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문제 정의
- 본 논문은 托裏消毒飮의 전립선암에 대한 응용 가능성을 확인하고자 남성호르몬 비의존형 전립선 암세포인 PC-3 세포에 托 裏消毒飮 추출물을 처리한 후 세포고사 유도 효과와 그 기전을 조사한 논문이다.
- 이에 저자는 남성호르몬 비의존형 전립선 암세포인 rc-3을이용하여 托裏消毒飮의 세포고사 유도효과를 조사하고 그 기전을 연구하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 托裏消毒飮 추출물이 PC-3 세포의 세포생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여, l<"cells/ml의 세포를 RPMI 배지에 접종하고 24시간 후에 托裏消毒飮 추출물을 0.2-5.0mg/ml의 농도로 48시간 동안 처리한 후 MTT을 이용하여 세포생존율을 조사하였다 그 결과 Fig. 1과 같이 처리한 농도에 비례하여 세포 생존율이 감소하였다. 특히 2.
- 8mA/cH)을 이용하여 nitrocellulose membrane으로 이동시킨 다음, 5% skim milk와 상온에서 1시간 반응시켜 비특이적인 힝체반응을 억제시켰다. Akt, p-Akt, IkB-ci와 ParM에 대한 일차 항체 (primary antibody)는 TBS-T에 1丄000으로 희석하여 nitrocellulose membrane과 상온에서 24시간 반응시키고 TBS-T 로 10분 3번 세척한 후 이차항체 (secondary antibody) 인 anti-mouse IgG conjugated alkaline phosphatase (TBS-T 1:3, 000으로 희석, Amersham Co., England)와 상온에서 1시간 반응시킨 후, NBT/BCIP 시약을 이용하여 노출시켰다.
- 0)를 가하여 DNA p이let을 용해한 후 260 nm와 280 nm의 Spectrophotometer하에서 OD값을 측정하여 DNA를 정량한다. DNA 5ug을 2% agarose gel에서 전기영동(50 V, 2시간)을 실시한 후 ethidium bromide로 염색하여 UV등 아래에서 DNA 분절을 관찰하였다.
- DNA 분절현상을 조사하기 위하여 genomic DNA 추출은 Wizard Genomic DNA purification kit(FTomega, USA)를 이용하였다. 托裏消毒飮 추출물을 PC-3 세포에 48시간 동안 처리한 후 세포를 수확하여 nuclear lysis buffei를 첨가하여 세포를 파괴한 후 RNase를 37℃에서 5분 처리하여 RNA를 제거한 후 단백질 침전용 완충용액으로 단백질을 제거하고 isQpropanel 침전에 의하여 응축된 DNA를 70% 에탄올에 세척한 후 진공 건조기로 건조한다.
- 托裏消毒飮 추출물을 PC-3 세포에 48시간 동안 처리한 후 세포를 수확하여 nuclear lysis buffei를 첨가하여 세포를 파괴한 후 RNase를 37℃에서 5분 처리하여 RNA를 제거한 후 단백질 침전용 완충용액으로 단백질을 제거하고 isQpropanel 침전에 의하여 응축된 DNA를 70% 에탄올에 세척한 후 진공 건조기로 건조한다. 여기에 TE 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 8。1 mM EDTA, pH 8.
- 托裏消毒飮 추출물이 PC-3 세포에서 NF-kB 활성도에 미치는 효과를 관찰하기 위하여 2.0mg/ml 托裏消毒飮 추출물을 3, 6, 12, 24, 48시간 동안 처리한 후 핵 추출물을 수집하여 NF-kB 활성도를 조사하였다. 그 결과 托裏消毒飮 추출물을 12시간 처리한 군에서 NF-kB 활성도가 감소하였으며 48시간에서는 완전히 억제하는 것으로 나타났다.
- 托裏消毒飮 추출물이 PC-3 세포의 생존율 감소 효과가 세포 고사에 의한 것인지 확인 하고자 세포고사의 특징적인 현상인 DNA 분절(fragmentation) 현상을 조사하였다'“, 2.0mg/ml 托 裏消毒飮 추출물을 3, 6, 12, 24, 48시간 동안 PC-3 세포에 처리한 후 조사한 결과 12시간부터 DNA 분절 현상이 나타났으며 48시간까지 지속되었다(Fig. 2).
- 5mg/ml)와 3시간 반응시켰다. 생존 세포가 MTT로부터 생성한 보라색 불용성 formazane DMSO로 용해하여 570nm 파장에서 ELISA reader(Molecular Device, E-max, USA)로 흡광도를 측정하였다. 측정한 formazan 생성 정도는 대조군 세포에 비교하여 백분율 (%)로 표시하였다.
