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문제 정의
- 그러나 문헌상 장의 기능을 조절한다고 알려진 제호탕의 연구는 일반성분에 대한 일부 연구만(18, 19) 진행되었을 뿐 효능을 입증할 과학적인 연구가 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구는 제호탕이 장내 유익균의 생육에 미치는 영향과 장내 대표적인 유해균의 생육을 저해시켜 장내 환경을 개선시킬 수 있는 효능을 in vitro 실험을 통해 관찰하고 면역 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 마우스를 통한 in vivo 실험으로 장관 면역 반응에 따른 장내 분비 IgA 생성량과 혈액 성분의 변화를 관찰하여 한국 고유의 전통음료의 기능성을 과학적으로 입증하고 대중화하는데 기초자료를 제공하고자 하였다.
- 따라서 본 연구는 제호탕이 장내 유익균의 생육에 미치는 영향과 장내 대표적인 유해균의 생육을 저해시켜 장내 환경을 개선시킬 수 있는 효능을 in vitro 실험을 통해 관찰하고 면역 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 마우스를 통한 in vivo 실험으로 장관 면역 반응에 따른 장내 분비 IgA 생성량과 혈액 성분의 변화를 관찰하여 한국 고유의 전통음료의 기능성을 과학적으로 입증하고 대중화하는데 기초자료를 제공하고자 하였다.
가설 설정
- 2)Data values are mean±SD.
제안 방법
- 전배양액을 접종하여 혐기적으로 37。(:에서 18시간 배양하면서 600nm에서 O.D.(optical density)을 측정하여 균의 생육상태를 조사하였다.
- 1, 1, 10 mg 농도가 되도록 추출시료를 적하하였다. 이 배지를 혐기적 조건으로 37。(:에서 48시간 배양한 다음 생육 활성환과 생육 저해환의크기를 관찰하였다.
- Peyer's patch 세포의 분리는 장기에서 분리한 Peyer's patch 조직을 cell dissociator sieve-tissue grinder kit(Sigma, USA)로 잘게 으깬 후, 세포를 수거하여 HBSS 로 3회 세척한다. 비장세포와 Peyer’s patch 세포의 증식효과를 측정하기 위해 세포는 96 well plate에 2><1。5 c시ls/well의 농도로 맞춰 분주하고, 세포의 mitogen 으로 T cell stimulator 오} B cell stimulator 인 Concanavalin A(ConA)와 Lipopolysaccharide(LPS) 각각을 1 ptg/mL과 10 卩g/mL 농도로 처리한다. 제호탕 열수 추출물을 농도별로 처리한 후 72 시간 동안 배양한 후 종료하기 4시간전에 MTT 용액을 첨가하여 반응시킨다.
- 1, 1 mg/ mL의 농도로 첨가하고 mitogen으로 ConA와 LPS를 각각 1, 10卩g/mL로 첨 가하여 배 양하였다. 그 결과, 비 장세포와 Pe>er, s patch 세포의 증식능은 대조군으로 배양액만을 넣은 흡광도를 100%로 하여 비교하였다. 비장세포의 면역 증식능을 관찰한 결과, 제호탕 열수추출물의 농도를 1 mg/m匸로 처리하였을 때 게 호탕 열수 추출물만 첨가한 경우와 ConA와 LPS를 첨가해서 배양한 경우에 대조군에 비해 1.
- 있어 점막 표면의 면역 반응에 중요하다(28). 따라서 장내 분비 IgA의 생성량은 장내 면역반응의 중요한 지표로 볼 수 있어, 제호탕 열수 추출물을 마우스에 경구투여한 후 장내 분비 IgA의 양을 관찰하였다. 그 결과, 제호탕 열수 추출물을 투여하였을 때 대조군에 비해 평균적으로 slgA 양이 2.
- 제호탕 열수 추출물을 농도별로 처리한 후 72 시간 동안 배양한 후 종료하기 4시간전에 MTT 용액을 첨가하여 반응시킨다. 반응 종료를 위해 산성 isopropanol을 넣어 보라색 결정체가 완전히 용해될 때까지 혼합한 후 570 nm 파장에서 홉 광도를 측정하여 세포활성을 관찰하였다.
