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문제 정의
- 본 실험을 통하여 얻어진 positive clone들은 주로 내부에 존재하는 exon의 유무를 조사하여 목적 유전자의 분리 가능성 여부를 확인하였다. 이 전의 연구에서 hHPRT radial TAR vector를 통하여 얻어진 클론에 대하여 분리된 YAC DNA의 크기가 다양하게 나타나, A/u-Universal hook을 사용한 경우 다양한 크기의 클론이 분리될 수 있음이 보고되었다 [8].
- 본 연구는 서로 다른 종에서 orthologue인 특정 유전자를 분리하고자 할 때, 한유전체의 게놈 정보를 지닌 target hook을 다른 종에서도 상호 적용될 수 있는가에 대하여 조사하였다. 먼저 인간의 hHPRT (human hypoxanthine phos phoribosyltransferase) 유전자 cloning에 사용된 hook을 마우스에 사용하여 마우스 mHPRT 유전자를 분리를 시도하였고, 반대로 마우스의 게놈 정보로 만들어진 target hook을 인간의 hHPRT 유전자 분리에 사용하였다.
- 이 기술은 출아효모의 spheroplasts 형질전환 동안 목적 유전자를 포함한 게놈 DNA와 그 유전자의 5'또는 3'말단 서열 (hook)을 포함하고 있는 TAR vector 사이에 일어나는 상동성재조합에 의해 이루어진다. 본 연구에서는 TAR cloning 법을 상동성 유전자의 분리에 사용할 수 있는가를 조사하기 위해, 인간과 마우스 게놈의 HPRT 유전자를 선택하였다. 그 결과, 인간과 마우스의 게놈으로부터의 HPRT 유전자의 분리빈도는 TAR vector로서 hHPRT hook 혹은 mHPRT hook을 사용한 경우에 거의 동일하게 나타났다.
- 부위를 선별적 분리를 가능하게 한다. 이 방법은 목적으로 하는 염색체 부위의 주변에 존재하는 비교적 짧은 게놈 염기서열에 대한정보를 필요로 한다. 이 기술은 출아효모의 spheroplasts 형질전환 동안 목적 유전자를 포함한 게놈 DNA와 그 유전자의 5'또는 3'말단 서열 (hook)을 포함하고 있는 TAR vector 사이에 일어나는 상동성재조합에 의해 이루어진다.
- 또한 이 방법에 의해 cloning된 마우스의 HPRT (Hprtl)를 사용하여, 유전체 사업을 통해 염기서열이 결정되지 않고 gap으로 남아 있던 부분의 염기서열을 결정하였다. 이 연구를 통해 비교 유전체 연구에 이용될 수 있는 새로운 TAR cloning 기술의 도입 가능성과 DNA 염 기서 열 결정에 대한 문제를 지닌 영역의 특성에 대해 논의하고자 한다.
제안 방법
- 이러한 확인 후 각 클론의 DNA를 분리하여 HPRT gene의 나머지 모든 exon 영역에 대해 PCR을 수행하였다(Table 2). PCR 반응은 9700 Thermocycler (Perkin-Elmer)를 사용하여 94°C, 2 분간 1 cycle, 그리고 94"C, 30초-t 58°C, 30초— 68°C, 1분의 반응을 30 cycles 반응시킨 후, 72C에서 10분 1 cycle의 연장 반응을 수행하였다. PCR 산물은 2%의 SeaKem GTG agarose gel을 사용하여 전기영동을 통하여 확인하였다(Fig.
- (B) Construction for isolation of the HPRT gene as a series of circular YACs using a TAR cloning vector containing 3’-HPRT sequence and an Alu/Bl repeat. A set of TAR vectors with targeting sequences of homologous to the 3’-end of HPRT gene (93 bp from human or 96 bp from mouse) was constructed. Each vector contains a 182 bp Alu repeat or 130 bp Bl repeat as a second targeting sequence.
- PCR 반응은 9700 Thermocycler (Perkin-Elmer)를 사용하여 94°C, 2 분간 1 cycle, 그리고 94"C, 30초-t 58°C, 30초— 68°C, 1분의 반응을 30 cycles 반응시킨 후, 72C에서 10분 1 cycle의 연장 반응을 수행하였다. PCR 산물은 2%의 SeaKem GTG agarose gel을 사용하여 전기영동을 통하여 확인하였다(Fig. 2).
