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문제 정의
- 우리나라 전국 산지에서 쉽게 구할 수 있는 노루발풀을 건조 시 켜 80% ethanol 추출물과 여러가지 용매 분획물의 미생물 증식 억제 효과에 대해서 검색하였다. 노루발풀의 80% ethanol 추출물은 그람 양성균 B.
제안 방법
- 획하여 silica g시 chromatography, preparative thin-layer chromatography (prep. TLC), high performance liquid chromatography (HPLC)로 항균활성 물질을 분리하였다.
- 항균실험에 사용한 균주는 식품을 변질시키는 균으로 알려진 대표적인 그람 양성균 B. subtilise 오염의 지표 균이면서 부패세균인 그람 음성균 Escherichia coli를 사용하여 활성을 측정하였다. 균의 생육 배지로는 두 균주 모두에 대하여 nutrient broth를 사용하여 37℃ incubator에서 9~10시간 배양하였다.
- , Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 80% ethanol 추출물을 얻었다. Ethanol 추출물은 서로 극성을 달리하여 hexane, diethyl ether, ethyl acetate로 순차적으로 용매분획 하였다. 즉, hexane과 물을 같은 비율로 하여 분획여두에서 hexane 층을 분획하고, 동일한 방법으로 남은 수용액 층에 diethyl ether, ethyl acetate, 물 층으로 분획하여 각각의 용매 분획물을 얻었다(Fig.
- Ethanol 추출물은 서로 극성을 달리하여 hexane, diethyl ether, ethyl acetate로 순차적으로 용매분획 하였다. 즉, hexane과 물을 같은 비율로 하여 분획여두에서 hexane 층을 분획하고, 동일한 방법으로 남은 수용액 층에 diethyl ether, ethyl acetate, 물 층으로 분획하여 각각의 용매 분획물을 얻었다(Fig. 1). 각 분획물의 항균 활성을 확인하고, 활성 분획물은 감압 농축하여 적당한 농도로 희석해서 사용하였다.
- 1). 각 분획물의 항균 활성을 확인하고, 활성 분획물은 감압 농축하여 적당한 농도로 희석해서 사용하였다.
- 항균활성 시험용 평판배지의 조제는 nutrient agar배지를 멸균하여 적절하게 식힌 후 상기 배양액 1%를 혼합하여 petridish에 분주하여 응고시킨 후 사용하였다. 80% ethanol 추출물 및 각 용매 분획물을 각각 10 yg/disc, 20 pg/disc, 30 yg/disc, 40 yg/disc, 50 pg/disc 씩 paper disc (8 mm, Advantec)에 천천히 흡수시켜 완전히 말린 후 배지 위에 밀착되도록 올린 다음 37℃ incubator에서 overnight 시킨 후 paper disc 주변의 생육저해환의 직경 (mm)을 통해 활성을 측정하였다.
- 노루발풀의 80% ethanol 추출물로부터 얻은 분획물들의 항균 활성을 측정 비교한 후, 활성을 나타낸 hexane 분획물로부터 유효성분을 검색할 목적으로 silica gel chromatography를 실시하였다. 즉, hexane 분획물 1 g을 얻은 후, silica gel이 충전된 컬럼에 넣어 CHC13:MeOH=50:l의 전개용매를 이용하여 column chromatography를 실시하여 100개의 fraction을 얻었다(Fig.
- 활성 층으로부터 prep. TLC를 실시 하기 위해 silica gel TLC plate (20 cm x 20 cm x 0.5 cm, Merck)에 시료를 loading하여 hexane:ethyl acetate = 4:1 용매로 전개 시켜 10개의 소분획으로 나누었고, 이 중 항균력이 우수한 fraction No. 3를 단일분리하기 위해 Table 1의 조건으로 HPLC 분석을 실시하였다.
- Hexane 분획물을 silica 옹el column chromatography를 실시하여 100개의 분획을 얻을 수 있었다(Fig. 2). Silica gel column chromatography> 통해 획득된 100개의 분획물을 다시 analytical TLC를 실시하여 5개의 분획물 그룹으로 나누어 활성을 확인한 결과 No.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 노루발풀은 2005년 9월, 양산시 서창지역에서 채취하여 가볍게 수세한 뒤 물기를 제거하고, 건조시킨 후 상온에서 보관하여 시료로 사용하였다. 시료 추출용 유기용매는 99%이상의 1급 시약(Daejung Chemical, Ltd, Korea)으로 ethanol, hexane, diethyl ether, ethyl acetate 등을 사용하였고, HPLC 분석용매는 Baker사(USA)의 특급용매를 사용하였다.
