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문제 정의
- 따라서 본 연구는 경상남도 4지역의 농장을 대상으로 개좌위를 분석하여 각 좌위에 20 MS 대한대립유전자형의 빈도와 분포를 기초로 한우의 생산이력제에 적용 가능한를 선발 MS set 하고 집단 간 개체간의 유전적 다형성 지표 및, , 동일 개체 출현빈도 등을 추정할 수 있는 통계분석방법의 설정을 위하여 실시하였다.
- 본 연구는 한우 생산이력제 시행 시 최적의 DNA microsatellite 검사에 활용 가능한 분석과 선발을 위하여 실시하였다.
제안 방법
- , multiplex PCR PCR ABI-310 산물은 자동 염기서열 분석장치 (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 크기별 형광표식자별로 분류하고프 Microsoft Excel 로그램을 이용하여 원자료를 (Microsoft, USA) 취합하였다 취합된 자료는 의 형태로 . Excel file MSA version 3.15 (Dieringer Schlt- 프로그램와 terer, 2002) allele frequency, 을 이용하여 DA 유전적 거리지수의 분포 등 기초분석과자 , allele 료 파일의 변환을 실시하였다 변환된 자료 파일 . 은 다 형성지수(He와 PIC)를 추정하기 위한 CERVUS version 2.
- Multiplex PCR template DNA 0.03 , set 은 ㎍ primer 0.7, 0.4, 0.8, 0.1 mol, 각각 μ Taq DNA polymerase 0.5 unit (TaKaRa, Japan), 10 × buffer 1 , 0.25 mM dNTP ㎕ 의 조성에 증류수를 첨가하여 최종 부피를 로 반응하였으며 10 , PCR ㎕ 조건은 에서 분간을 실시한 94 15 denaturation ℃ 후에서 초 에서 초에서 94 50 , 55 70 , 72 60초 를 로하여 회반복하였다 그 후 1 cycle 32 . 72 1 , 25 2 extension ℃ ℃ 에서 시간에서 시간 후 4 .
- 72 1 , 25 2 extension ℃ ℃ 에서 시간에서 시간 후 4 . PCR ABI-310 ℃에서 종료하였다 산물은 자동염기서열 분석장치(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 크기별로 분류되도록 전기영동하고, GeneScan version 2.1(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 크기와 표식자의 종류별로 분류한 후을 이 Microsoft Excel(Microsoft, USA) 용하여 자료를 취합하였다
- Applied Biosystems , ISAG Roslin 사 및 연구소 등에서 소의 다형 성 분석에 사용되도록 권장된 MS marker 20 중 종을에서 보는 바와 Table 1 같이 선발하였다 을 위한 는 . PCR MS primer NCBI Mapviewer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/의 mapview/mapviewer)에 보고되어 있는 정보를 이용하였고 조건 및 산물의 크기 등, PCR PCR 을 고려해 가능한 적은 수의로 분류하기 위 set 하여 조건을 조사하였고 최종적 multiplex PCR 으로 에 나타낸 바와 같이 개의로 Table 1 4 set 분류하였다 설정된 중번째 에는 . set 4 set ETH185 만이 포함되어 있는데 이는 의 Table 1 annealing temperature MS 에 나타난 바와 같이 다른 에비하여 온도가 가장 높아 다른 와 혼합할 경우 set 정확한 수행이 어렵기 때문이다 차후 이 PCR .
- 한우의 생산이력제에 활용 가능한 종의 20 microsatellite marker , 를 선정하고 다형성지수F통계량 동일 개체 출현 확률 친자감별 확률 및, , 유전적거리지수 등을 MSA, CERVUS, FSTAT, GENEPOP, API-CALC PHYLIP 및 프로그램 등을 연계적으로 활용하여 추정하였다. Heterozygosity 11추정치에 근거하여 선발한 개의 microsatellite(TGLA53, TGLA227, ETH185, TGLA122, BM4305, INRA23, ILSTS013, BMS1747, BM2113, BM2113, BL1009와 ETH3) Applied Biosystems 는 사의 StockMakersTM와 비교하여 배 정도의 100동일개체 출현 확률이 낮아 한우의 생산이력제 적용에 보다 효율적 인 것으로 나타났다 또한.
대상 데이터
- 20 MS 11 MS 개의 중상위 개의를 He와 PIC 추정치에 근거하여 선발하였으며 이들의 와, PI PIhalf-sibs를 계산한 결과에서 보는 바와 Table 5 같이 사의 Applied Biosystems StockMakersTM 보다 더 낮은 값이 추정되어 한우의 생산이력제에 보다 적합한 것으로 나타났다 특히 . He 추정치에 의하여 선발한 개의 11 MS markers (TGLA53, TGLA227, ETH185, TGLA122, BM4305, INRA23, ILSTS013, BMS1747, BM2113, BL1009와 ETH3) StockMakers 는 TM와 비교하여 100배 정도의 동일 개체 출현 확률이 낮은 것으로 추정되었다 그러나 한우의 생산이력제에 . 적용할 는 다음의 세 가지 조건을 고려하여 MS 최종적으로 선발되어야 한다.
