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문제 정의
- 본 논문은 托裏消毒飮의 전립선암에 대한 응용 가능성을 확인하고자 남성호르몬 의존형 전립선 암세포인 DU145 세포에 托 裏消毒飮 추출물을 처리한 후 세포고사 유도 효과와 그 기전을 조사한 논문이다.
- 이에 저자는 남성호르몬 비의존형 전립선 암세포인 DU145 를 이용하여 托裏消毒飮의 세포고사 유도효과를 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- DU145 세포를 96 well 세포배양 용기에 lxlO4 c이ls/ml 씩 분주하여 24시간 세포배양 용기에 부착시키고, 안정화된 DU145 세포에 托裏消毒飮 추출물을 24시간 처리하여 MTT(0.5mg/ml) 와 3시간 반응시켰다. 생존 세포가 MTT로부터 생성한 见라색 불용성 formazane DMSO로 용해하여 570nm 파장에서 ELISA reader(Molecular Device, E-maxz USA)로 흡광도를 측정하였다.
- 8mA/cm:)S 이용하여 nitrocellulose membrane으로 이동시킨 다음, 5% skim milk와 상온에서 1시간 반응시겨 비특이적인 항체반응을 억제시켰다. PTEN과 Par-4에 대한 일차항체 (primary antibody) 는 TBS-T 에 1:1,000으로 희석하여 nitrocellulose membrane과 상온에서 24시간 반응시키고 TBS-T 루 10분 3번 세척한 후 이차항체 (secondary antibody) 인 anti-mouse IgG conjugated alkaline phosphatase(TBS・T 로 1:3, 000으로 희석, Amersham Co., England)와 상온에서 1 시간 반응시킨 후, NBT/BCIP 시약을 이용하여 노출시켰다.
- 托裏消毒飮 추출물에 의한 DU145 세포의 고사과정에 Par-4 의 발현 변화가 관여하는지를 확인하고자 2.0mg/ml 托裏消毒飮 주출물을 & 12, 24시간 동안 세포에 노출시킨 후 Par-4에 대한 일차 항체를 이용하여 Western bk世箱g을 시행하였다. 그 결과 처리한 시간에 의존적으로 Par-4의 발현이 증가하였다(Fig.
- 추출물을 2.0mg/ml의 농도로 6, 12, 24시간 동안 DU145 세포에 처리한 결과 처리한 시간에 의존적으로 PTEN 단백질의 발현을 증가시켰다(Fig. 3). 이러한 결과는 DU145세포의 托裏消毒飮의 고사효과는 암 억제 유전자인 PTEN의 발현을 증가시겨서 Akt/PKB의인산화를 억제하여 나타낸 것으로 사료된다.
- 托裏消毒飮 추출물이 DU145 세포의 생존율 감소 효과가 세포 고사에 의한 것인지 확인 하고자 Hoechst 33342 염료를 이용하여 세포고사의 특징적인 현상인 염색체 응축 (chromatin condensation)과 DNA 분절(fragmentation) 현상을 조사하였다 的. Hoechst 33342 염료는 세포 핵내의 염색체와 DNA를 선택적으로 염색하는 염료로서 세포고사 현상을 확인하기 위하여 사용되고 있다25).
- 托裏消毒飮 추출물이 DU145 세포의 세포생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Ixio'eiis/ml의 세포를 RPMI 배지에 접종하고 24시간 후에 托裏消毒飮 추출물을 0.2~5.0mg/ml의 농도로 24시간 동안 처리한 후 MTT을 이용하여 세포생존율을 조사하였다. 그 결과 Fig.
- 고정된 세포부유액 (50μ1)을 슬라이드에 옮겼고 실온에서 건조하였다. 고정된 세포는 PBS로 3번 세척했고, 건조시킨 뒤, nucleus-specific Hoechst 33342 염료(1 ug/ml)로 10분간 상온에서 염색한 후 PBS을 이용해 세척했고, 건조시킨 후 90% 글리세롤(glycerol)로 마운트 연구용 표본이나 슬라이드를 제작하였다 . 슬라이드는 형광 현미경 (Olymphs, .
