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문제 정의
- 본 연구에서는 한국 남성들의 남성 불임 관련 유전자(AR gene)를 CGE를 이용하여 분석하였다. 내부 표준 DNA 절편들의 고유 이동도에 대해 non-linear regression analysis을 수행하여 검정 곡선을 작성하였으며 이를 토대로 CAG 반복 수를 구하여 불임 관련성에 관해 비교 하였다.
제안 방법
- 81명의 불임 남성들과 89명의 정상인 남성들의 AR gene의 CAG 반복 길이를 CGE를 통해 DNA 크기를 측정 하였다. AR gene 에서 남성 불임 관련부분인 CAG 반복 구간을 PCR을 이용하여 증폭한 후 표준 시료인 0X174 RF/Hae III 50ng/piK 각각 1대 1로 혼합하여 모세관 젤 전기영동을 실시하였다.
- 2 years)의 불임 남성을 상대로 비폐쇄적으로 실시 하였다. 81명의 불임 남성은 같은 병원의 유전학 실험실에서 세포유적학적 Y 염색체 미세결실을 분석하였다. 통계적 분석에서, 81명의 불임 남성은 WHO 분류법(1999)에 따라 5개의 아류형 (subtype)으로 분류하였다; 무정자증(azoospermia), 심한 희소 정자증(severe oligozoospermia), OAT 증후군(oligoasthenoteratozoospermia), 심한 OAT 증후군(severe OAT)와 기형 정자증(teratozoospermia).
- AR CAG 대립유전자 크기는 표준 시료를 참조 하여 검정 곡선을 완성하여 계산하였다.
- 81명의 불임 남성들과 89명의 정상인 남성들의 AR gene의 CAG 반복 길이를 CGE를 통해 DNA 크기를 측정 하였다. AR gene 에서 남성 불임 관련부분인 CAG 반복 구간을 PCR을 이용하여 증폭한 후 표준 시료인 0X174 RF/Hae III 50ng/piK 각각 1대 1로 혼합하여 모세관 젤 전기영동을 실시하였다.
- 5 mM dNTPs, 5 mMTris-HCl, 1U의 Taq polymerase 는 Takara로부터 구입하여 사용하였다. AR의 분석 하고자 하는 유전자 영역인 CAG 반복 부분을 primer forward(5'-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC) 오卜 reverse(5'-GCTGrGAAGGrTG-CTGrTCCTCAr> 이용하여 증폭하였다. PCR 프로그램은 일반적으로 95 °C denaturation 40초, 67 °C annealing 40초이며, 72 °C extension 2분씩 35회 수행하였다.
- Androgen 수용체 유전자의 CAG 반복 길이 분석. PCR반응 혼합물의 구성분인 50 mM KC1, 4 mM MgCb, 0.
- CGE를 이용한 DNA 크기 측정의 정 확성을 알아보기 위하여 표준시료인 100 bp step ladder에서 각각 200 bp, 300 bp, 600 bp를 추출하여, 표준 시료인(DX174 RF/Hae III와 함께 분리 하여 길이를 측정 하였다.
- 3는 CGE와 SGE간의 크기 측정 값을 비교하기 위하여 SGE를 이용하여 표준 시료인 100 bp step ladder, 0X174 RF/Hae III을 전기영동을 실시하였다. Genescan 프로그램을 이용하여 0X174 RF/HaeIII를 표준 시료로 하여 100 bp step ladder의 200 bp, 300 bp, 600 bp의 크기 측정을 수행하였다.
- SGE와 CGE를 정확한 크기의 측정을 위하여 각각 200 bp, 300 bp, 600 bp오｝ 표준 시료인 0X174 RF/ HacIII를 이용하여 비교하였다. 크기 측정값을 비교한 결과 CGE가 SGE보다 더 정확한 값을 나타내었다.
- 비정상적인 염색체을 가지는 27명의 남성 중에는 18명의 46XY 무결실 과 Yq 결실, 8명의 47XXY, 그리고 1명의 47XY을 포함한다. Yq 결실 연구에서, 말초 혈액에서 DNA 를 추출 하여 서 multi-PCR방법으로 하나의 SRY와 12 sequence-tagged site(STSs)를 포함하는 Y 염색체의 13 loci를 primers로서 증폭하였다.