- Each multiplex group is run in a separate gel lane. Primer sequences and chromosome locations were from the Bovine mapviewer of NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/mapviewer).
- 본 실험에 사용된 는 MS marker Applied Biosystems Stockmarker 사의 TM, International Society for Animal Genetics(http://www.isag.org.uk/02_PV panels_LPCGH.doc) Roslin (http://www.와 연구소 projects.roslin.ac.uk/cdiv/markers.html)에서 제안한 소의 다형 성 분석용들을 기초로 하 MS marker 여 선정하였다.
- 한우의 혈액은 경상남도의 사천 고성(Sa), (Go) 진성군 북 의 개 지역 한우농가에서 각 (Ji), (Gu) 4각 두 두 두두 총 두의 번식우 40 , 43 , 33 , 47 163 혈액을 채취하여 분석에 사용하였다 한.우의 혈액에서의 분리는 genomic DNA Genomic DNA (Promega, USA) .
데이터처리
- 4(Raymond Rousset, 1995)와 를 사용하여 계산하였다. F-통계량 추정치에 대한 유의성검정 은 이 제안한 방법에 의하여 Goudet(2001) permutation test , 를 실시하여 얻었으며 계산된 확률값(P) type I error Bonferroni 은를 줄이기 위하여 과정을 적용하여 보정하였다 의 다 형성 . Marker 지수인 heterzygosity(He) polymorphic infor- 와 mation content(PIC) exclusion probability 그리고 (PE) Cervus version 2.
- 2 (Felsenstein, 2004) . 에 이용되었다 최종적으로 F통계량은 프로그램 API-CALC version 1.0 (Ayres 와을 이용한 동일 개체 출현 확률 Overall, 2004)을 계산하는 데 사용하였다.
- 추정된 F-통계량을 이용하여 무작위 교배집단과 반형 매 교배 집단을 가정하여 유전 MS 자형의 동일한 개체 출현 확률 (probability of identity; PI와 probability of identity from half sibs; PIhalf-sibs) (probability of 과 친자감정 확률 parent exclusion when both parents are unconfirmed ; PEpu와 probability of paternity exclusion; PE) API-CALC version 1.0 Cervus version 을과 2.0 , Table 을 이용하여 추정하였으며 그 결과는 4 . 20 MS 에 나타내었다 전체 개의를 사용할 경우 무작위 교배집단에서 는PI 3.
이론/모형
- 0(Marshall , 1998) 는 등을 이용하였다 또한 추정된 . Fst와 Fis 값에 근거하여 무작위 교배집단과 반형 매 교배 집단에서 의 동일 개체 출현가능 확률은 API-CALC version 1.0 (Ayres Overall, 2004)와 을사용하여 계산하 였다
- 63 package(Felsenstein, 2004)를 이용하였다 와 추정법에 의한 . Weir Hill(2002) F-통계 량(Fst, Fit, Fis 및 농장간 pairwise-Fst) FSTAT 은 version 2.9.3(Goudet, 2001) GENEPOP version 과 3.4(Raymond Rousset, 1995)와 를 사용하여 계산하였다. F-통계량 추정치에 대한 유의성검정 은 이 제안한 방법에 의하여 Goudet(2001) permutation test , 를 실시하여 얻었으며 계산된 확률값(P) type I error Bonferroni 은를 줄이기 위하여 과정을 적용하여 보정하였다 의 다 형성 .
- 15 (Dieringer Schltterer, 2002) . 와를 이용하였다 농장간 DA 유전적 거리지수는 matrix neighborjoining(NJ) (Saitou Nei, 1987) 방법와 에 의한 계통유연관계를 추정하는 데 사용하였으며 tree , NJ tree 1000의 분절점에 대한 확률 추정치는 회반복된 방법을 이용하였다 boostrap resampling . 최종적으로의 구축과도식화는 NJ tree PHYLIP version 3.
- 와를 이용하였다 농장간 DA 유전적 거리지수는 matrix neighborjoining(NJ) (Saitou Nei, 1987) 방법와 에 의한 계통유연관계를 추정하는 데 사용하였으며 tree , NJ tree 1000의 분절점에 대한 확률 추정치는 회반복된 방법을 이용하였다 boostrap resampling . 최종적으로의 구축과도식화는 NJ tree PHYLIP version 3.63 package(Felsenstein, 2004)를 이용하였다 와 추정법에 의한 . Weir Hill(2002) F-통계 량(Fst, Fit, Fis 및 농장간 pairwise-Fst) FSTAT 은 version 2.