- 05% 포함된 PBS (PBST)로 3회 세척한 다음 장내 시료를 1% bovine serum albumine이 포함된 PBST에 희석하여 실온에서 1 시간 방치하고 PBST로 4회 세척한 다음 bioti nylated anti-mouse IgA(BD biosciences, USA)를 2 卩g/mL로 처리하여 실온에서 1시간 毛 PBST로 5회 세척한 다음 Stepravidin- HRP(BD biosciences, USA)를 1, 000배 희석하여 실온에서 30분간 반응시킨다. 반응 후에 PBST로 5회 세척한 다음 0.1 M anhydrous citric acid에 2, 2'-Azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfbnic acid)- diammonium salt(Sigma, USA)가 포함된 ABTS substrate 용액 (pH 4.35)을 well에 100 卩L 첨 가하고 실온에서 30분간 반응 후에 반응을 정지시키기 위해 Dimethylformamide(Sigma, USA)와 Sodium dodecyl sulfate(Sigma, USA) 가 각각 50과 20% 포함된 ABTS stopping 용액 50 卩L을 첨 가하고 microplate readei을 이용하여 405 nm에서 즉정 하였다.
- , England) 배지에서 37°C 혐기적 조건(BBL GasPak, Becton Dickinson and Company, USA)으로 활성화시켜 사용하였다. 본 연구의 세포배양 실험에 사용한 배지는 RPMI medium 1640(GIBCO, USA)에 sodium bicarbon- ate(NaHCO3, 2 g/L), 10% 우태 아 혈 청 (Fetal bovine serum; GIBCO, USA), lOOU/mL penicillin(GIBCO, USA), 100 |ig/mL streptomycin(GIBCO, USA)를 첨가하였다.
- 제조한 lavage solution(Table 2)을 장기내부로 주입하여 실온에서 10분간 경과시킨 후 장기 내용물을 압착하여 4。(2에서 원심분리(700Xg, 10분) 를 실시하였다. 분리한 상증액에 1 mM phenylmethylsufbnyl fluo- ride(PMSF)을 첨가하여 원심분리(13, 000rpm, 】5분) 한 후, 상층 액을 수거하여 1 mM PMSF를 첨가하고 얼음속에 15분간 경과 후 3.5% y-globulin free bovine serum alb니min을 첨가하여 원심분리를 실시하였다. 분리된 장내 시료의 정량적 IgA를 측정하기 위히1 Enzyme-linked Immunosorbent Assays(ELISA) 실시하였다.
- 실시하였다. 시험군은 제호탕 열수 추출물을 생리식염수에 용해하여 0.45 pim membrane filter로 여과한 다음 500 mg/kg/day을 경구로 15일간 투여하였고, 대조군은 동량의 생리식염수를 15일간 경구 투여하였다.
- 제호탕 열수 추출물에 대한 장내 세균의 활성 효과를 고체배지로 확인하기 위해 EG 배지를 사용하여 추출물을 농도별토 적하하여 관찰하였다(Table 4). 장내 유익균인 Lacotobacillus sp.
- 7g을 곱게 간 다음 열수 추출기에서 1시간 추출한 후 여과하고, 잔사에 증류수를 가해 2회 반복 열수 추출하였다. 제호탕 열수 추출물은 여과지로 여과하여 이를 감압증류 장치로 농축한 후 동결 건조기(일신, 한국)를 이용하여 완전건조하였다. 동결 건조된 제호탕 열수 추출물을 실험에 필요한 농도가 되도록 조정하여 멸균된 증류수에 완전히 녹인 후 여과하여 사용하였다.
- 제호탕 열수 추출물의 비장과 Peyer's patch의 면역세포 증식 능을 관찰하기 우]해, 제호탕 열수 추출물의 농도를 0.01, 0.1, 1 mg/ mL의 농도로 첨가하고 mitogen으로 ConA와 LPS를 각각 1, 10卩g/mL로 첨 가하여 배 양하였다. 그 결과, 비 장세포와 Pe>er, s patch 세포의 증식능은 대조군으로 배양액만을 넣은 흡광도를 100%로 하여 비교하였다.
- 제호탕 열수 추출물이 장내 세균의 생육에 미치는 영향을 관찰하기 위해 고체배지인 EG 한천배지를 멸균한 후 501로 식힌 다음 4종의 균주를 1% 되도록 배지를 조제하고 직경 6mm disc paper(Toyo Ro아ii Kaisha Ltd., Tokyo, Japan)에 0.1, 1, 10 mg 농도가 되도록 추출시료를 적하하였다. 이 배지를 혐기적 조건으로 37。(:에서 48시간 배양한 다음 생육 활성환과 생육 저해환의크기를 관찰하였다.