- 후 상온에서 보관하여 시료로 사용하였다. 시료 추출용 유기용매는 99%이상의 1급 시약(Daejung Chemical, Ltd, Korea)으로 ethanol, hexane, diethyl ether, ethyl acetate 등을 사용하였고, HPLC 분석용매는 Baker사(USA)의 특급용매를 사용하였다.
이론/모형
- 본 실험에서는 노루발풀의 추출물과 각 분획물의 항균활성을 확인하기 위해서 paper disc diffusion assay 방법[기을사용하였다. 평판배지에 배양된 각각의 균주를 1 백금이 취하여 nutrient broth 배지에 접종하고, 37℃의 incubator에서 9~10시간 동안 배양하여 사용하였다.
성능/효과
- cM에서는 활성이 나타나지 않았다. 노루발풀의 80% ethanol 추출물을 용매 분획하여 얻은 분획물 중 hexane층에서 항균활성이 나타나는 것을 확인하였다. 노루발풀의 항균활성 물질을 검색하기 위한 목적으로 hexane 분획물을 silica gel column chromatography, prep.
- 이용하여 실험한 결과는 Table 2와 같다. 즉, 80% ethanol 추출물의 2종의 식품 부패균에 대한 항균효과 측정 결과 그람 음성균 E. coll 에서는 활성이 나타나지 않은 반면 그람 양성균 B. subtils에 대해서는 항균활성을 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 이는 노루발풀의 methanol과 ethyl acetate 추출물에서도 그람 양성균에 대해서 활성을 보였던 연구 [4] 와 유사한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 이는 노루발풀의 methanol과 ethyl acetate 추출물에서도 그람 양성균에 대해서 활성을 보였던 연구 [4] 와 유사한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 노루발 풀의 그람 양성균에 대한 항균활성은 추출물의 농도가 증가할 수록 항균활성을 나타내는 생육억제환이 증가하는 것으로 보아 항균활성이 증가하는 것을 보여 주고/ 이는 주줄물의 항균활성은 추출물의 농도에 의존적으로 증가한다는 것을 시사한다.
- 2). Silica gel column chromatography> 통해 획득된 100개의 분획물을 다시 analytical TLC를 실시하여 5개의 분획물 그룹으로 나누어 활성을 확인한 결과 No. 18~40까지의 fraction에서 강한 항균활성을 확인할 수 있었다(Table 4). 항균활성이 높은 No.
- TLC를 실시하여 10개의 소분획물로 다시 분리하였다. 획득된 10개의 분획물에 대해서 항균활성을 확인한 결과 No. 1에서 No. 5까지의 분획물에서는 항균활성을 나타내었으며 특히 No. 3의 분획물에서는 강한 저지능을 보였다. 그렇지만 No.
- 노루발풀의 80% ethanol 추출물로부터 여러가지 용매별로 계통 분획하여 획득한 분획물 중 항균활성을 나타낸 hexane 분획물로부터 silica gel column chromatography와 preparative TLC를 실시하여 획득한 10개의 분획물 중에서 항균 활성을 보인 No. 1에서 No. 5까지의 분획물의 유효성분을 알아보기 위하여 HPLC를 통해 단일 분리한 결과 retention time이 9분과 13분대인 두 개의 peak를 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이렇게 나타난 두 peak 중 노루발풀의 B.
- 3). 이렇게 나타난 두 peak 중 노루발풀의 B. sub-subtils에 대한 항균활성을 나타내는 물질을 선별하기 위해서 preparative HPLC를 통해 획득된 두 peak의 분획물에 대해 항균성을 실험해본 결과 peak I 에서 항균활성을 보이는 것으로 보아 peak I 의 단일물질이 노루발풀의 B. subtils에 대한 항균활성을 나타내는 물질임을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 노루발풀의 항균활성 물질을 검색하기 위한 목적으로 hexane 분획물을 silica gel column chromatography, prep. TLC 및 HPLC> 실시하였으며 그 결과, peak I 의 단일 물질이 노루발풀의 B. subtils에 대한 항균 활성을 나타내는 물질임을 확인할 수 있었다.
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