- 그리고 불임남성과 정상인 남성을 각각 아류형의 CAG 반복 수의 평균값을 비교 하였다(7况席 2). CAG 반복 수의 평균값의 통계적 중요성 오로지 한국 불임 남성의 무정자증(Azoospermai) 그룹(24.
- 두 개의 유리 vials에 1XTBE bufferf- 각각 채우고 모세 관 양끝을 담근다. 모세관을 전기 영동적으로 평형을 이루기 위해 10분 후에 시료를 주입하였다. DNA 시료 주입은 electrokinetically 방법으로 4kV에서 4초간 이루어졌다.
- 통계적 분석에서, 81명의 불임 남성은 WHO 분류법(1999)에 따라 5개의 아류형 (subtype)으로 분류하였다; 무정자증(azoospermia), 심한 희소 정자증(severe oligozoospermia), OAT 증후군(oligoasthenoteratozoospermia), 심한 OAT 증후군(severe OAT)와 기형 정자증(teratozoospermia). 무정자증은 비폐쇄적으로 역사적이고 물리적인 시험법 인, 정 액 분석 (including assessment ofsperm volume, PH and evaluation of fructose concentration), 초음파로 고환의 부피와 소낭의 정액 평가로 측정되었다. 89명의 정상적인 남성은 26세에서 기세 사이의 나이대(mean ±SD: 43.
- 그러므로 남성불임 관련 AR gene의 CAG 반복 길이의 정 확한 크기 측정으로 CGE가 적합함을 알 수 있었다. 본 연구에서는 81명의 한국의 불임 남성과 89명의 정상적인 한국 남성을 대조군으로 하여, AR gene 의 CAG 반복 길이를 CGE를 이용하여 크기 측정을 하였으며 T-tcst를 이용하여 통계적 유의성을 구하였다. 한국 남성들의 AR gene의 CAG 반복 길이는 불임 남성과 정상적인 남성 사이에 통계적인 차이를 나타냈다.
- 세포유전학적 Y 염색체 미세 결실 분석. 세포 유전학적 분석은 배양된 림프구 세포의 유사분열을 펼쳐서 수행되었다. 81명의 불임 남성 중, 65명은 정상적인 핵형(kaiyotype)(46, XY)을 가졌다.
- 세포유전학적 Y 염색체 미세 결실 분석. 세포 유전학적 분석은 배양된 림프구 세포의 유사분열을 펼쳐서 수행되었다.
- 전기 영 동은 표준시료인 0X174/DNA Hae 111(64 ng/ul) 오* lOObp step ladder(65 ng/ul> 각각 2ul씩 주입하고 100 Volt에서 40분 동안 실시 하였고, gel과 buff社에는 ethidium-bromidei 함유 시켜 전기영동을 하였다. 영동 된 gel을 UV Transilluminator(320 nm 파장)와 CCD 카메라로 촬영하였다. 전기 영동 된 단편의 크기는 Genescan 프로그램(Genotyper 2丄 ABI, Foster city, CA, USA)를 이용하여 결정하였다.
- 5 X TBE buffo를 이용하여 Mupid-oc gel electrophoresis(Advance, Japan)으로 전기 영 동을 실시 하였다. 전기 영 동은 표준시료인 0X174/DNA Hae 111(64 ng/ul) 오* lOObp step ladder(65 ng/ul> 각각 2ul씩 주입하고 100 Volt에서 40분 동안 실시 하였고, gel과 buff社에는 ethidium-bromidei 함유 시켜 전기영동을 하였다. 영동 된 gel을 UV Transilluminator(320 nm 파장)와 CCD 카메라로 촬영하였다.
- 영동 된 gel을 UV Transilluminator(320 nm 파장)와 CCD 카메라로 촬영하였다. 전기 영동 된 단편의 크기는 Genescan 프로그램(Genotyper 2丄 ABI, Foster city, CA, USA)를 이용하여 결정하였다.