- TAR cloning 버이 비교 유전체 연구에 유용한가를 확인하기 위하여, 플라스미드 모델이 아닌 유전체 내에 존재하는 single-copy 유전자를 선별하였다. 본 실험에 사용된 인간 및 마우스의 HPRT 유전자는 유전체 프로젝트에 의해 Canis fa miliarise), Rattus nomegicus(시궁쥐), Gallus gallus(오골계), Caenorhabditis Megms(꼬마선충), Plasmodium falciparum 3D7(말라리아)에서 상동성 유전자가 분리되어 그 염기서열이 결정되었다(http://www.
- TAR cloning에 사용되는 기본 TAR vector^ pVC604 vector 에 제한효소 인식 자리인 Multi-cloning site 에 3z-unique hook으로 사용될 DNA 단편을 PCR로 증폭하여 BamHl-Xbal 자리에 삽입하였다. 본 실험에 사용된 TAR vector 4종류는 모두 radial vector로서 인간의 hHPRT 유전자 혹은 마우스의 mHPRT의 3'염기서열을 지닌 3'-hook으로 삽입되 었다 (Fig.
- 2A). mHPRT+Bl^ 삽입된 TAR vector를 사용하여 얻은 8개 클론 중 4개 클론 ;lane 1-4, Fig. 2B)과 hHPRT+Bl^r 사용하여 얻은 7개 클론 중 4개(lane 5-8, Fig. 2B)를 사용하여 삽입된 크기를 먼저 조사하였다. Fig.
- 각클론에 삽입된 게놈 DNA의 크기는 mHPRT 특이적인 exon9 영역을 probe로 사용하여 southern blot- ting21]하여 확인하였다 (Fig. 2).
- 이렇게 높은 수치의 상동성을 보여주는 유전자들은 HPRT 유전자와 같이 생물체의 기능에 필수적으로 매우 중요한 기능을 갖는 것들로서, 서로 다른 이종간의 유전체에서도 매우 높은 비율로 보존되어 있으리라 사료된다. 그러므로 이 HPRT 유전자를 모델로 인간과 마우스게놈에서 상호의 염기서열을 사용하여 유전자의 분리빈도를 조사하여, orthologue 유전자의 분리빈도를 조사하였다.
- 각 TAR vector를 사용하여 얻은 형질전환체 수는 plate 당 약 400개로 vector 간의 형질전환빈도의 차이는 크게 나타나지 않았다. 네 종류의 vector를 이용하여 얻어진 형질전환 체 중 각각 2, 500〜 3, 900개의 형질전환체에 대하여, 각 exon 영역의 primer (Table 2)를 이용하여 각각의 positive clone을 확인하였다.
- lz Table 1). 또한 5Z-Universal hook으로는 인간 게놈에서 사용될 때는 Alu 반복 서열을 사용하였고, 마우스 게놈을 사용할 경우에는 B1 반복 서열을 사용하여 Apal-Xhol 자리에 삽입하였다 (Fig. lz Table 1). 이렇게 만들어진 TAR vectoi를 TAR cloning에 사용할 때는 이들 vector 를 제한효소 EcoRL으로 처리하여 직선상의 vector^ 만들어 사용하였다.
- 그 결과, 인간과 마우스의 게놈으로부터의 HPRT 유전자의 분리빈도는 TAR vector로서 hHPRT hook 혹은 mHPRT hook을 사용한 경우에 거의 동일하게 나타났다. 또한 mHPRT 유전자의 gap 부분의 염기서열을 결정하여, 이 부분에 염기서열의 불안정의 요인이 되는 비정상적 특성을 발견하였다. 결론적으로 TAR cloning법을 이용하여 다른 이종간의 게놈으로부터 상 동성 유전자 즉 orthologue의 분리가 가능하였다.
- 그 결과, 이종 간의 hook과 동종의 hook을 사용한 경우에서 각각 유사한 clon ing 빈도를 나타내 었다. 또한 이 방법에 의해 cloning된 마우스의 HPRT (Hprtl)를 사용하여, 유전체 사업을 통해 염기서열이 결정되지 않고 gap으로 남아 있던 부분의 염기서열을 결정하였다. 이 연구를 통해 비교 유전체 연구에 이용될 수 있는 새로운 TAR cloning 기술의 도입 가능성과 DNA 염 기서 열 결정에 대한 문제를 지닌 영역의 특성에 대해 논의하고자 한다.