- 제호탕 열수 추출물이 장내 세균의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위해 Modified EG(Eggerth Gagnon)(20) 액체배지(Table 1)를 사용하였다. 제호탕을 동결건조시켜 만든 추출물을 0丄 1, 10mg/mL 농도로 첨가한 Modified EG broth에 활성화 시킨 각 균의 전배양액을 접종하여 혐기적으로 37。(:에서 18시간 배양하면서 600nm에서 O.
- 제호탕 열수 추출물이 혈액의 성분에 변화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 제호탕 열수 추출물을 마우스에 경구투여 한 후 전혈하여 자동혈구 계산기로 실험을 실시하였다. 제호탕 열수 추출물을 투여한 군의 혈액 성분 중 lymphocytes는 대조군에 비해 4% 감소하였고 granulocytes는 4% 증가함을 보였다.
- 제호탕의 제조는 오매육 600 g은 굵게 갈고 초과 37.5 g, 백단향 18.72g, 공사인 18.7g을 곱게 간 다음 열수 추출기에서 1시간 추출한 후 여과하고, 잔사에 증류수를 가해 2회 반복 열수 추출하였다. 제호탕 열수 추출물은 여과지로 여과하여 이를 감압증류 장치로 농축한 후 동결 건조기(일신, 한국)를 이용하여 완전건조하였다.
- 한국의 전통 음료인 제호탕의 장내 개선 효능을 조사하기 위해 제호탕 열수 추출물을 Modified EG 액체배지에 처리하고 장내 균종 중 대표적인 유익균인 B. logum, Lactobacillus sp와 L. acidophilus, C. perferingens 균주를 접종하여 생육 활성을 관찰하였다. 그 결과, 제호탕 열수 추출물의 농도를 0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 균주는 장내 유익균의 지표로 Bifidobacterium longum ATCC 15707, Lactobacillus sp. KCTC 3930, Lactobacil lus acidophilus ATCC 4356와 유해 균의 지표로 Clostridium per- fringens ATCC 13124 를 사용하였다. 균주들은 Reinforced Clostridial Media(RCM, Oxoid LTD.
- 생후 6주령의【CR계 마우스 수컷 5마리씩을 제호탕 열수 추출물을 투여한 시험군과 대조군으로 나누어 실험을 실시하였다. 시험군은 제호탕 열수 추출물을 생리식염수에 용해하여 0.
- 제호탕 열수추출물이 비장의 면역세포와 장내 면역반응을 주도하는 Peyer, s pacth 세포증식능에 미치는 영향을 조사하기 위해, 생후 6주령의 ICR계 마우스로부터 비장과 십이지장에서부터 회장까지 분리하였다. 제거한 비장을 4°C RPMI-1640로 세척한 다음 cell dissociator sieve-tissue grinder kit(Sigma, USA) 로 조직을 잘게 으깬 후, 비장세포를 수거하고 HBSS(GIBCO, USA)로 3회 세척한다.
이론/모형
- 5% y-globulin free bovine serum alb니min을 첨가하여 원심분리를 실시하였다. 분리된 장내 시료의 정량적 IgA를 측정하기 위히1 Enzyme-linked Immunosorbent Assays(ELISA) 실시하였다. 96 well plate에 capture antibody로 Anti-mouse IgA mAb(BD bio sciences, USA)를 4°C 16시간 동안 coating하고, 1% bovine serum albumine이 포함된 PBS로 실온에서 1시간 blocking을 실시하였다.
성능/효과
- 제호탕 열수 추출물을 0.1 mg/mL로 처리 흐!: 결과, 장내 유익균인 B. longum, Lactobacil lus sp와 L. acidophilus 균주의 생육이 1.6배 이상 상승하였고 C. pe巾Wigens의 생육도 1.15배 상승하였다. 제호탕 열수 추출물의 농도를 1 mg/mL로 처리시에 유익균인 B.
- acidophilus 균주는 제호탕 열수 추출물의 농도를 10mg/disc 로 실시하였을 때 직경 12 mm 와 24 mm의 높은 생육 활성환을 나타내었다. In v汐»에서 제호탕 열수 추출물이 비장과 Peyer's patch 면역세포 증식능에 미치는 영향을 관찰한 결과, 제호탕 열수 추출물의 농도를 1 mg/mL로 처리하였을 때 대조군에 비해 비장세포는 1.4배, Peyer's patch 세포는 1.6배 상승하여 비장세포보다 장관 면역을 담당하는 Peyer's patch 세포의 증식을 촉진시켰다. 제호탕 열수 추출물의 섭취에 따른 장내 분비 IgA 양은 대조군에 비해 평균적으로 2.