- 5mg/ml) 와 3시간 반응시켰다. 생존 세포가 MTT로부터 생성한 见라색 불용성 formazane DMSO로 용해하여 570nm 파장에서 ELISA reader(Molecular Device, E-maxz USA)로 흡광도를 측정하였다. 측정한 formazan 생성 정도는 대조군 세포에 비교하여 박분율 (%)로 표시하였다.
- 24시간 후에 1 ml의 세포부유액은 3분 동안 LOOOrpm으로 원심분리 하여 세포를 침전시켰다. 세포 침전물은 4%의 중성 완충된 포르말린 (100111)을 첨가하여 고정했다. 고정된 세포부유액 (50μ1)을 슬라이드에 옮겼고 실온에서 건조하였다.
- 유지하였다. 세포는 지수 성장을 유지하기 위해서 2~3일마다 분주하여 배양하였다 세포수는 hemacytometer# 이용한 표준 절차에 의해서 측정하였다.
- 고정된 세포는 PBS로 3번 세척했고, 건조시킨 뒤, nucleus-specific Hoechst 33342 염료(1 ug/ml)로 10분간 상온에서 염색한 후 PBS을 이용해 세척했고, 건조시킨 후 90% 글리세롤(glycerol)로 마운트 연구용 표본이나 슬라이드를 제작하였다 . 슬라이드는 형광 현미경 (Olymphs, . Japan)을 이용해 조사했다.
- 이러한 托裏消毒飮 추출물의 생존율 감소효과가 세포 고사 유도에 의한 것인지 확인하고자 DU145 세포에 0.2 에서 5.0mg/ml 농도로 托裏消毒飮 추출물을 24시간 동안 처리한 후 Hoechst 33342 염료를 이용하여 세포고사의 특징적인 현상인 염색체 응축과 DNA 분절 현상을 조사하였다%). 그 결과 1.
대상 데이터
- DU145 세포 (1x10%이ls/ml)를 10%의 FBS가 포함된 RPMI 1640배지를 이용하여 6-well dishes에서 배양하였다. 24시간 후에 1 ml의 세포부유액은 3분 동안 LOOOrpm으로 원심분리 하여 세포를 침전시켰다.
- 본 연구에 사용된 托裏消毒飮은《萬病回春》에 근거하였으며 구성 약재는 원광대학교 익산 한방병원에서 구입하였으며처방 구성은 다음과 같다.
- 세포배양에 사용한 세포배양 용기는 Falcon 사 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로부터 구입하였으며, MTT(3-(4/5-dimethylthiazol-2-yl)-2/5-diphenyltetrazolium bromide) 는 Sigma(ST, USA)에서 구입하였고, PTEN과 Par-4 항체, Alkaline pohsphatase-conjugated mouse IgG secondary antibody 는 Santa Cruz사(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고 세포배양액 RPMI, Fetal bovine serum(우태아혈청), 항생제 등은 GIBCO BRL사(Grand Island, NYZ USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 인간 유래 남성호르몬 비의존형 전립선 암세포인 DU145 세포는 American Type Culture Collection(ATCC; Rockville, MD, USA)에서 구입하였고, 10% FBS가 첨가된 RPMI에서 95% 공기와 5% 이산화탄소(CO?)가 소통되는 습기가 충분한 대기에서 3 7℃를 유지하였다. 세포는 지수 성장을 유지하기 위해서 2~3일마다 분주하여 배양하였다 세포수는 hemacytometer# 이용한 표준 절차에 의해서 측정하였다.
데이터처리
- E.M으로 표시하였으며 유의성의 검정은 Microcal Origin(Version 6.0) 을 이용하여 ANOVA one-way test에 의하였으며 p값이 0.05 이하인 것만 유의한 것으로 하였다.
이론/모형
- 24 hours. Cell viability was measured by MTT assay. The percentage of viable cells was calculated as a ratio of A570 of treated- to control cells (treated with 0.
- 단백질 정량은 bovine serum albumin을 기준치로 이용한 Bradford의 방법约에 의거하여 정량하였다.
성능/효과
- 0mg/ml 托裏消毒飮 추출물을 24 시간 동안 DU145 세포에 처리한 후 염색하여 조사한 결과 l.Omg/ml의 농도부터 염색체 응축과 DNA 분절현상이 나타났으며 처리한 농도에 비례하여 세포고사 효과가 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2).