- 먼저 인간의 hHPRT (human hypoxanthine phos phoribosyltransferase) 유전자 cloning에 사용된 hook을 마우스에 사용하여 마우스 mHPRT 유전자를 분리를 시도하였고, 반대로 마우스의 게놈 정보로 만들어진 target hook을 인간의 hHPRT 유전자 분리에 사용하였다. 그 결과, 이종 간의 hook과 동종의 hook을 사용한 경우에서 각각 유사한 clon ing 빈도를 나타내 었다.
- 본 실험에서는 마우스의 Bl-Universal hook을 이용한 것으로 이에 대한 확인을 수행하였다 (Fig. 2A). mHPRT+Bl^ 삽입된 TAR vector를 사용하여 얻은 8개 클론 중 4개 클론 ;lane 1-4, Fig.
- 본 실험에서는 먼저 TAR vector의 구축을 위하여 sin- 임e-copy 유전자인 HPRT를 이용하여 96 bp의 마우스 유래의 3Z-Unique hook과 인간 유래의 93 bp의 3, -Unique hook 을 각각 제작하였다 (Fig. 1, Table 1).네 종류의 TAR vector 중 J1HPRT+/Alu와 mHPRT+Ahi는 인간 hHPRT 유전자를 분리하는데 사용하였고, hHPRT+Bl과 mHPRT+Bl는 마우스 mHPRT 유전자를 분리하는 데 사용하였다.
- 본 실험을 통해 인간 및 마우스의 게놈에서 분리한 pos itive 클론의 크기를 조사하기 위하여, PCR 방법으로 pos itives 확인된 효모의 형질전환체로부터 YAC DNA를 분리하예1* 6 No fl 효소로 처리한 후 CH EF gel electrophoresis 를수행하였다. 각클론에 삽입된 게놈 DNA의 크기는 mHPRT 특이적인 exon9 영역을 probe로 사용하여 southern blot- ting21]하여 확인하였다 (Fig.
- 20T)와 40 ㎕의 14 M p-mercapto어:hano"을넣고 잘 섞은 후, 30E에서 약 20분간 50 rpm 이하로 매우 느리게 진탕배양하였다. 세포의 spheroplasts 정도를 조사하기 위해 현탁액을 1 M sorbitol과 2% SDS에 1/10로 넣어 O.D6oo 값을 측정하여 1 M sorbitol/2% SDS 값이 3〜5 배가되도록 하였다. Zymolyase 처리가 끝난 세포를 1500 rpm, 4°C에서 5분간 원심분리하여 집균한 뒤 p-mercaptoethanol 의 제거를 위해 1 M sorbitol로 두 번 씻어주었다.
- positive 확인용 PCR에 이용된 영역은 사용한 TAR vector에는 존재하지 않으나, 재조합에 의해 hHPRT 유전자의 양말 단가 연결되어 분리된다면 그 내부에 존재할 hHPRT 유전자의 cxon9 부분에 해당한다(Table 2).이 primary gene pool을 이용하여 먼저 PCR로 클론이 되었는지를 확인한 후, positive PCR 밴드가 확인되면 이로부터 각각의 colony를 사용하여 두 번째 colony PCR을 수행하여 확인하였다. 이러한 확인 후 각 클론의 DNA를 분리하여 HPRT gene의 나머지 모든 exon 영역에 대해 PCR을 수행하였다(Table 2).
- 이 primary gene pool을 이용하여 먼저 PCR로 클론이 되었는지를 확인한 후, positive PCR 밴드가 확인되면 이로부터 각각의 colony를 사용하여 두 번째 colony PCR을 수행하여 확인하였다. 이러한 확인 후 각 클론의 DNA를 분리하여 HPRT gene의 나머지 모든 exon 영역에 대해 PCR을 수행하였다(Table 2). PCR 반응은 9700 Thermocycler (Perkin-Elmer)를 사용하여 94°C, 2 분간 1 cycle, 그리고 94"C, 30초-t 58°C, 30초— 68°C, 1분의 반응을 30 cycles 반응시킨 후, 72C에서 10분 1 cycle의 연장 반응을 수행하였다.
