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문제 정의
- oxygen species(ROS)의 생성을 관찰하였다. 또한 聰明湯 과 巴戟天聰明湯 열수추출물 및 초미세분말을 시료로 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐 모델의 혈청、내 glucose, uric acid, AChE의 변화를 관찰하였고 Morris water maze에서 생쥐의 행동 변화를 VIDEOTRACK으로 측정한 바 유의한 결과를 얻었으므로 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 10주령 ICR계 생쥐 10마리를 1군으로 하여 아무런 처리를 하지 않은 대조군, galanthamine(3mg/ kg, i.p) 투여군, 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 열수추출물(400nig/kg, p.o) 실험군 그리고 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 초미세분말(400㎎/㎏, p.o) 실험군으로 나누고, 4주간 약물을 투여하였다. 약물 투여 22일째부터 scopolamine(l ㎎/㎏)을 7일간 1일 1회 복강 주사 후 심장천자법으로 혈액을 채혈하여 혈청을 분리하였다.
- AChE 활성도는 cholinesterase kit로 측정하였다. 혈청 중 AChE 활성도를 측정하기 위하여 test tube와 blank tube를 표시하고, test tube에 sodium chloride solution(cat.
- BV2 microglial cell line 내의 ROS를 측정하기 위하여 24 wells plate의 각 w이1에 5x105 cells씩 첨가하고, 聰明湯과 巴戟 天聰明湯 열수추출물(100娼/畝, 10妈/砒)을 처리하고 I시간 후 LPS(以g/竝)를 처리한 후 371:에서 48시간 배양하였다. 배양 종료 후 DCFH-DA 50uM을 처리하고 5분간 배양하고 2회 수세한 후 flow cytometer로 세포 내 형광 ROS를 측정하였다.
- BV2 microglial cell line 을 실험 3 일전에 subcultureQxlO’cells/u粉하여 96 w이Is plate에 2xl035 *세 포를 각 well 에 분주한 후 우태아혈청 결핍 DMEM 배양액으로 overnight 시켰다, 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수추출물(1如座/戒) 을 처리하고 1시간 후 LPS(0.1座/畝)를 각각의 w이1에 첨가하였다. 6시간 후 DMEM 배양액으로 각 well을 세척한 후 새로운 배양액과 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수추출물(1。⑰g/n粉을 처리하고 48시간 동안 CO2 조직 배양기에서 배양하였다.
- mLFC 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 자란 것을 Trysin-EDTA 용액으로 단일 세포들이 되도록 떼어내고, 20시砰 개의 세포를 96 wells plate에 분주하고 배양기(37℃, 5% CO2)에서 2시간 배양한 후 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수추출물(최종 농도 20珈g/戒, 100/zg/50“g/M 10鶴/畝 1陽/畝)을 48시간 동안 처리하였다. BV2 microglial cell line(l><105 cells/24 wells plate)에 lipopolysaccharide(LPS)(0.1/2g/mQ, 聰明湯과 巴戟天聰 明湯 열수卒출물(如⑰g/戒)을 처리하고 72시간 동안 동시 배양하였다. 배양종료 후에 배양액을 버리고 PBS로 2회 세척하였다, 각 well에 50% trichloroacetic acid(TCA) 50成를 가하고 1시간 동안 4℃에 방치한 후 증류수로 5회 세척한 다음 well plate를 공기 중에서 건조하였다.
- BV2 microglial cell linee 24 w이Is plate에 2x10, 세포를 각각 분주한 후 12시간 이상 우태아 혈청 결핍 DMEM배지에서 배양한 후 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수추출물(100座/祉, 50eg/< 10陽/!泌)을 첨가하고 1시간 후 LPS(0山g/畝)를 처리하여, 6시간 동안 동시 배양하였다.
- 5speed로 5분간 shaking하고 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. BV2 microglial cell line의 형태학적인 변화는 BV2 microglial cell line(l xl05cells/24 wells plate)에 LPS(0.1/zg/ 畝), 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수추출물(10。您/双)을 처리하여, 6 시간과 72시간 동안 동시 배양하여 위상차현미경으로 관찰하였다.
- d). ICR mice were administered of CMT and PCMT orally or injected galanthamine and the acquisition training trial continued once a day for 21 days. The videotracking was initiated at 30 minutes after the injection of sg이3시amine intra peritoneal cavity.
- d). ICR mice were administered of CMT and PCMT orally or injected galanthamine and the ac이Jisiti이! tiaining trial continued once a day for 21 days. The videot「a아was initiated at 30 minutes after the injection ot scopolamine intra peritoneal cavity.
