and Roos, G. 1998. Telomere analysis by fluorescence in situ hybridization and flow cytometry. Nucleic Acids Res. 26(16):3651-3656
Kim, N. W. and Wu, F. 1997. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol(TRAP). Nucleic Acids Res. 25(13):2595-2597
Kobayashi, J., Sekimoto, A., Uchida, H., Wada, T., Sasaki, K., Sasada, H., Umezu, M. and Sato, E. 1998. Rapid detection of male-specific DNA sequence in bovine embryos using fluorescence in situ hybridization. Mol. Reprod. Dev. 51:390-394
Lejnine, S., Vladimir, L. and Langmore, J. P. 1995. Conserved nucleoprotein structure at the ends of vertebrate and invertebrate chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2393-2397
Meeker, A. K. and Coffey, D. S. 1997. Telomerase: a promising marker of biological immortality of germ, stem, and cancer cells. A review. Biochem. (Mosc). 62(11):1323-1331
Oexle, K. 1998. Telomere length distribution and southern blot analysis. J. Theor. Biol. 190:369-377
Pathak, S., Mutani, A. S., Furlong, C. L. and Sohn, S. H. 2002. Telomere dynamics, aneuploidy, stem cells and cancer. Int. J. Oncology 20(3):637- 641
Poon, S. S., Martens, U. M., Ward, R. K. and Lansdorp, P. M. 1999. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry 36:267-278
Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E. and Lansdorp, P. M. 1998. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat. Biotechnol. 16(8):743-747
Sohn, S. H., Multani, A. S., Gugnani, P. K. and Pathak, S. 2002. Telomere erosion-induced mitotic catastrophe in continuously grown Chinese hamster Don cells. Exptl. Cell Res. 279(2):271-276
Taylor, H. A. and Delany, M. E. 2000. Ontogeny of telomerase in chicken: Impact of downregulation on pre- and postnatal telomere length in vivo. Dev. Growth Differ. 42:613-621
Ulaner, G. A., Hu, J. F., Vu, T. H. and Hoffman, A. R. 1998. Telomerase activity in human development is regulated by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) transcription and by alternate splicing of hTERT transcripts. Cancer Res. 58:4168-4172
Ulaner, G. A., Hu, J. F., Vu, T. H. and Hoffman, A. R. 2001. Tissue-specific alternate splicing of human telomerase reverse transcriptase(hTERT) influences telomere lengths during human development. Int. J. Cancer 91:644-649
Venkatesan, R. and Price, C. 1998. Telomerase expression in chickens: Constitutive activity in somatic tissues and down- regulation in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14763-14768
Wright, D. L., Jones, E. L. Mayer, J. F., Oehninger, S., Gibbons, W. E. and Lanzendorf, S. E. 2001. Characterization of telomerase activity in the human oocyte and preimplantation embryo. Mol. Hum. Reprod. 7:947-955
Wright, W. E., Piatyszek, M. A., Rainey, W. E.. Byrd, W. and Shay, J. W. 1996. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev. Genet. 18:173-179
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