- 3 영역에서 두 개의 염기서열이 결정되지 않은 작은 Gap을 확인하였다(mouse hprt public, gi20983873; NM_013556 range=chrX:39557221-39590617 Public). 이에 대해 본 실험에서 분리된 positive clone을 이용하여 PCR 방법으로 gap 영역을 증폭하여, 각 gap 영역에 대한 DNA 염기서열이 결정하였다. 그 결과, Gapl은 intron2에 존재하며 크기가 256 bp 이며, Gap2는 intron3에 존재하며 그 크기가 644 bp로 밝혀졌다(Table 4).
- 2A에서 보여주는 것과 같이 8개의 YAC 클론 모두에서 mHPRT 유전자 전체 크기에 해당되는 40 kb 이상의 크기를 나타내었다.이와 더불어 각 positive 클론 늘이 유전자 내부에서 결손 등을 나타내지 않고 완전한 크기의 유전자를 포함하고 있는가를 조사하기 위하여 mHPRT 내의 존재하는 9개의 exon에 대해 Table 2에 서 나타낸 primers를 사용하여, 각각 exonl에서 exon9 영역에 대해 PCR을 수행하여 전체 exon 영역이 존재함을 확인하였다(Fig. 2B).
- coll shuttle vector인 pRS313[l이으로부터 만들어졌다. 인간 게놈 DNA로 부터 hHPRT 유전자의 분리와 마우스 게놈으로부터 mHPRT (Hprtl) 분리를 위한 총 4 종류의 TAR vector는 Fig. IB에서 보여주는 것과 같이 여러 종류의 hook을 제작하여 TAR vector의 multi-cloning site에 삽입하였다.
- primary gene pool로 복제된 plate에서 자란 세포들을 5 M의 물로 배지 표면을 씻어 15 ml의 Falcon tube에 넣은 후집균하였다. 집균된 균주에서 zymolyase를 사용하여 효모의 DNA를 추출하였다 [1 이. 추출된 DNA를 400 의 TE buffer에 녹인 후, 이 중 1 ㎕를 PCR 반응에 시요하였다.
- 5% NaClz 50 μg/ml Ampicillin)를 사용하여 37C에서 배양하였다. 효모의 배양에는 YPD (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose) 액체배지와 여기에 2% Bacto-agar를 첨가한 YPD 고체 배지를 사용하였다. Spheroplasts transformation에 사용되는 Sorbitol-His 배지는 1 L에 28 g의 Ground His minus Powder Mixture (0.
대상 데이터
- endAl t?raD139 A(raz leu)7697 galU ga/KX- rpsL nupG) 를 사용하였다. 기본 TAR vector로 사용되는 pVC604 (Fig.
- 1, Table 1).네 종류의 TAR vector 중 J1HPRT+/Alu와 mHPRT+Ahi는 인간 hHPRT 유전자를 분리하는데 사용하였고, hHPRT+Bl과 mHPRT+Bl는 마우스 mHPRT 유전자를 분리하는 데 사용하였다. 각 TAR vector를 사용하여 얻은 형질전환체 수는 plate 당 약 400개로 vector 간의 형질전환빈도의 차이는 크게 나타나지 않았다.
- [22] 방법을 사용하였다. 대장균 DH5a의 증식용 배지로 LB (Luria-Bertani) broth (0.5% Yeast extract, 1% Bactotrypton, 0.5% NaClz 50 μg/ml Ampicillin)를 사용하여 37C에서 배양하였다. 효모의 배양에는 YPD (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose) 액체배지와 여기에 2% Bacto-agar를 첨가한 YPD 고체 배지를 사용하였다.
- 자리에 삽입하였다. 본 실험에 사용된 TAR vector 4종류는 모두 radial vector로서 인간의 hHPRT 유전자 혹은 마우스의 mHPRT의 3'염기서열을 지닌 3'-hook으로 삽입되 었다 (Fig. lz Table 1). 또한 5Z-Universal hook으로는 인간 게놈에서 사용될 때는 Alu 반복 서열을 사용하였고, 마우스 게놈을 사용할 경우에는 B1 반복 서열을 사용하여 Apal-Xhol 자리에 삽입하였다 (Fig.