- 또한 聰明湯과 巴戟天聰明湯의 열수 추출물 및 초미세분말은 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 glucose를 증가시키고, uric acid를 감소시켰으며, AChE의 활성을 억제하였다. Morris water maze 실험에서 scopolamine으로 유도된 생쥐의 기억력감퇴를 개선시켰다.
- Real time quantitative PCRe Applied Biosystems 7500 Fast real-Time PCR system을 이용하여 수행하였다. 염증사이토카인 및 항염증사이토카인 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix(ABI)를 사용하였고, internal standard로 mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(G3PDH)를 사용하였고, primer의 최종농도가 200nM이 되게 반응시켰다.
- 2 畝을 첨가한다. acetylcholine chloride solution을 첨가한 후 시간을 정확히 기록하여 25℃ 수조에서 정확히 30분간 배양시킨 후 ELISA reader 420nm에서 홉광도를 측정하였다. 그 결과는 ZkA = ABLANK - ATEST 공식에 의하여 활성도를 측정하였다.
- mLFC 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 자란 것을 Trysin-EDTA 용액으로 단일 세포들이 되도록 떼어내고, 20시砰 개의 세포를 96 wells plate에 분주하고 배양기(37℃, 5% CO2)에서 2시간 배양한 후 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수추출물(최종 농도 20珈g/戒, 100/zg/50“g/M 10鶴/畝 1陽/畝)을 48시간 동안 처리하였다. BV2 microglial cell line(l><105 cells/24 wells plate)에 lipopolysaccharide(LPS)(0.
- 聰明湯 3첩 분량(108g)과 巴戟天聰明湯 3첩 분량(144g)에 증류수 1, 300圳을 가하여 열탕 추출기에서 3시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류장치로 농죽하고, 이를 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조하여 聰明湯 열수추출물 15.3g, 巴戟天聰明湯 열수추출물 23.1g을 얻었으며, 얻어진 열수 추출물을 냉동(-84C) 보관하면서 실험에 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.
- IL-6, TNFq NO, ROS의 생성을 관찰하였다. 또한 聰明湯 과 巴戟天聰明湯의 열수추출물 및 초미세분말을 시료로 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 glucose, uric acid, AChE의 변화를 관찰하였고 Morris water maze에서 생쥐의 행동 변화를 VIDEOTRACK으로 측정하였다. 먼저 정상 생쥐의 mLFC에서 聰明湯과 巴戟天聰明湯의 세포독성을 측정한 결과, 세포의 생존율은 대조군에 비해 聰明湯 5(加g/ M 100陽/1畝 20%g/i或 실험군과 巴戟天聰明湯 lO/zg/me 50以g/ M 100j7g/mt 200/2g/me 실험군에서 유의성 있게 감소하였으나, 실험군 모두에서 80% 이상으로 나타내었다(Fig.
- 협조하였으며, 白茯 神, 遠志, 石菖蒲, 巴戟天 적당량을 세척 건조한 후, Pin mill을 이용하여 직경 1mm내외로 조분쇄한 다음, Turbo mill에서 비터 (beater)회전속도 6, 75Wpm으로 분쇄하였다. 미분쇄된 시료를 공기분급 장치에서 분급휠 속도 (air classifying whe 이 speed; ACWS) 5,000~7, 50(kpm으로 공기 분급을 실시하였다. 입도분석은 한국콜마(주)(GMP 인증업체)에서 실시 .
- 처리한 후 371:에서 48시간 배양하였다. 배양 종료 후 DCFH-DA 50uM을 처리하고 5분간 배양하고 2회 수세한 후 flow cytometer로 세포 내 형광 ROS를 측정하였다.
- 。을 처리하고 1시간 후 LPS(0山g/畝)를 각각의 w이1에 첨가하여 48시간 배양하였다. 배양 종료 후 전체 배양아S 을 ZOOOrpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 회수한 후 여기에 Griess 시약 용액 A(0.2% naphthylethylene diamine dihydrochloride in D.W.)와 용액 B(2% sulfonylamide in 5% 氏μ이를 1:1 로 혼합하여 처리하였다. 다시 배양 상층액 10。应를 96 w이Is plate에 분주하고 혼합 용액 100成를 처리한 후 ELISA 龙ader를 사용하여 540皿에서 흡광도를 측정하였다.
- 6시간 후 DMEM 배양액으로 각 well을 세척한 후 새로운 배양액과 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수추출물(1。⑰g/n粉을 처리하고 48시간 동안 CO2 조직 배양기에서 배양하였다. 배양 종료 후 전체 배양액을 2000rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 회수하여 IL-1P, IL-6 및 TNF-a 생성량을 ELISA로 측정하였다. 각 well에 생쥐의 혈청 100以(1/100 dilution)씩 분주한 후 antibody cytokine-biotined conjugated 10(也。를 처리하고 2시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다.