- 방사선 동위원소가 부착된 probe는 540 陽의 핵단백질과 실온에서 30분 반응시킨 후 냉온실에서 4% polyacrylamide g이에 전기영동 하였다. 이 gele 건조 후 autoradiography 방법으로 X-ray 필름에 현상하여 NF-kB 활성을 측정하였다. 핵 추출물을 취득하고 남은 cytosol 분획은 kB-a Western blotting을 시행하였다.
- 1). 이러한 托裏 消毒飮 추출물의 생존율 감소효과가 세포고사 유도에 의한 것인지 확인하고자 PC-3 세포에 0.2에서 2.0mg/ml 농도로 托裏消毒 飮 추출물을 3-48시간 동안 처리한 후 세포고사의 특징적인 현상인 염색체 응축과 DNA 분절 현상을 조사하였다以㈣. 그 결과 12 시간부터 DNA 분절현상이 나타났으며 그 효과는 48시간까지지속되는 것으로 나타났다(Fig.
- 전사인자 활성을 측정키 위해 먼저 약재가 처리된 PC-3 세포에서 핵 추출물은 Jeong 등의 방법으로 모아졌다町 세포는 저 삼투압 용해용액 (0.2 mM PMSF, 10 “g/禍 aprotinin, 20 pM pepstatin A, 0.1 mM antipapain)으로 10분 얼음에서 팽창 시켜 최종적으로 Nonidet P-40을 0.1 %되게 처리한 후 2, 500rpm에서 원심분리 하여 핵단백질만을 모았다. NF-kB의 활성측정은 NF-k B 의 consensus binding site 을 가진 oligonucleotide probe(5、CCG GCC GGT TAA CAG AGG GGG CTT TCC GAG; 5'-CCG GCT CGG AAA GCC CCC TCT GTT AAC CGG)를 10 mM Tris-HCL 용액 (pH 8.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 托裏消毒飮은 萬病回春')에 근거하였으며 구성 약재는 원광대학교 익산 한방병원에서 구입하였으며 처방 구성은 다음과 같다.
- 세포배양에 사용한 세포배양 용기는 Falcon 사 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로부터 구입하였으며, MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetraz 이 ium bromide) 는 Sigma(ST, USA)에서 구입하였고, PTEN과 Par-4 항체, Alkaline pohsphatase-conjugated m 이ase IgG secondary antibody 는 Santa Cniz사(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고 세포배양액 RPMI, Fetal bovine serum(우태아혈청), 항생제 등은 GIBCO BRL사(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 인간 유래 남성호르몬 비의존형 전립선 암세포인 PC-3 세포는 American Type Culture Collection(ATCC; Rockville. MD. USA)에서 구입하였고, 10% FBS가 첨가된 RPMI에서 95% 공기와 5% 이산화탄소(CO, 가 소통되는 습기가 충분한 대기에서 3 7℃를 유지하였다. 세포는 지수 성장을 유지하기 위해서 2-3일마다 분주하여 배양하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 mean士SEM으로 표시하였으며 유의성의 검정은 Microcal Origin(Version 6.0)을 이용하여 ANOVA one-way test에 의하였으며 p값이 0.05 이하인 것만 유의한 것으로 하였다.
이론/모형
- Ceils were treated with various concentrations of TRSDY extract for 48 hour. Cell viability was measured by MTT assay. The percentage of viable cells was calculated as a ratio of A570 of treated- to control cells (treated with 0.
- 托裏消毒飮 추출물에 의한 PC-3 세포의 고사과정에 Par-4의발현 변화가 관여하는지를 확인하고자 2.0mg/ml 托裏消毒飮 추출물을 6, 12, 24시간 동안 세포에 노출시킨 후 Par-4에 대한 일차 항체를 이용하여 Western blotting을 시행하였다. 그 결과 托 裏消毒飮 추출물을 처리한 군의 Par-4의 발현양은 대조군과 차이을 나타내지 못하였다(Fig.
- 托裏消毒飮 추출물에 의한 PC-3 세포의 고사과정에 p-Akt 의 발현 변화가 관여하는지를 확인하고자 2.0mg/ml 托裏消毒飮 추출물을 6, 12, 24, 48시간 동안 세포에 노출시킨 후 p-Akt에 대한 일차 항체를 이용하여 Western blotting을 시행하였다. 그 결과 처리한 시간에 의존적으로 p-Akt의 발현이 감소하였으나 항상 같은 양으로 존재하는 Akt의 양은 변화가 없었다(Fig.
- 단백질 정량은 bovine serum albumin을 기준치로 이용한 Bradford의 방법坳에 의거하여 정량하였다.
- 3A). 또한 托裏消毒飮에 의한 NF-kB 활성도의 감소가 IkB-q degradation의 감소 의한 것임을 IkB-q Western blotting을 이용하여 확인하였다(Fig. 3B).