- 슬랩 젤 전기영동. 표준 시료끼리 크기 측정값을 비교를 하기 위해 2% agarose gel과 0.5 X TBE buffo를 이용하여 Mupid-oc gel electrophoresis(Advance, Japan)으로 전기 영 동을 실시 하였다. 전기 영 동은 표준시료인 0X174/DNA Hae 111(64 ng/ul) 오* lOObp step ladder(65 ng/ul> 각각 2ul씩 주입하고 100 Volt에서 40분 동안 실시 하였고, gel과 buff社에는 ethidium-bromidei 함유 시켜 전기영동을 하였다.
대상 데이터
- 1XTBE(89 mM Tris, 89 mM borate, 2 mM EDTA) 완충용액을준비하기 위한시약으로는 Tris(hydroxymethyl)- aminomethan(TRIZMA Base), Boric acid, ethylenediaminetetraacetate(EDTA), poly(ethylene oxide)(PEO, Mw=8,000,000), (Sigma-Aldrich. Co., MO, USA)가 사용되었다. Monomeric intercalating dye인 ethidium bromide (EB)(Sigma-Aldrich.
- 2002년 12월부터 2003년 8월까지 20에서 50세 사이 의 나이 대 (mean ± SD: 32.7 ± 3.2 years)의 불임 남성을 상대로 비폐쇄적으로 실시 하였다. 81명의 불임 남성은 같은 병원의 유전학 실험실에서 세포유적학적 Y 염색체 미세결실을 분석하였다.
- 환자와 대조군. 81명의 불임 남성과 89의 정상인 남성의 AR gene PCR product는 모두 CHA 종합병원, Pochon CHA University(Seoul, Korea)에서 동의 하에 제공받았다.
- 전기 영동에서의 electric field strength가 180V/cm로 High-voltage power supply(-30 k：Y Spellman, NY USA) 7卜 人修되었다. DNA labeling dye인 ethidium bromide를 excitation 하기 위하여 543.6 nm의 파장을 가진5 mW의 He-Ne laser(Edmund Scientific Co., NJ, USA)가 사용되었다. laser 빛의 산란을 막기 위해 두 개의 RG610 optical filter^ 사용하였다.
- , MO, USA)가 사용되었다. Monomeric intercalating dye인 ethidium bromide (EB)(Sigma-Aldrich. Co., MO, USA)는 왼^ 용액 속에 3 卩g/nL으I 농도로 녹여 사용하였다. 표준 DNA 절편 시료로_는 0X174/DNA Hae III, 100 bp step ladder (all from takara Bio Inc.
- Androgen 수용체 유전자의 CAG 반복 길이 분석. PCR반응 혼합물의 구성분인 50 mM KC1, 4 mM MgCb, 0.5 mM dNTPs, 5 mMTris-HCl, 1U의 Taq polymerase 는 Takara로부터 구입하여 사용하였다. AR의 분석 하고자 하는 유전자 영역인 CAG 반복 부분을 primer forward(5'-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC) 오卜 reverse(5'-GCTGrGAAGGrTG-CTGrTCCTCAr> 이용하여 증폭하였다.
- 검출 window는 microtorch로 폴리이미드 코팅을 벗겨내어 준비하였다. 모세관의 전체 길이는 30cm이며 유효 길이는 22 cm이다. 완충 용액 저장 용기에 들어가는 전극으로는 0.
- 시약. 본 실험에 사용된 용융 실리카 모세관은 내경 이 75 |j.m, 외경 이 375 呻으로 polymicro Technologies (phoenix, AZ, USA)에서 구입하였다. 검출 window는 microtorch로 폴리이미드 코팅을 벗겨내어 준비하였다.
- 모세관의 전체 길이는 30cm이며 유효 길이는 22 cm이다. 완충 용액 저장 용기에 들어가는 전극으로는 0.5 mm(0)백금 전극(Aldrich Chemical Co.)을 사용하였다.
- 60명의 무정자증과 17명의 심한 OAT 증후군(a sperm count of< 5xlO6/mL, a progressive motility of < 10% and a proportion of <4% with normal morphology), 1 명의 OAT■증"후군(OAT; a disturbance of all the three variables), 1 명의 심한 희소정자증(clxlOZmL), 그리고 2명의 기형 정자증(<14% spermatozoa with normal morphology)으로 분류 되었다. 이 실험들은 모두 한국 CHA General Hospital에서 수행하였다.