- 본 실험에서 BV2 microglial cell line을 LPS를 처리한 후 각각 다른 농도의 聰明湯과 巴戟天聰明湯의 열수추출물(100俸/就, 50陽/畝, 10陽/成)을 투여한 후 6시간 배양하<여, IL-lft IL-6, TNF- 丄 NOS-n, COX-2, IL-10, TGF-이의 mRNA 발현을 관찰하였다.
- 1일 1회 학습 시 ICR계 생쥐 중 30 초 이내에 poW에서 platform으로 올라가는 생쥐를 선별하였다. 선별된 ICR 계 생쥐 10마리를 한 군으로 하여 대조군, galanthamine(3mg/ kgz i.p) 투여군, 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 열수 추출물(400fflg/kg p.o) 실험군 3리고 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 초미세 분말(400㎎/㎏ p.o) 실험군으로 분류하였고, 21일간 약물을 투여하면서 platform에 오르는 반복훈련을 실시하였다.
- 선별된 ICR계 생쥐에 1주일간 Morris water maze에서 1일 1회 반복학습을 실시하였다. Morris water maze란 직경이 90cm 이고 높이가 약 30cm인 수조로 수온이 2厂C인 수돗물을 2/3 정도 채우고, 그 안에 생쥐가 올라갈 수 있는 직경이 10cm인 원통형 platform을 설치한 수조이다.
- 세포독성측정방법은 SRB assay법纳을 약간 변형하여 실험에 사용하였다. mLFC 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 자란 것을 Trysin-EDTA 용액으로 단일 세포들이 되도록 떼어내고, 20시砰 개의 세포를 96 wells plate에 분주하고 배양기(37℃, 5% CO2)에서 2시간 배양한 후 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수추출물(최종 농도 20珈g/戒, 100/zg/50“g/M 10鶴/畝 1陽/畝)을 48시간 동안 처리하였다.
- Real time quantitative PCR의 조건은 94 ℃ 10분, 50 ℃ 2분에서 pre-denaturation 후, 95 ℃ 9초, 60 ℃ 1분을 40 cycles 수행하였다. 실험군과 대조군의 real time quantitative PCRe 다음과 같이 계산하여 illative quantitative(RQ)를 측정하였다.
- o) 실험군으로 나누고, 4주간 약물을 투여하였다. 약물 투여 22일째부터 scopolamine(l ㎎/㎏)을 7일간 1일 1회 복강 주사 후 심장천자법으로 혈액을 채혈하여 혈청을 분리하였다.
- 2시간 동안 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충 용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugated 100成를 처리하고 2시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. 여기에 TMB 기질을 100成씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100及의 stop 용액을 처리한 후 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 tot시 RNA 3傩 을 DNase I (10U/ id) 2U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5以 lOmM dNTPs mix, 项 random sequence hexanucleotides(25pmole/25 成), RNA inhibitor로서 1或 RNase inhibitor(20U/阀, 1 成 lOOmM DTT, 4.5成 5xRT buffer(250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375mM KC1, 15mM MgCb) 를 가한 후, 1 以의 M-MLV RT(200U/^)> 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20以가 되도록 하였다. 이 20以의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000rpm에서 5초간 원심 침강하여 37 ℃ heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNAS PCR에 사용하였다.
- 염증사이토카인 및 항염증사이토카인 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix(ABI)를 사용하였고, internal standard로 mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(G3PDH)를 사용하였고, primer의 최종농도가 200nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건은 94 ℃ 10분, 50 ℃ 2분에서 pre-denaturation 후, 95 ℃ 9초, 60 ℃ 1분을 40 cycles 수행하였다.