- 1). Peyer, s patch 세포의 면역 증식능을 관찰한 결과, 제호탕 열수 추출물의 농도를 1 mg/mL로 처리하였을 때 대조군에 비해 1.6배 상승하였고 mitogen의 첨가유무에 따른 큰 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 2). 제호탕 열수추출물은 비장의 면역세포보다 장에 존재하여 장관 면역을 담당하고 있는 Peyer's patch 세포의 증식을 활발히 촉진시켜 전체 면역을 활성화시킬 것으로 사료된다.
- 따라서 장내 분비 IgA의 생성량은 장내 면역반응의 중요한 지표로 볼 수 있어, 제호탕 열수 추출물을 마우스에 경구투여한 후 장내 분비 IgA의 양을 관찰하였다. 그 결과, 제호탕 열수 추출물을 투여하였을 때 대조군에 비해 평균적으로 slgA 양이 2.4배 상승하였고, 최대 3배까지 증가하였다(Fig. 3). 이것은 제호탕 열수 추출물이 장내 면역 활성을 촉진하여 slgA 분비량을 증가시켰을 것으로 추측된다.
- perferingens 균주를 접종하여 생육 활성을 관찰하였다. 그 결과, 제호탕 열수 추출물의 농도를 0.1mg/mL로 처리 시에 B. loHgwn과 Lactobacilus 균주의 생육 활성 효과가 우수하였다. 특히 제호탕 열수 주줄물은 대조군에 비해 L acidophilus 균주의 생육을 최대 1.
- 제호탕 열수 추출물을 투여한 군의 혈액 성분 중 lymphocytes는 대조군에 비해 4% 감소하였고 granulocytes는 4% 증가함을 보였다. 또한 제호탕 열수 추출물을 투여한 결과, platelet이 대조군에 비해 증가함을 나타냈고 다른 혈액 성분들의 변화는 관찰되지 않았다(Table 5). 이러한 결과는 제호탕 열수 추출물이 혈액 성분 중 일부 초기 면역반응에 관련하는 gran나ocytcs에 영향을 끼친 것으로 추측된다.
- perjrhigHes의 생육은 억제시켜 선택적으로 장내 미생물 균종의 생육에 영향을 끼친다는 연구가 보고되었다. 본 연구에서 제호탕 열수 추출물은 장내 미생물 균종에 따른 선택적인 생육에 미치는 영향이 뚜렷하게 나타나지는 않았지만, 특히 Lactobacillus 균주의 생육을 촉진하는 효과를 관찰할 수 있었다.
- 그 결과, 비 장세포와 Pe>er, s patch 세포의 증식능은 대조군으로 배양액만을 넣은 흡광도를 100%로 하여 비교하였다. 비장세포의 면역 증식능을 관찰한 결과, 제호탕 열수추출물의 농도를 1 mg/m匸로 처리하였을 때 게 호탕 열수 추출물만 첨가한 경우와 ConA와 LPS를 첨가해서 배양한 경우에 대조군에 비해 1.3에서 1.4배 상승하였다(Fig. 1). Peyer, s patch 세포의 면역 증식능을 관찰한 결과, 제호탕 열수 추출물의 농도를 1 mg/mL로 처리하였을 때 대조군에 비해 1.
- 장내 유익균인 Lacotobacillus sp. 와 L. acidophilus 균주의 생육을 관찰한 결과, 제호탕 열수 추출물의 농도를 1 mg/mL과 10mg/mL로 처리하였을 때 최소 직경 12mm 에서 최대 24 mm 활성환을 관찰하였다. 제호탕 열수추출물은 EG 배지에서 B.
- 의 생육 활성에 영향을 미치는 것으로 추정된다. 이상의 결과는 제호탕 열수 추출물이 Lactobacillus 의 생육촉진 인자를 포함할 수 있다는 것을 제시하여 춘다. Lactobacillus 및 Bifidobacteria --] 생육을 촉진시켜 장내균총M 균형을 이루게 하여 유해가스 생성을 억제하는 것으로써 플락生올리고당, 키토올리고당 및 식이섬유(26, 27) 등이 알려져 있어 게 호탕 열수추출물의 성분분석을 통해 보고된 젖산균의 생육인자와의 관련성을 탐색할 수 있을 것이다.
