젖소에 있어서 Lipopolysaccharide의 처리가 면역 반응에 미치는 영향 Effect of Intra-Uterine Lipopolysaccharides Injection on Immunological Response of Uterus in Lactating Holsteins원문보기
본 연구는 젖소에 있어서 Lipopolysaccharide의 처리가 착유우의 면역 반응에 미치는 영향을 구명하기 위하여 처리구 5두 및 대조구 3두를 공시하여 LPS 처리후 시간의 경과에 따른 PMNL의 비율, PMNL의 생존율 및 탐식 PMNL의 비율 등을 분석하였다. PMNL의 비율에 있어서, 처리전(0시간째)에는 대조구 및 처리구가 각각 41.0% 및 47.2%였으나 24시간째에는 41.7% 및 72.1%, 48시간째에는 41.0% 및 81.6%, 72시간째에는 44.3% 및 79.0%로 24시간째, 48시간째 및 72시간째에 공히 처리구가 대조구에 비하여 유의적(p<0.01)으로 높은 경향을 나타내었다. 대조구와 처리구의 PMNL의 생존율은 처리시간에 따른 차이가 없었다. 탐식 PMNL의 비율에 있어서, 처리전(0시간째) 및 처리 후 24시간째에는 대조구와 처리구간에 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 48시간째에는 각각 1.1% 및 7.7%로 처리구가 대조구에 비하여 유의적(p<0.05)으로 높은 경향을 나타내다가 72시간째에는 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
본 연구는 젖소에 있어서 Lipopolysaccharide의 처리가 착유우의 면역 반응에 미치는 영향을 구명하기 위하여 처리구 5두 및 대조구 3두를 공시하여 LPS 처리후 시간의 경과에 따른 PMNL의 비율, PMNL의 생존율 및 탐식 PMNL의 비율 등을 분석하였다. PMNL의 비율에 있어서, 처리전(0시간째)에는 대조구 및 처리구가 각각 41.0% 및 47.2%였으나 24시간째에는 41.7% 및 72.1%, 48시간째에는 41.0% 및 81.6%, 72시간째에는 44.3% 및 79.0%로 24시간째, 48시간째 및 72시간째에 공히 처리구가 대조구에 비하여 유의적(p<0.01)으로 높은 경향을 나타내었다. 대조구와 처리구의 PMNL의 생존율은 처리시간에 따른 차이가 없었다. 탐식 PMNL의 비율에 있어서, 처리전(0시간째) 및 처리 후 24시간째에는 대조구와 처리구간에 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 48시간째에는 각각 1.1% 및 7.7%로 처리구가 대조구에 비하여 유의적(p<0.05)으로 높은 경향을 나타내다가 72시간째에는 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
This study was carried cut to determine the immunological response of uterus-induced by Lipopolysaccharides (LPS) in Holstein cows. The LPS isolated from Bacteroids helcogenes and Fusobacterium varium was injected at the rate of 100 ${\mu}g$ with 30 ml of phospahte buffer saline(PBS) in e...
This study was carried cut to determine the immunological response of uterus-induced by Lipopolysaccharides (LPS) in Holstein cows. The LPS isolated from Bacteroids helcogenes and Fusobacterium varium was injected at the rate of 100 ${\mu}g$ with 30 ml of phospahte buffer saline(PBS) in each cow(n=5). Three cows were acted as control. There was no difference in total polymorphonuclear leukocytes(PMNL) concentration in uterine fluid between control and LPS groups at 24, 48 and 72 hrs after LPS treatment. There was significant difference in rate of PMNL between control and LPS groups at 24(41.7% vs 72.1%), 48(41.0% vs 81.6%) and 72 hrs(44.3% vs 79.0%) after LPS treatment. There was no difference in PMNL viability between control and LPS groups at 24, 48 and 72 hrs after LPS treatment. There was significant difference in rate of phagocytic PMNL between control and LPS groups at 48 hr after LPS treatment(1.1% vs 7.7%).
This study was carried cut to determine the immunological response of uterus-induced by Lipopolysaccharides (LPS) in Holstein cows. The LPS isolated from Bacteroids helcogenes and Fusobacterium varium was injected at the rate of 100 ${\mu}g$ with 30 ml of phospahte buffer saline(PBS) in each cow(n=5). Three cows were acted as control. There was no difference in total polymorphonuclear leukocytes(PMNL) concentration in uterine fluid between control and LPS groups at 24, 48 and 72 hrs after LPS treatment. There was significant difference in rate of PMNL between control and LPS groups at 24(41.7% vs 72.1%), 48(41.0% vs 81.6%) and 72 hrs(44.3% vs 79.0%) after LPS treatment. There was no difference in PMNL viability between control and LPS groups at 24, 48 and 72 hrs after LPS treatment. There was significant difference in rate of phagocytic PMNL between control and LPS groups at 48 hr after LPS treatment(1.1% vs 7.7%).
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문제 정의
이와 같이 LPS는 사람이나 동물에 감염되면 병을 일으키는 endotoxin의 원인물질이기도 하지만 감염 저항성 증가, 비특이적 감염 방어, 면역 부활작용 등 생물에게 유익한 생화학적 특성이 있다고 알려져있어 항생제 대체물질로서 많은 연구가 활발하게 시도되고 있다(류 등, 1991). 따라서 본 연구에서는 LPS의 처리가 자궁내 면역 반응에 미치는 영향을 구명하고자 실시하였다.