- 이에 저자는 聰明湯과 巴戟天聰明湯이 microglia 및 기억력감퇴 병태모델에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고, 열수 추출물과 초미세분말 제형에 따른 효과를 비교 검토하고자 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수추출물을 시료로 mLFC(mouse lung fibroblast c아Is)에서 세포독성을, BV2 microglial cell line(The immortalized murine BV2 cell line)에서 세포 생존율을 관찰하였고/ BV2 microglial cell line에서 IL~1, IL-6, TNF-az NOS-Ⅱ, COX-2, IL-10, TGF-侦1의 mRNA 발현과 BV2 microglial cell line 의 배양 상층액에서 IL-lpz IL-6, TNF-a, nitric oxide(NO), reactive oxygen species(ROS)의 생성을 관찰하였다. 또한 聰明湯 과 巴戟天聰明湯 열수추출물 및 초미세분말을 시료로 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐 모델의 혈청、내 glucose, uric acid, AChE의 변화를 관찰하였고 Morris water maze에서 생쥐의 행동 변화를 VIDEOTRACK으로 측정한 바 유의한 결과를 얻었으므로 이에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 聰明湯과 巴戟天聰明湯이 microglia 및 기억력감퇴 병태모델에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고, 열수 추출물과 초미세분말 제형에 따른 효과를 비교 검토하고자 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수추출물을 시료로 하여 mLFC에서 세포 독성을 관찰하고 BV2 microglial cell line에서 세포 생존율을 관찰하였다 LPS를 처리한 BV2 microglial cell line에서 proinflaminatory cytokineOJ IL-1, IL-6, TNF-a의 mRNA, NOS-U, COX-2의 mRNA와 anti-inflammatory cytokine인 IL-10, TGF-01의 mRNA 발현을 관찰하고, BV2 microglial cell line의 바양 상층액에서 IL-lpz IL-6, TNFq NO, ROS의 생성을 관찰하였다. 또한 聰明湯 과 巴戟天聰明湯의 열수추출물 및 초미세분말을 시료로 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 glucose, uric acid, AChE의 변화를 관찰하였고 Morris water maze에서 생쥐의 행동 변화를 VIDEOTRACK으로 측정하였다.
- 미분쇄된 시료를 공기분급 장치에서 분급휠 속도 (air classifying whe 이 speed; ACWS) 5,000~7, 50(kpm으로 공기 분급을 실시하였다. 입도분석은 한국콜마(주)(GMP 인증업체)에서 실시 . 협조하였다.
- 초미세 분말은 (주)허브월드에서 저〕작 . 협조하였으며, 白茯 神, 遠志, 石菖蒲, 巴戟天 적당량을 세척 건조한 후, Pin mill을 이용하여 직경 1mm내외로 조분쇄한 다음, Turbo mill에서 비터 (beater)회전속도 6, 75Wpm으로 분쇄하였다. 미분쇄된 시료를 공기분급 장치에서 분급휠 속도 (air classifying whe 이 speed; ACWS) 5,000~7, 50(kpm으로 공기 분급을 실시하였다.
- 훈련과 약둘 투여가 종료된 ICR계 생쥐에 scopolamine(lmg /kg)을 복강 주사하고 30분 후에 water maze에 ICR계 생쥐를 한 마리씩 넣고, VIDEOTRACK 으로 행동을 측정하고, 이를 videotrack software로 분석하였다.
대상 데이터
- Morris water maze란 직경이 90cm 이고 높이가 약 30cm인 수조로 수온이 2厂C인 수돗물을 2/3 정도 채우고, 그 안에 생쥐가 올라갈 수 있는 직경이 10cm인 원통형 platform을 설치한 수조이다. 1일 1회 학습 시 ICR계 생쥐 중 30 초 이내에 poW에서 platform으로 올라가는 생쥐를 선별하였다. 선별된 ICR 계 생쥐 10마리를 한 군으로 하여 대조군, galanthamine(3mg/ kgz i.
- BV2 microglial cell line(The immortalized murine BV2 cell line)는 Tong H. Joh(Burke Institute, Cornell University, NY, USA)으로부터 공급 받아 DMEM에 10% 우태아 혈청으토 배양히. 여 실험에 사용하였다.
- 사용하였으며/ Taq. polymerase 와 Deoxy nucleo tide triphosphate(dNTP)는 TaKaRa사(Japan) 제품을, 역전사효소 (Moloey Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase ; M-MLV RT)와 RNase inhibitor는 Promega사(USA) 제품을, RNAzolB는 Tel-Test사(USA) 제품을, 우태아혈청(fetal bovine serum)은 Hyclone사(USA) 제품을 그리고 Agarose는 FMC사 (USA) 제품을 사용하였고, 그 외 시약들은 특급 및 일급을 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 기기는 spectrophotometer(shimazue/ Japan), rotary vaccum evaporator(Biicht B-480z Switzerland), freeze dryer(EYELA FDU-540, Japan), centrifuge(sigma/ USA), bio-freezer(sanyoz Japan), Primus 96 thermocycler system(MWG Biote가i., Germany), plate shaker (Lab-Line, USA), ice-maker(비전과학, Korea), ELISA reader(molecular devices, USA), 및 homogenizerfOMNI, USA), automatic chemical analyzer(Express 550, Ciba-Corning Co., USA), VIDEOTRACK(Animal and human being behaviour analysis system, Viewpoint, France), phage contrast microscopy(Nikonz Japan), flow cytometer(Becton Dickinson, Co., USA), Pin mill (대성제약기제제작소, Korea), Turbo mill(air-flow type mill, ATM-100, 부성분체, Korea), 공기분급장치 (air classification system, ATM-100, 부성분처〕, Korea), Applied Biosystems 7500 Fast real-Time PCR system(Applied Biosystems, USA), 자동생화학 분석기 (Biochemical analyzer, Express 550) 등이다.