- 8배 상승시켜 젖산균의 생육인자를 함유할 것으로 추정된다. 장내 세균의 활성 효과를 한천배지상에서 재확인한 결과, Lactobacillus sp와 L. acidophilus 균주는 제호탕 열수 추출물의 농도를 10mg/disc 로 실시하였을 때 직경 12 mm 와 24 mm의 높은 생육 활성환을 나타내었다. In v汐»에서 제호탕 열수 추출물이 비장과 Peyer's patch 면역세포 증식능에 미치는 영향을 관찰한 결과, 제호탕 열수 추출물의 농도를 1 mg/mL로 처리하였을 때 대조군에 비해 비장세포는 1.
- 4배 증가하여 제호탕 열수 추출물이 장내 면역을 활성화시키는 것으로 사료된다. 제호탕 열수 추출물을 경구투여한 후 혈액성분을 관찰한 결과, 대조군에 비해 lymphocytes는 4% 감소한 반면에 granulo- cytes는 4% 증가했고 platelet0] 상승했으며 다른 혈액 성분 변화를 관찰되지 않았다. 향후 제호탕 열수 추출물이 in vivo에서 관찰된 면역 세포의 변화에 관한 연구가 진행되어져야 할 것이다.
- 자동혈구 계산기로 실험을 실시하였다. 제호탕 열수 추출물을 투여한 군의 혈액 성분 중 lymphocytes는 대조군에 비해 4% 감소하였고 granulocytes는 4% 증가함을 보였다. 또한 제호탕 열수 추출물을 투여한 결과, platelet이 대조군에 비해 증가함을 나타냈고 다른 혈액 성분들의 변화는 관찰되지 않았다(Table 5).
- 제호탕 열수추출물은 비장의 면역세포보다 장에 존재하여 장관 면역을 담당하고 있는 Peyer's patch 세포의 증식을 활발히 촉진시켜 전체 면역을 활성화시킬 것으로 사료된다. 제호탕 열수 추출물이 비장과 Peyer’s patch 의 면역세포 증식능에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비해 농도의존적으로 면역세포의 증식 능이 상승하는것으로 나타났다. 장관 내에 있는 Peyer's patch 의 림프구들은 M cell에 의해 섭취된 항원과 반응하여 활성화된 후, 림프소절의 gemiinal centei에서 분화하고 성숙하게 되며, 장으로부터 빠르게 이동하여 체내를 순환하게 된다(28).
- acidophilus 균주의 생육을 관찰한 결과, 제호탕 열수 추출물의 농도를 1 mg/mL과 10mg/mL로 처리하였을 때 최소 직경 12mm 에서 최대 24 mm 활성환을 관찰하였다. 제호탕 열수추출물은 EG 배지에서 B. longum 균주와 C. perfi-ingens 균주의 생육에는 영향을 끼치지 않았고, 제호탕 열수 추출물의 농도를 10 mg/mL로 처리했을 때 생육 저해효과를 관찰할 수 있었다. 이것은 제호탕 열수 주줄물이 B.
- loHgwn과 Lactobacilus 균주의 생육 활성 효과가 우수하였다. 특히 제호탕 열수 주줄물은 대조군에 비해 L acidophilus 균주의 생육을 최대 1.8배 상승시켜 젖산균의 생육인자를 함유할 것으로 추정된다. 장내 세균의 활성 효과를 한천배지상에서 재확인한 결과, Lactobacillus sp와 L.
- 5배 상승하였다. 특히, 제호탕 열수 추출물은 대조군에 비해 Lactobacillus sp와 L. acidophilus 균주의 성장을 최대 1.8배 증가시키는 것으로 나타났다. 쑥의 물분획물(23), 인삼의 물추출물과 메탄올추출 그리고 녹차의 메탄올 추출물(24, 25)은 Bifidobacterium sp.
후속연구
- 이상의 결과는 제호탕 열수 추출물이 Lactobacillus 의 생육촉진 인자를 포함할 수 있다는 것을 제시하여 춘다. Lactobacillus 및 Bifidobacteria --] 생육을 촉진시켜 장내균총M 균형을 이루게 하여 유해가스 생성을 억제하는 것으로써 플락生올리고당, 키토올리고당 및 식이섬유(26, 27) 등이 알려져 있어 게 호탕 열수추출물의 성분분석을 통해 보고된 젖산균의 생육인자와의 관련성을 탐색할 수 있을 것이다.
- 제호탕 열수 추출물을 경구투여한 후 혈액성분을 관찰한 결과, 대조군에 비해 lymphocytes는 4% 감소한 반면에 granulo- cytes는 4% 증가했고 platelet0] 상승했으며 다른 혈액 성분 변화를 관찰되지 않았다. 향후 제호탕 열수 추출물이 in vivo에서 관찰된 면역 세포의 변화에 관한 연구가 진행되어져야 할 것이다.
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