- 유전자를 선별하였다. 본 실험에 사용된 인간 및 마우스의 HPRT 유전자는 유전체 프로젝트에 의해 Canis fa miliarise), Rattus nomegicus(시궁쥐), Gallus gallus(오골계), Caenorhabditis Megms(꼬마선충), Plasmodium falciparum 3D7(말라리아)에서 상동성 유전자가 분리되어 그 염기서열이 결정되었다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query. fcgi?CMD=search&DB=homologene). 이러한 염기 서열을 기초로 상동성 HPRT 유전자를 인간에서 말라리아에 이르기까지 분석하여 보면, 아미노산 수준과 DNA 염기서열에 있어서 매우 높은 상동성을 나타낸다.
- 그 결과, Gapl은 intron2에 존재하며 크기가 256 bp 이며, Gap2는 intron3에 존재하며 그 크기가 644 bp로 밝혀졌다(Table 4).이 영역에 대해 본 연구그룹이 GenBank (NCBI)에 등록하여 각각 AY302564, AY302565의 accession 번호를 획득하였다.
이론/모형
- 및 Sherman et al.[22] 방법을 사용하였다. 대장균 DH5a의 증식용 배지로 LB (Luria-Bertani) broth (0.
성능/효과
- 이러한 분리빈도는 이종간의 유전체의 차이에도 불구하고 유사한 빈도를 보여준다. 또한 반대로 마우스게놈에서 "HFRT+Bl와 mHPRT+Blf- 비교 분석한 결과에서도 각각 0.3%(7/2, 500, 8/2, 700)를 나타내어 이종간의 상동성 HPRT 유전자를 분리하는 데에는 두 종의 hook이 상호 사용될 수 있음을 시사한다. 그러므로, 이 결과는 기존에 알고 있는 유전자 염기서열정보를 이용하여 미지의 다른 종으로부터 상동 성 유전자의 분리에 효과적으로 사용될 수 있을 가능성을 보여준다.
- 첫 번째는 각 목적 유전자의 5'-상류와 3'-하류 말단 부위에 존재하는 특이적 배열을 hook으로 사용하는 방법 (two unique hook/ two-specific hook)으로, 인간의 유방암 유전자 BRCA2를 이 방법으로 분리하였다[13]. BRCA2 유전자의 상류와 하류에 위치하는 수백bp의 단편을 양쪽 말단에 hook으로 만든 TAR vector와 human genome DNA를 효모세포로 co-trans- formation한 결과, 완전한 길이인 90 kb의 BRCA2 유전자가 선택적으로 분리되었다. 그러나 이 방법은 일부분의 cDNA 배열만 알고 있는 경우는 사용할 수 없다.
- hHPRT+Alu와 mHPRT+Alu의 vector와 인간 게놈 DNA를 이용하여 hHPRT 분리빈도를 비교한 결과, 인간의 hook 정보를 이용한 /1HFRT+Ali와에서는 총 2, 500형질전환체 중에 10개의 positive# 분리하여0.4%를 나타내었고, mHPRT +Alu를 사용한 경우에도 총 3, 900형 질전환 체 중에서 13개의 positive를 얻어 0.33%를 나타내었다(Table 3).이러한 분리빈도는 이종간의 유전체의 차이에도 불구하고 유사한 빈도를 보여준다.
- mHPRT 유전자에 대하여 mouse genome project를 통해 염기서열을 조사한 결과, 유전자 내부의 intron2와 intron.3 영역에서 두 개의 염기서열이 결정되지 않은 작은 Gap을 확인하였다(mouse hprt public, gi20983873; NM_013556 range=chrX:39557221-39590617 Public). 이에 대해 본 실험에서 분리된 positive clone을 이용하여 PCR 방법으로 gap 영역을 증폭하여, 각 gap 영역에 대한 DNA 염기서열이 결정하였다.
- 네 종류의 TAR vector 중 J1HPRT+/Alu와 mHPRT+Ahi는 인간 hHPRT 유전자를 분리하는데 사용하였고, hHPRT+Bl과 mHPRT+Bl는 마우스 mHPRT 유전자를 분리하는 데 사용하였다. 각 TAR vector를 사용하여 얻은 형질전환체 수는 plate 당 약 400개로 vector 간의 형질전환빈도의 차이는 크게 나타나지 않았다. 네 종류의 vector를 이용하여 얻어진 형질전환 체 중 각각 2, 500〜 3, 900개의 형질전환체에 대하여, 각 exon 영역의 primer (Table 2)를 이용하여 각각의 positive clone을 확인하였다.