- 본 연구에 사용된 시약 중 Cholinesterase kit(420-MC), scopolamine, Tris~HCl, NaCl, Nonidet P-40, Ethyleneglycol-bis (p-aminoethyl ether), N, N, N'N-tetraacetic acid(EGTA), phenylmethylsulfonyl fluo ride(PMSF), DL-dithiothreitol(DTT)? leupetinz Diethyl pyrocarbonate(DEPC)z chloroforin, RPMI-1640 배양액, isopropanob ethidium bromide(EtBr)z Dulbecco's phosphate buffered saline(D-PBS)z formaldehyde, poly acrylamide, magnesium chloride(MgC12)은 Sigma사(USA) 제품을 사용하였으며/ Taq. polymerase 와 Deoxy nucleo tide triphosphate(dNTP)는 TaKaRa사(Japan) 제품을, 역전사효소 (Moloey Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase ; M-MLV RT)와 RNase inhibitor는 Promega사(USA) 제품을, RNAzolB는 Tel-Test사(USA) 제품을, 우태아혈청(fetal bovine serum)은 Hyclone사(USA) 제품을 그리고 Agarose는 FMC사 (USA) 제품을 사용하였고, 그 외 시약들은 특급 및 일급을 사용하였다.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 실온 22±2■以을 유지하고, 1일 중 12시간은 200~ 300Lux 로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 사료는 고형사료(조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 삼양사, Koi■昭)와 물을 충분히 공급하였다.
- 평균체중 약 24g 의 8주령 雌性 International Cancer Research(ICR)계 생쥐를 한국생명공학연구원에서 구입하여, 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 실온 22±2■以을 유지하고, 1일 중 12시간은 200~ 300Lux 로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다.
데이터처리
- After ICR mice w이e administered of CMT and PCMT orally or injected galanthamine, the injection of scopolamine(1㎎/㎏) continued once a day for 7 days. Data represent means土SE Statistically significant value compared sith coni「이 group by ANOVA test(*p<0.05).
- The videotracking was initiated at 30 minutes after the injection of sg이3시amine intra peritoneal cavity. Data represent means土SE Statistically significant v기ue compared with control group by ANOVA test(*<0.05).
- 기록하였다. 각 군의 유의성은 일원배치분산분석(ANOVA test)로 평가하였고, p<0.05 수준에서 Duncan test로 사후 검정하였다.
- 실험에서 얻은 결과는 mean±standard error로 기록하였다. 각 군의 유의성은 일원배치분산분석(ANOVA test)로 평가하였고, p<0.
이론/모형
- acetylcholine chloride solution을 첨가한 후 시간을 정확히 기록하여 25℃ 수조에서 정확히 30분간 배양시킨 후 ELISA reader 420nm에서 홉광도를 측정하였다. 그 결과는 ZkA = ABLANK - ATEST 공식에 의하여 활성도를 측정하였다.
성능/효과
- Ⅱ.-邱, IL-6, TNF-a의 mRNA와 COX-2Z NC&H의 mRNA의 발현이 억제되었고, anti-inflammatory cytokine인 IL-10, TGF-印의 mRNA 의 발현은 증가하였다(Fig. 3-9). 또한 BV2 microglial cell line의 배양 상층액에서 IL-邛, IL-6, TNF-q의 생산량을 측정한 결과, 모든 실험군에서 생산량이 다소 감소하였으나 유의성은 없었다 (Fig.
- BV2 microglial cell line에서 IL-10 유전자 mRNA 발현은 정상군 0.747(RQ), 聰明湯 100侧/畝, 50/zg/mt 10陽/威 실험군은 각각 1345(RQ), 1.140(RQ)z 0.985(RQ), 巴戟天W明湯 100//g/mt 50陽 /或 10)昭/砒 실험군은 각각 1.754(RQ), 1.414(RQ)Z L002(RQ)로 나타났다([Fig. 8]).
- BV2 microglial cell line에서 NOS-n mRNA 발현은 정상군 0.103(RQ)z 聰明湯 100俸/祝, 50馋/戒, 10陽/畝 실험군은 각각 0.623(RQ), 0.744(RQ)z 0.865(RQ)/ 巴戟天聰明湯 10%g/M 50/zg/ mt 10/zg/me 실험군은 각각 0.465(RQ), 0.768(RQ), 0.985(RQ)로 나타났다([Fig. 7]).