- 이 연구에서 우리는 한국의 81명의 불임 남성과 89의 대조군 평균적으로 비교하였으며, 통계학적인 중요한 차이 (P=0.018, Table 2)를 보았다. 그리고 불임 남성의 아류형 그룹인 무정자증의 CAG반복길이에서도 통계적으로 중요한 차이를 보였다(P=0.
데이터처리
- 불임 남성과 정상인 남성 사이의 CAG 반복의 평균 수를 two-sample independent t-test 비교하였다. 그 후에 불임 남성의 아류형을 two-sample independent t-test 또는 Mann-Whitney U test를 통하여 비교 하였다. 통계적 분석에는 SPSS software, version 12(SPSS Corp.
- 본 연구에서는 한국 남성들의 남성 불임 관련 유전자(AR gene)를 CGE를 이용하여 분석하였다. 내부 표준 DNA 절편들의 고유 이동도에 대해 non-linear regression analysis을 수행하여 검정 곡선을 작성하였으며 이를 토대로 CAG 반복 수를 구하여 불임 관련성에 관해 비교 하였다.
- , Chicago, IL)가 사용 되었으며, 모든 결과는 means土SD로서 나타내었다. 두 그룹 사이의 data 결과의 계산에서는 T-test를 이용하여 CAG 반복 수의 평균을 비교하였다. p값 <0.
- 통계 분석. 불임 남성과 정상인 남성 사이의 CAG 반복의 평균 수를 two-sample independent t-test 비교하였다. 그 후에 불임 남성의 아류형을 two-sample independent t-test 또는 Mann-Whitney U test를 통하여 비교 하였다.
- 그 후에 불임 남성의 아류형을 two-sample independent t-test 또는 Mann-Whitney U test를 통하여 비교 하였다. 통계적 분석에는 SPSS software, version 12(SPSS Corp., Chicago, IL)가 사용 되었으며, 모든 결과는 means土SD로서 나타내었다. 두 그룹 사이의 data 결과의 계산에서는 T-test를 이용하여 CAG 반복 수의 평균을 비교하였다.
- 4의 electropherogram으로부터 CAG 반복 길이의 계산을 위해 각각의 DNA 절편들의 염기 쌍에 대한 전기 영동적 이동도를 구하여 검정 곡선을 만든다. 표준 시료인 0X174 RF/Hae III의 전기 영동적 이동도를 이 용하여 non-linear regression analysis을 통하여 검정 곡선의 함수 식 을 찾았다. 검정 곡선의 regression 함수식은 y^.
이론/모형
- 모세관을 전기 영동적으로 평형을 이루기 위해 10분 후에 시료를 주입하였다. DNA 시료 주입은 electrokinetically 방법으로 4kV에서 4초간 이루어졌다. 실험 후에 각각 모세관을 증류수를 이용하여 15-30분간 세척한 후 새로운 고분자 gel을 높은 압력으로 채워서 사용한다.
- 모세관 젤 전기영동 레이저 유발 형광 검출법 . 1XTBE 버퍼 용액은 0.
- , Japan)를 사용하였다. 시료 주입은 계면 동전기적 (electro kinetically)방법을 사용하였다. 모든 실험 에 사용된 시 약은 순수한 고차 증류수(milli-Q reagent water system.
성능/효과
- 정자 분석은 World Health Organization (WHO 1999)와 Kruger et , 1896)의 지침에 따라 엄격하게 수행되었으며, 비폐쇄성 불임 남성들을 5가지의 아류형으로 분류하였다. 60명의 무정자증과 17명의 심한 OAT 증후군(a sperm count of< 5xlO6/mL, a progressive motility of < 10% and a proportion of <4% with normal morphology), 1 명의 OAT■증"후군(OAT; a disturbance of all the three variables), 1 명의 심한 희소정자증(clxlOZmL), 그리고 2명의 기형 정자증(<14% spermatozoa with normal morphology)으로 분류 되었다. 이 실험들은 모두 한국 CHA General Hospital에서 수행하였다.