- 것으로 알려져 있다34). Par-4 단백질 발현에 대한 托裏消毒飮 추출물의 효과를 DU145 세포에서 조사한 결과 PTEN의 결과와 마찬가지로 처리한 시간에 의존적으로 Par-4의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(Fig. 4). 托裏消毒飮이 Par-4의 발현을 증가 시켜 세포고사를 유도하는 것으로 나타났으나 FasL/Fas 신호전달기전을 활성화시키는지 또는 NF-kB의 활성화를 억제시켜 고사를 유도하는지 지속적인 연구가 필요할 것이다.
- 托裏消毒飮 추출물에 의한 DU145 세포의 고사과정에 PTEN 의 발현 변화가 관여하는지를 확인하고자 2.0mg/mi 托裏消毒飮 추출물을 6, 12, 24시간 동안 세포에 노출시킨 후 PTEN에 대한 일차 항체를 이용하여 Western blotting을 시행하였다 그 결과 처리한 시간에 의존적으로 PTEN의 발현이 증가하였다(Fig. 3).
- 0mg/ml 농도로 托裏消毒飮 추출물을 24시간 동안 처리한 후 Hoechst 33342 염료를 이용하여 세포고사의 특징적인 현상인 염색체 응축과 DNA 분절 현상을 조사하였다%). 그 결과 1.0mg/ml의 농도로 처리한 군에서부터 염색체 응축과 DNA 분절현상이 나타났으며 그 효과는 5.0mg/ml의 농도까지 지속되는것으로 나타났다(Fig. 2). 이러한 결과는 托裏消毒飮의 DU145 세포에 대한 생존율 감소효과는 세포고사 유도에 의한 것임을 알 수 있었다.
- 그 결과 托裏消毒飮 주출물은 DU145 세포의 생존율을 처리한 농도에 비례하여 감소시켰으며 2.0mg/ml의 농도에서 약 74.5%의 생존율 감소를 나타냈다(Fig. 1). 이러한 결과는 권 등而 이 托裏消毒飮 추출물을 2.
- 0mg/ml 托裏消毒飮 주출물을 & 12, 24시간 동안 세포에 노출시킨 후 Par-4에 대한 일차 항체를 이용하여 Western bk世箱g을 시행하였다. 그 결과 처리한 시간에 의존적으로 Par-4의 발현이 증가하였다(Fig. 4).
- 치료하는데 활용되어 왔다回. 실험적으로 권 등纳은 托裏 消毒飮 추출물이 HL-60 세포에서 세포고사를 유도하고 그 기전이 hydrogen peroxide 발생, caspase-3 활성화, PARP 절단, DNA 분절, 세포고사 유도인 것을 발표하였다.
- 2). 이러한 결과는 托裏消毒飮의 DU145 세포에 대한 생존율 감소효과는 세포고사 유도에 의한 것임을 알 수 있었다.
- 이상의 결과를 요약하면, 인간 전립선 암세포인 DU145 세포에서 托裏消毒飮 추출물은 세포고사에 의한 생존율의 감소를 유도하였으며 세포고사 기전에 PTEN과 Par-4 발현의 증가가 관여하는 것으로 나타났다. 앞으로 다른 암세포에서의 托裏消毒飮의고사 유도:효과를 조사하고 그 유도 기전을 밝힌다면 전립선 암 치료제로서 托裏消毒飮을 개발할 수 있는 가능성을 시사한다.
후속연구
- 4). 托裏消毒飮이 Par-4의 발현을 증가 시켜 세포고사를 유도하는 것으로 나타났으나 FasL/Fas 신호전달기전을 활성화시키는지 또는 NF-kB의 활성화를 억제시켜 고사를 유도하는지 지속적인 연구가 필요할 것이다.
- 것으로 나타났다. 앞으로 다른 암세포에서의 托裏消毒飮의고사 유도:효과를 조사하고 그 유도 기전을 밝힌다면 전립선 암 치료제로서 托裏消毒飮을 개발할 수 있는 가능성을 시사한다.
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