- BV2 microglial cell line에서 생존율을 측정한 결과, 대조군 523+5.8(%), 聰明湯 실험군 87.7±1.9(%), 巴戟天聰明湯 실험군 8L3±Z3(%)로 나타나 대조군에 비해 聰明湯과 巴戟天聰明湯 실험군 모두 유의성 있게 높았다([Fig. 2B]).
- Scopolamine으로 유도된 기억력감퇴 생쥐의 혈청 내 glucose는 巴戟天聰明湯 열수 추출물과 초미세분말 실험군에서 유의성 있게 증가하였고, uric acid는 聰明湯의 열수추출물과 초미세분말 실험군, 巴戟天聰明 湯 초미세분말 실험군에서 유의성 있게 감소하였으며, AChE 활성은 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 열수추출물과 초미세분말 실험군에서 유의성 있게 억제되었다. Morris water maze> 통한 stop-through latency측정을 관찰한 결과 聰明湯 및 巴戟天聰明 湯의 열수추출물과 초미세분말 실험군에서 유의성 있는 기억력개선 효과가 나타났다.
- 13). ROS의 생성은 대조군에 비해 巴戟天聰明湯 실험군에서 모두 감소하였다(Fig. 14). 이로써 聰明湯과 巴戟天聰明 湯이 산화적 손상을 유발하는 NO, ROS의 생성을 억제함으로써 AD의 예방에 활용될 수 있음을 알 수 있다
- Scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐모델의 Morris water maze 실험을 통한 기억력 감퇴 억제 효과를 분석한 결과, stop-through latency는 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의성 있게 단축되었으나, 聰明湯과 巴戟天聰明湯 실험군, 열수 추출물과 초미세분말 실험군 간의 유의한 차이는 없었다(Fig. 18). Distance movement-through latency를 관찰한 결과, 대조군에 비해 모든 실험군에서 다소 거리의 단축을 보였으나 유의성 있는 차이는 보이지 않았다(Fig.
- -6, TNF-a, NO, ROS의 생산량을 감소시켰다. Scopolamine으로 유도된 기억력감퇴 생쥐의 혈청 내 glucose는 巴戟天聰明湯 열수 추출물과 초미세분말 실험군에서 유의성 있게 증가하였고, uric acid는 聰明湯의 열수추출물과 초미세분말 실험군, 巴戟天聰明 湯 초미세분말 실험군에서 유의성 있게 감소하였으며, AChE 활성은 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 열수추출물과 초미세분말 실험군에서 유의성 있게 억제되었다. Morris water maze> 통한 stop-through latency측정을 관찰한 결과 聰明湯 및 巴戟天聰明 湯의 열수추출물과 초미세분말 실험군에서 유의성 있는 기억력개선 효과가 나타났다.
- Stop-through latency를 관찰한 결과, 대조군이 66.5±5.9(sec), galanthamine 투여군이 10.8±2.4(sec), 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 열수 추출물 실험군이 각각 31.7±3.4(sec)z 46.1±10.0(sec) 그리고 聰明 湯 및 巴戟天聰明湯 초미세분말 실험군은 각각 25.2±11.9(sec)/ 29.5±9.0(sec)로 나타나 대조군에 비해 galanthamine 투여군과 모든 실험군에서 유의하게 단축되었으며, 각 실험군 간 유의한 차이는 없었다([Fig. 18]).
- 聰明湯 및 巴戟天聰明湯의 세포독성을 측정한 결과, mLFC 의 생존율에서는 대조군에 비해 聰明湯 50俸/叫, 100/zg/m«, 200 /zg/m« 실험군은 각각 93.1±1.8(%), 90.6+16(%), 88.1±1.7(%)로 대조군에 비해 감소되었으며, 巴戟天聰明湯 10/zg/mt 5(加g/碱, 100 /zg/uit 200/zg/m« 실험군은 각각 95.6±0.7(%), 91.3±0.6(%), 85.6±1.0(%), 81.5±1.4(%)로 대조군에 비해 감소되었으나, 실험군 모두에서 80% 이상의 생존율을 나타내었다([Fig. 1]).
- 3-9). 또한 BV2 microglial cell line의 배양 상층액에서 IL-邛, IL-6, TNF-q의 생산량을 측정한 결과, 모든 실험군에서 생산량이 다소 감소하였으나 유의성은 없었다 (Fig. 10-12).
- 1). 또한 LPS를 처리한 BV2 microglial cell line의 세포 생존율을 측정한 결과, 聰明湯과 巴戟天聰明湯 실험군 모두 대조군에 비해 유의성 있게 증가하였다([Fig. 2B]).
- 발현을 증가시켰다. 또한 聰明湯과 巴戟天聰明湯의 열수 추출물 및 초미세분말은 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 glucose를 증가시키고, uric acid를 감소시켰으며, AChE의 활성을 억제하였다. Morris water maze 실험에서 scopolamine으로 유도된 생쥐의 기억력감퇴를 개선시켰다.