성능/효과
- 20 MS 11 MS 개의 중상위 개의를 He와 PIC 추정치에 근거하여 선발하였으며 이들의 와, PI PIhalf-sibs를 계산한 결과에서 보는 바와 Table 5 같이 사의 Applied Biosystems StockMakersTM 보다 더 낮은 값이 추정되어 한우의 생산이력제에 보다 적합한 것으로 나타났다 특히 . He 추정치에 의하여 선발한 개의 11 MS markers (TGLA53, TGLA227, ETH185, TGLA122, BM4305, INRA23, ILSTS013, BMS1747, BM2113, BL1009와 ETH3) StockMakers 는 TM와 비교하여 100배 정도의 동일 개체 출현 확률이 낮은 것으로 추정되었다 그러나 한우의 생산이력제에 .
- 한우의 생산이력제에 활용 가능한 종의 20 microsatellite marker , 를 선정하고 다형성지수F통계량 동일 개체 출현 확률 친자감별 확률 및, , 유전적거리지수 등을 MSA, CERVUS, FSTAT, GENEPOP, API-CALC PHYLIP 및 프로그램 등을 연계적으로 활용하여 추정하였다. Heterozygosity 11추정치에 근거하여 선발한 개의 microsatellite(TGLA53, TGLA227, ETH185, TGLA122, BM4305, INRA23, ILSTS013, BMS1747, BM2113, BM2113, BL1009와 ETH3) Applied Biosystems 는 사의 StockMakersTM와 비교하여 배 정도의 100동일개체 출현 확률이 낮아 한우의 생산이력제 적용에 보다 효율적 인 것으로 나타났다 또한. DA 유전적 거리지수와 pairwise-FST 추정치를 활용하여 근접지역의 농장 간 근연관계의 정도를 파악할 수 있는 자료로 활용할 수 있을 것으로 사료된다
- 0018의 비교적 낮은 수준을 나타내었으며, 추정된 별 MS FST 값을 고려해 볼 때 BM1818, BM4305와 BM1824를 제외한 모든 에서 개 MS 4의 대상 농장 간 유전적 분화가 유의적으로 존재함을 알 수 있었다 전체에 대한 . MS FIS 추정치는 유의적 결과를 보이지 않았지만, MS 개 개별 FIS 추정치에서는 SPS115, BM1818, ILST006, BL1009와 ETH225에서 유의적으로 이형접합체가 감소하는 것으로 나타났다.
- 별 농장 간 유전적 . MS 분화 정도를 나타내는 FST 추정치는 에서 0.2418 －0.0018의 비교적 낮은 수준을 나타내었으며, 추정된 별 MS FST 값을 고려해 볼 때 BM1818, BM4305와 BM1824를 제외한 모든 에서 개 MS 4의 대상 농장 간 유전적 분화가 유의적으로 존재함을 알 수 있었다 전체에 대한 . MS FIS 추정치는 유의적 결과를 보이지 않았지만, MS 개 개별 FIS 추정치에서는 SPS115, BM1818, ILST006, BL1009와 ETH225에서 유의적으로 이형접합체가 감소하는 것으로 나타났다.
- 876) . 였다 이러한 결과는 의 개수가 많더라도 출현빈 allele 도가 편귀될 수 있음을 나타내는 것이며, He와 PIC 값의 최상위가 다른 것은 의 개수와 빈도에 의한 추정 계산식 차이에 의한 것으로 사료된다
후속연구
- Heterozygosity 11추정치에 근거하여 선발한 개의 microsatellite(TGLA53, TGLA227, ETH185, TGLA122, BM4305, INRA23, ILSTS013, BMS1747, BM2113, BM2113, BL1009와 ETH3) Applied Biosystems 는 사의 StockMakersTM와 비교하여 배 정도의 100동일개체 출현 확률이 낮아 한우의 생산이력제 적용에 보다 효율적 인 것으로 나타났다 또한. DA 유전적 거리지수와 pairwise-FST 추정치를 활용하여 근접지역의 농장 간 근연관계의 정도를 파악할 수 있는 자료로 활용할 수 있을 것으로 사료된다
- 2).단정적인 설명은 불가능하지만 근접한 지역 내에서의 동일보증정모우 정액의 공급 또는 상호 판매와 입식 등이 발생하였을 가능성은 배제 할 수 없으며 이 결과를 근접지역 내 농장, 간교배지침의 자료로 활용하여 지나친 근친도에 의한 생산성 저하를 방지하는 데 적용될 수 있으리라 사료된다
- multipex set . 따라서 본 연구에서 제안된 He 또는 PIC 추정치의 상위 순위에 의하여 선발된들도 11 MS 최소 하나 또는 두 개의로 구성될 multiplex set 수 있도록 추가 연구를 수행할 필요가 있다
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