- 세포는 지수 성장을 유지하기 위해서 2-3일마다 분주하여 배양하였다. 세포수는 hemacytometere 이용한 표준 절차에 의해서 측정하였다.
- 이 gele 건조 후 autoradiography 방법으로 X-ray 필름에 현상하여 NF-kB 활성을 측정하였다. 핵 추출물을 취득하고 남은 cytosol 분획은 kB-a Western blotting을 시행하였다.
성능/효과
- NF-kB는 불활성화 상태에서 IkB와 같이 복합체를 이루어 적절한 신호가 전달되면 IkB가 인산화 되며 분해되고 NF-kB는 핵내로 이동하여 활성화되는 것으로 알려져있다과, 25). 2.0mg/ml 托裏消毒飮 추출물을 PC-3 세포에 처리한 후 NF-kB의 활성도를 측정한 결과 12시간부터 핵내로 이동한 NF-kB의 양이 감소하였으며(Fig. 3A) 이것은 IicB-a의 분해의 감소로 인한 것으로 나타났다(Fig. 3B).
- 그 결과 托裏消毒飮 추출물을 12시간 처리한 군에서 NF-kB 활성도가 감소하였으며 48시간에서는 완전히 억제하는 것으로 나타났다. 또한 NF-kB의 특이성(specificity)을 확인하기 위하여 100배 (Lane N)의 kB oli응。nucleotide를 첨가하여 확인한 결과 NF-kB 활성도가 감소하여 NF・kB의 특이성을 확인하였다(Fig. 3A). 또한 托裏消毒飮에 의한 NF-kB 활성도의 감소가 IkB-q degradation의 감소 의한 것임을 IkB-q Western blotting을 이용하여 확인하였다(Fig.
- 托裏消毒飮 추출물은 PC-3 세포의 생존율을 처리한 농도에 비례하여 감소시켰으며 2.0mg/ml의 농도에서 48시간 동안 처리한 결과 약 54%의 생존율 감소를 나타냈다(Fig. 1). 이러한 托裏 消毒飮 추출물의 생존율 감소효과가 세포고사 유도에 의한 것인지 확인하고자 PC-3 세포에 0.
- 0mg/ml 농도로 托裏消毒 飮 추출물을 3-48시간 동안 처리한 후 세포고사의 특징적인 현상인 염색체 응축과 DNA 분절 현상을 조사하였다以㈣. 그 결과 12 시간부터 DNA 분절현상이 나타났으며 그 효과는 48시간까지지속되는 것으로 나타났다(Fig. 2). 이러한 결과는 托裏消毒飮의 PC-3 세포에 대한 생존율 감소효과는 세포고사 유도에 의한 것임을 알 수 있었다.
- 0mg/ml 托裏消毒飮 추출물을 6, 12, 24시간 동안 세포에 노출시킨 후 Par-4에 대한 일차 항체를 이용하여 Western blotting을 시행하였다. 그 결과 托 裏消毒飮 추출물을 처리한 군의 Par-4의 발현양은 대조군과 차이을 나타내지 못하였다(Fig. 5).
- 0mg/ml 托裏消毒飮 추출물을 3, 6, 12, 24, 48시간 동안 처리한 후 핵 추출물을 수집하여 NF-kB 활성도를 조사하였다. 그 결과 托裏消毒飮 추출물을 12시간 처리한 군에서 NF-kB 활성도가 감소하였으며 48시간에서는 완전히 억제하는 것으로 나타났다. 또한 NF-kB의 특이성(specificity)을 확인하기 위하여 100배 (Lane N)의 kB oli응。nucleotide를 첨가하여 확인한 결과 NF-kB 활성도가 감소하여 NF・kB의 특이성을 확인하였다(Fig.
- 이상의 결과를 요약하면, 인간 전립선 암세포인 PC-3 세포에서 托裏消毒飮 추출물은 세포고사에 의한 생존율의 감소를 유도하였으며 세포고사 기전에 Akt의 인산화 억제를 통한 iKB-a의 분해 감소, Nk-KB 활성도의 감소가 관여하는 것으로 나타났다. 앞으로 다른 암세포에서의 托裏消毒飮의 고사 유도효과를 조사하고 in vivo에서의 효과를 조사한다면 전립선 암치료제로서 托 裏消毒飮을 개발할 수 있는 가능성을 시사한다.
후속연구
- 나타났다. 앞으로 다른 암세포에서의 托裏消毒飮의 고사 유도효과를 조사하고 in vivo에서의 효과를 조사한다면 전립선 암치료제로서 托 裏消毒飮을 개발할 수 있는 가능성을 시사한다.
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