- 또한 열수추출물 및 초미세분말을 비교하면 scop이amine으로 유도된 기억력감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 glucose의 증가, uric acid의 감소, AChE의 활성 억제 효과 그리고 Morris water maze 실험을 통한 stop-through latency 측정에서의 기억력감퇴 개선 효과에 있어 유의한 차이는 없었다.
- 또한, scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 AChE의 활성은 대조군에 비해 모든 실험군에서 유의하게감소되었으나 실험군 간의 유의한 차이는 없었다(Fig. 17). 이로써 聰明湯과 巴戟天聰明湯의 열수추출물 및 초미세분말이 AChE 을 억제하고 acetylcholine을 활성화시킴으로써 기억력 감퇴를개선시키리라 판단된다.
- 또한 聰明湯 과 巴戟天聰明湯의 열수추출물 및 초미세분말을 시료로 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 glucose, uric acid, AChE의 변화를 관찰하였고 Morris water maze에서 생쥐의 행동 변화를 VIDEOTRACK으로 측정하였다. 먼저 정상 생쥐의 mLFC에서 聰明湯과 巴戟天聰明湯의 세포독성을 측정한 결과, 세포의 생존율은 대조군에 비해 聰明湯 5(加g/ M 100陽/1畝 20%g/i或 실험군과 巴戟天聰明湯 lO/zg/me 50以g/ M 100j7g/mt 200/2g/me 실험군에서 유의성 있게 감소하였으나, 실험군 모두에서 80% 이상으로 나타내었다(Fig. 1). 또한 LPS를 처리한 BV2 microglial cell line의 세포 생존율을 측정한 결과, 聰明湯과 巴戟天聰明湯 실험군 모두 대조군에 비해 유의성 있게 증가하였다([Fig.
- 본 실험에서 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 glucose의 변화를 측정한 결과, 대조군에 비해 巴 戟天聰明湯 열수추출물과 초미세분말 실험군에서 유의하게 증가하였으나 열수주출물과 초미세분말 실험군 간의 유의한 차이는 없었다([Fig. 15]). 혈청 내 uric acid는 대조군에 비해 聰明湯 열수 추출물과 초미세분말 그리고 巴戟天聰明湯 초미세분말 실험군에서 유의성 있게 감소하였으나 이들 실험군 간의 유의한 차이는 없었다 ([Fig.
- 본 실험에서 聰明湯과 巴戟天聰明湯의 효과를 비교하여 보면, BV2 microglial cell line에서 proinflammatory cytokine mRNA 발현의 억제와 anti-inflammatory cytokine mRNA 발현의 증가, proinflammatory cytokine 및 NO 생성량의 감소 및 scopolamine으로 유도된 기억력감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 glucose의 증가, uric acid의 감소, AChE의 활성 억제 효과 그리고 Morris water maze 실험을 통한 stop-through latency 측정에서의 기억력감퇴 개선 효과에 대해 두 실험군 간 유의한 차이는 없었다. 또한 열수추출물 및 초미세분말을 비교하면 scop이amine으로 유도된 기억력감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 glucose의 증가, uric acid의 감소, AChE의 활성 억제 효과 그리고 Morris water maze 실험을 통한 stop-through latency 측정에서의 기억력감퇴 개선 효과에 있어 유의한 차이는 없었다.
- 이러한 결과로 상기의 농도에서 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수 추출물은 정상세포에 대한 세포독성을 나타내지 않으며, AD 병태에서 나타나는 세포 사멸을 억제하는 효과가 있다고 판단된다.
- 이러한 관점에서 BV2 microglial cell line 배양상층액의 NO 와 ROS의 생성을 관찰한 결과, NO의 생성량은 대조군에 비해 모든 실험군에서 다소 감소하였으나 유의성 있는 차이는 보이지 않았다(Fig. 13). ROS의 생성은 대조군에 비해 巴戟天聰明湯 실험군에서 모두 감소하였다(Fig.
- 이상의 내용을 총괄해 보면 聰明湯과 巴戟天聰明湯 열수 추출물은 BV2 microglial cell line에서 proinflammatory cytokine 인 IL-lft IL-6, TNF-a mRNA와 NOS-μ, COX-2 mRNA의 발현을 억제하고 anti-inflammatory cytokine 인 IL-10, TGF-pl mRNA 발현을 증가시켰다. 또한 聰明湯과 巴戟天聰明湯의 열수 추출물 및 초미세분말은 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐 모델의 혈청 내 glucose를 증가시키고, uric acid를 감소시켰으며, AChE의 활성을 억제하였다.