- 또한 mHPRT 유전자의 gap 부분의 염기서열을 결정하여, 이 부분에 염기서열의 불안정의 요인이 되는 비정상적 특성을 발견하였다. 결론적으로 TAR cloning법을 이용하여 다른 이종간의 게놈으로부터 상 동성 유전자 즉 orthologue의 분리가 가능하였다. 더욱이 TAR cloning 시스템을 이용하여 고등동물 게 놈 상에 남아있는 gap 부분을 메움으로서 고등동물의 모든 유전자들의 확인이 가속화될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이에 대해 본 실험에서 분리된 positive clone을 이용하여 PCR 방법으로 gap 영역을 증폭하여, 각 gap 영역에 대한 DNA 염기서열이 결정하였다. 그 결과, Gapl은 intron2에 존재하며 크기가 256 bp 이며, Gap2는 intron3에 존재하며 그 크기가 644 bp로 밝혀졌다(Table 4).이 영역에 대해 본 연구그룹이 GenBank (NCBI)에 등록하여 각각 AY302564, AY302565의 accession 번호를 획득하였다.
- 그러므로 이러한 비교 유전체 연구에 TAR cloning 법의 유용성을 알아보기 위해 Target hook에 변이를 삽입하여 상동성에 따른 cloning 빈도를 조사하였다[19]. 그 결과, 마우스 모델(v-Ha-ms: Tg.AC transgene)을 사용하여 TAR cloning법 의 상동성 재조합에 필요한 hook의 상동성 정도는 약 80%의 상동성hook으로 충분히 cloning이 가능함을 밝혔다 [1 이.
- 먼저 인간의 hHPRT (human hypoxanthine phos phoribosyltransferase) 유전자 cloning에 사용된 hook을 마우스에 사용하여 마우스 mHPRT 유전자를 분리를 시도하였고, 반대로 마우스의 게놈 정보로 만들어진 target hook을 인간의 hHPRT 유전자 분리에 사용하였다. 그 결과, 이종 간의 hook과 동종의 hook을 사용한 경우에서 각각 유사한 clon ing 빈도를 나타내 었다. 또한 이 방법에 의해 cloning된 마우스의 HPRT (Hprtl)를 사용하여, 유전체 사업을 통해 염기서열이 결정되지 않고 gap으로 남아 있던 부분의 염기서열을 결정하였다.
- 본 연구에서는 TAR cloning 법을 상동성 유전자의 분리에 사용할 수 있는가를 조사하기 위해, 인간과 마우스 게놈의 HPRT 유전자를 선택하였다. 그 결과, 인간과 마우스의 게놈으로부터의 HPRT 유전자의 분리빈도는 TAR vector로서 hHPRT hook 혹은 mHPRT hook을 사용한 경우에 거의 동일하게 나타났다. 또한 mHPRT 유전자의 gap 부분의 염기서열을 결정하여, 이 부분에 염기서열의 불안정의 요인이 되는 비정상적 특성을 발견하였다.
- 이 gap 부분의 DNA 특성을 조사하여 DNA sequencing 에 있어 gap으로 남는 영역의 특성을 조사한 결과, Table 4 에서 보여주는 것과 같이 Gapl은 CT repeat의 반복서열이 길게 존재하고, Gap2 영역은 GC contents가 76.4%로 매우 높게 나타내 DNA 염기서열 결정에 문제를 나타내는 영역으로 보인다. 이러한 결과는 앞서 본 연구팀에 의해서 보고된 연구와 일치하는 것으로 [16, 17], 높은 반복 서열이나 높은 GC content의 존재는 대장균 내에서 만들어진 library 제작과정에서 재배열이 일어나거나 불안정한 요인으로 작용하며, 또한 DNA sequencing 반응과정에 어려움의 요인으로 사료된다.
- 이 전의 연구에서 hHPRT radial TAR vector를 통하여 얻어진 클론에 대하여 분리된 YAC DNA의 크기가 다양하게 나타나, A/u-Universal hook을 사용한 경우 다양한 크기의 클론이 분리될 수 있음이 보고되었다 [8]. 이는 게놈 전반적으로 산재한 반복 서열과 random하게 Universal hook이 재조합이 일어남을 보여주는 것으로 인간의 Alu 반복서열을 이용하여 확인되었다.