- Table 1에서 CGE오｝ SGE를 이용하여 200 bp, 300 bp, 600 bp 각각을 크기 측정을 하여 계산한 값을 나타내었다. 200 bp의 표준 시료를 CGE로 분석한 결과 200 bp 로 정확하게 나왔으나, SGE로 분석한 결과 208 bp로8 bp의 차이를 가지는 것으로 나타났다. SGE에서는 600bp에서는 보다 많은 19bp의 차이를 보여주고 있다.
- 5 CAG 반복 영역은 polyglutamine tract로 암호화 되었으며 n의 정상적인 범위는 11에서 31사이 이다.6 이 CAG 반복 확장이40 반복의 범위를 넘어서면 치명적인 근신경적 질병인 척수 연수 근육 위측증(spinal bulbar muscular atrophy; SBMA)을 유발한다J 이와 반대로 짧은 CAG 반복은 AR의 androgenicity를 증가시키고, 그 결과로 이래적으로 전립선 조직에 높은 자극을 주며 이른 나이에 전립선암이 발병하게 되고, 종양의 위험성 등급이 증가하며, 전립선 이외의 전이가 증가하게 된다.7
- 그리고 불임남성과 정상인 남성을 각각 아류형의 CAG 반복 수의 평균값을 비교 하였다(7况席 2). CAG 반복 수의 평균값의 통계적 중요성 오로지 한국 불임 남성의 무정자증(Azoospermai) 그룹(24.88±2.4(range, 18-29), P=0.038<0.05)에만 보였으며 , 다른 아류형 그룹은 없었다. 심한 OAT증후군(severe OAT) 그룹(25.
- SGE에서는 600bp에서는 보다 많은 19bp의 차이를 보여주고 있다. 결과적으로 CGE가 SGE보다 빠른 분리를 보였으며, 정확성 면에서도 훨씬 우수 한 것으로 나타났다. TRE 관련 질병은 3개의 핵산이 반복하여 증가하여 생기는 질병이기 때문에 진단하기 위해서는 정확한 크기 측정값의 계산이 필요로 한다.
- 크기 측정값을 비교한 결과 CGE가 SGE보다 더 정확한 값을 나타내었다. 그러므로 남성불임 관련 AR gene의 CAG 반복 길이의 정 확한 크기 측정으로 CGE가 적합함을 알 수 있었다. 본 연구에서는 81명의 한국의 불임 남성과 89명의 정상적인 한국 남성을 대조군으로 하여, AR gene 의 CAG 반복 길이를 CGE를 이용하여 크기 측정을 하였으며 T-tcst를 이용하여 통계적 유의성을 구하였다.
- 본 연구에서 측정된 한국인의 AR gene의 CAG 반복 길이를 다른 인종과 비교하면 Singapore Chinese (Mean(range); 25.40(14-31))12, UK(Mean(range); 25.00 (23-26)尹와 비슷한 크기의 CAG 반복 길이를 보였고 Australian(Mean(range); 23.20( 15-34)26, American (Mean(range); 23.50(18-39), 21.95(14-31))% French (Mean(range); 23.91(13-28此에 비해 보다 큰 차이를 보였다. 한국 불임 남성의 아류형 그룹인 무정자증 (Mean(range); 24.
- TRE 관련 질병은 3개의 핵산이 반복하여 증가하여 생기는 질병이기 때문에 진단하기 위해서는 정확한 크기 측정값의 계산이 필요로 한다. 이 실험에서는 CGE가 남성 불임 관련 AR gene의 CAG 반복 길이 측정에 유용하다는 것을 알 수 있다.
- 전체적으로 불임 남성 이 정상인 남성보다 CAG 반복 길이가 긴 영역에서 많이 관찰되는 경향을 보였다. 정상인인 남성 그룹은 보다 짧은 영역에서 많이 나타나는 경향을 보였다.
- SGE와 CGE를 정확한 크기의 측정을 위하여 각각 200 bp, 300 bp, 600 bp오｝ 표준 시료인 0X174 RF/ HacIII를 이용하여 비교하였다. 크기 측정값을 비교한 결과 CGE가 SGE보다 더 정확한 값을 나타내었다. 그러므로 남성불임 관련 AR gene의 CAG 반복 길이의 정 확한 크기 측정으로 CGE가 적합함을 알 수 있었다.
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