- 19). 이상의 실험결과를 살펴볼 때, 기억력감퇴에 대한 치료제로써 聰明湯 및 巴戟天聰明湯을 활용할 수 있다고 판단된다.
- 혈청 내 glucose는 정상군이 127.8±3.7(mg/我)이었고, 대조군이 112.8±9.3(nig/d-C)/ galanthamine 투여군이 88.7±5.5(mg/dE), 聰 明湯 및 巴戟天聰明湯 열수추출물 실험군이 각각 123.6±12.1(mg/ 我), 162.7±15.3(mg/d£) 그리고 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 초미세 분말 실험군이 각각 120.8±8.6(nig/dQz 161.8±4.9(哩/我)로 나타나 대조군에 비해 巴戟天聰明湯 열수추출물 및 초미세분말을 투여한 실험군에서 유의하게 증가하였으며 실험군 간 유의한 차이는 없었다 ([Fig. 15]).
- 혈청 내 uric acid는 정상군이 2.6±0.7(哩/曲), 대조군이 7.1±0.4(mg/ de)z galanthamine 투여군이 2.5±0.4(mg/双), 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 열수추출물 실험군이 각각 5.3±0.3(ing/我), 6.4±0.3(mg/dC) 그리고 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 초미세분말 실험군이 각각 5.0±0.3価/我), 4.9±0.4(眼/我)로 나타나 대조군에 비해 galanthamine 투여군, 聰明湯 열수추출물 및 초미세분말 실험군과 巴戟天聰明湯 초미세분말 실험군에서 유의하게 감소하였으며, 실험군 간 유의한 차이는 없었다([Fig. 16]).
- 혈청 중 AChE 활성도는 정상군이 25.3±5.4(U/ni。), 대조군이 100.0±7.6(U/m£)/ galanthamine 투여군이 36.7±7.2(U/戒), 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 열수추출물 실험군이 각각 69.0±9.3(U/做), 49.7±6.4(U/i也) 그리고 聰明湯 및 巴戟天聰明湯 초미세분말 실험군이 각각 54.3±6.5(U/m£), 53.3±3.7(U/mQ로 나타나 galanthamine 투여군과 모든 실험군에서 유의하게 감소하였으며, 실험군 간 유의한 차이는 없었다([Fig. 17]).
후속연구
- 결과적으로 聰明湯 및 巴戟天聰明湯은 microglial cell의 proinflammatory cytokines의 과잉 발현, 산화적 스트레스 등으로 인해 야기될 수 있는 AD오kholine성 신경세포의 퇴화에 의해 야기되는 기억력 감퇴에 대한 예방과 치료제로 활용될 수 있을 것으로 판단되며, 향후 초미세분말의 정확한 기전과 치매에 대한 임상적 활용에 대한 연구, 새로운 제형의 개발 등이 지속적으로이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이는 聰明湯 및 巴戟天聰明湯이 AD의 원인 중 하나로 알려진 세포내에서의 염증반응과 관련된 cytokine의 활성화를 억제한 것으로, 聰明湯 및 巴戟天聰明湯의 투여를 통해 과잉 생산된 proinflammatory cytokines으로 초래되는 신경세포 사멸을 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
- 14). 이로써 聰明湯과 巴戟天聰明 湯이 산화적 손상을 유발하는 NO, ROS의 생성을 억제함으로써 AD의 예방에 활용될 수 있음을 알 수 있다
- 17). 이로써 聰明湯과 巴戟天聰明湯의 열수추출물 및 초미세분말이 AChE 을 억제하고 acetylcholine을 활성화시킴으로써 기억력 감퇴를개선시키리라 판단된다.
- 이상의 결과로 미루어 보아聰明湯 및 巴戟天聰明湯의 열수 추출물 및 초미세분말은 AD의 예방과 치료에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 18). 초미세 분말은 약재를 수십㎛로 분쇄하여 분말로 만든 것으로, 제형개발에 초미세 분말이 도입, 응용되어 약물의 흡수성, 안정성, 편리성 등에서 기존 제형에 비해 우수한 효과를 보였다는 연구坷성과로 볼 때, 한약의 초미세 분말 제형에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 辛, 微溫 無 毒하며 補腎陽의 효능이 있어28), 脾腎虧虛型 치매에 응용할 수 있을 것으로 판단된다. 특히 木槿皮聰明湯, 山査聰明湯의 AD 치료와 예방효과에 대한 연구泌)와 金 등7)의 치매병태모델에 대한 巴戟天의효능 연구의 결과를 볼 때 聰明湯에 巴戟天를 加한 巴戟天聰明湯 역시 치매의 치료 및 예방에 활용할 수 있을 것으로 판단된다.
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