- 이러한 결과는 TAR cloning 법으로 얻은 각 positive clone들이 40 Kb 이상의 크기를 갖는 동시에 9개의 전체 exon 영역을 지니고 있음을 확인된 것으로, 이 방법이 매우 효과적으로 유전자를 분리해낼 수 있음을 보여준다. 이는 기존의 복잡한 library 제작 방법과는 달리, 전체 크기의 목적 유전자를 전체 게놈으로부터 빠르고 정확히 분리될 수 있음을 보 여주는 좋은 예이다.
- 이러한 염기 서열을 기초로 상동성 HPRT 유전자를 인간에서 말라리아에 이르기까지 분석하여 보면, 아미노산 수준과 DNA 염기서열에 있어서 매우 높은 상동성을 나타낸다. 인간과 개를 비교하였을 때 아미노산 수준에서 96.8%, nucleotide 수준에서 95.7% 의상 동성을 나타내고, 인간과 마우스는 아미노산 수준에서 96.3%, nucleotide 수준에서 93.3% 그리고 말라리아와의 비교에서도 아미노산 수준에서 50.2%, nucleotide 수준에서 57.6%의 매우 높은 상동성을 나타내었다. 이렇게 높은 수치의 상동성을 보여주는 유전자들은 HPRT 유전자와 같이 생물체의 기능에 필수적으로 매우 중요한 기능을 갖는 것들로서, 서로 다른 이종간의 유전체에서도 매우 높은 비율로 보존되어 있으리라 사료된다.
후속연구
- 그러므로, 이 결과는 기존에 알고 있는 유전자 염기서열정보를 이용하여 미지의 다른 종으로부터 상동 성 유전자의 분리에 효과적으로 사용될 수 있을 가능성을 보여준다. 그러므로 본 연구 결과는 비교유전체 학 연구에 있어서 좋은 도구로 TAR cloning 기술이 이용될 수 있을 가능성을 시사한다.
- 이는 기존의 복잡한 library 제작 방법과는 달리, 전체 크기의 목적 유전자를 전체 게놈으로부터 빠르고 정확히 분리될 수 있음을 보 여주는 좋은 예이다. 그러므로 이 결과는 다른 종의 유전정보를 이용한 TAR cloning법으로 이종간의 orthologue 유전자 분리가 정확하고 효과적으로 수행될 수 있음을 보여주며, 나아가 이 방법으로 한 종에서 여러 개 존재하는 상동 유전자인 paralogue의 분리에도 사용될 수 있음을 시사한다.
- 3%(7/2, 500, 8/2, 700)를 나타내어 이종간의 상동성 HPRT 유전자를 분리하는 데에는 두 종의 hook이 상호 사용될 수 있음을 시사한다. 그러므로, 이 결과는 기존에 알고 있는 유전자 염기서열정보를 이용하여 미지의 다른 종으로부터 상동 성 유전자의 분리에 효과적으로 사용될 수 있을 가능성을 보여준다. 그러므로 본 연구 결과는 비교유전체 학 연구에 있어서 좋은 도구로 TAR cloning 기술이 이용될 수 있을 가능성을 시사한다.
- 결론적으로 TAR cloning법을 이용하여 다른 이종간의 게놈으로부터 상 동성 유전자 즉 orthologue의 분리가 가능하였다. 더욱이 TAR cloning 시스템을 이용하여 고등동물 게 놈 상에 남아있는 gap 부분을 메움으로서 고등동물의 모든 유전자들의 확인이 가속화될 수 있을 것으로 사료된다.
- 시 사한다. 또한 염기 서열의 결정에 어려워 gap으로 남게 된 DNA 염기서열의 특성(Table 4)을 밝혀, 반복서열과 높은 GC contents가 유전체 연구의 염기서열 완성에 어려운 요소로 확인되어 이에 대한 방법으로도 TAR cloning 법의 효용성이 제기된다.
- 본 연구의 결과들을 종합하면 유전체 연구의 새로운 기술인 TAR cloning 법은 이종간의 orthologue 분리에 매우 효과적으로 사용할 수 있으며, 나아가 이 기술은 동종간의 gene duplication이나 paralogue의 분리에도 이용될 수 있을 가능성을 시 사한다. 또한 염기 서열의 결정에 어려워 gap으로 남게 된 DNA 염기서열의 특성(Table 4)을 밝혀, 반복서열과 높은 GC contents가 유전체 연구의 염기서열 완성에 어려운 요소로 확인되어 이에 대한 방법으로도 TAR cloning 법의 효용성이 제기된다.
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