제안 방법
형광물질과 결합된 latex bead 10 μ1와 세포 부유액 1 ml를 24 multi-well 에 주입한 다음 CO2 incubator에서 1시간 동안 배양하여 eppendroff tube에 옮겨 담고 0.H% EDTA 함유된 PBS buffer(약 500 pl)로 바닥의 cell을 씻어내어 같이 담은 후 원심분리(4°C, 1, 600 rpm, 5분간 두 번 정도)로 cell을 가라앉혀 100〜300 μ1의 PBS에 재부유시켰고 조각 어름을 담은 상자에 넣어 phagocytosis 반응을 정지시킨 다음 Flow cytometry를 이용하여 탐식세포의 탐식능을 측정하였다(phagocytotic activity 즉정).
LPS 처리후 번식성적을 조사하기 위하여 2회 이상 인공수정을 실시하여도 수태가 되지 않은 개체를 대상으로 하 T 조구 3두 및 처리구 5두를 공시하여 Bacteroids helco- genes와 Fusobacterium vayyizzn으로부터 분리한 LPS 100 昭을 PBS 용액 35 ml에 희석하여 수정란 이식용 카테타로 자궁 내에 무균상태를 유지하면서 주입. 관류하였고, 대조구는 PBS 용액 35 ml만을 주입하여 관류액내의 총 백혈구 수, PMNL의 비율, PMNL 생존율, 탐식 PMNL의 비율을 분석한 결과, 총백혈구수에 있어서, Singh 등(2000) 은 6시간째에 대조구 및 처리구가 각각 0.
종 백혈구수(total leucocyte co- unt)는 Eppendroff tube에 자궁세척액과 Turk solution을 1:3으로 희석하여 적혈구를 용혈시킨 후 Hemocytometer 4개의 large square에서 전체 백혈구를 세어 계산(백혈구수xlCM0a)= 백혈구수/ ml)하였다. PMNL viability test는 자궁세척액과 Trypan blue(0.4%)를 slide 위에서 1:1로 혼합하여 건조시키지 않은 상태로 microscope에서 세포를 관찰하였고 stain되지 않은 것은 살아 있다고 판정하고 blue stain된 것은 죽은 것으로 판정하여 전체 100개의 PMNL을 세는 동안 살아 있는 PMNL의 수를 세었다. PMNL수는 자궁세척액을 1, 500 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 따르고 침전물을 slide에 도말하여 Diff- Quik으로 염색하여 현미경(유침시야 1, 000배)으로 전체 100개의 백혈구를 세는 동안 PMNL(neutrophil)을 세었다.
4%)를 slide 위에서 1:1로 혼합하여 건조시키지 않은 상태로 microscope에서 세포를 관찰하였고 stain되지 않은 것은 살아 있다고 판정하고 blue stain된 것은 죽은 것으로 판정하여 전체 100개의 PMNL을 세는 동안 살아 있는 PMNL의 수를 세었다. PMNL수는 자궁세척액을 1, 500 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 따르고 침전물을 slide에 도말하여 Diff- Quik으로 염색하여 현미경(유침시야 1, 000배)으로 전체 100개의 백혈구를 세는 동안 PMNL(neutrophil)을 세었다. PMNL의 탐식능력 시험(phagocyte activity test)을위하여, 멸균 거즈로 자궁세척액을 걸러서 혈액응고 덩어리나 debris를 제거한 다음 1, 500 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 따라 내었다(filte而g).
PMNL수는 자궁세척액을 1, 500 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 따르고 침전물을 slide에 도말하여 Diff- Quik으로 염색하여 현미경(유침시야 1, 000배)으로 전체 100개의 백혈구를 세는 동안 PMNL(neutrophil)을 세었다. PMNL의 탐식능력 시험(phagocyte activity test)을위하여, 멸균 거즈로 자궁세척액을 걸러서 혈액응고 덩어리나 debris를 제거한 다음 1, 500 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 따라 내었다(filte而g). Cor- nical tube에 NHQ을 자궁세척액과 1:1로 희석하여 적혈구를 용혈시킨 다음 1, 500 rpm에서 5분간 원심분리하여 cell을 가라 앉혔고 적혈구가 계속 남아 있으면 다시 한번 더 위의 과정을 반복하였다(적혈구 용혈).
균 분리 동정을 위하여, 도축장으로부터 수송한 자궁내막의 시료를 1 cmxl an로 채취하여 혐기상태에서 거품이 생길 때까지 vortexing한 후 균액 300 (d를 뽑아 혐기배지에 도말하였고 도말한 plate는 37°C 혐기 chamber에서 24시간 배양하였다. 혐기배지에서 자란 균의 colony# 따서 Mac, BHI+B, BHI 배지에 배양한 후 Gram stain을 실시하였고 BHI 배지에서 자란 균의 colony를 따서 BUA+B 배지에 계대배양하였으며 BUA+B 배지에서 자란 균 중에 가장 마지막으로 자란 균을 따서 AN-IF에 넣고 탁도를 63%T로 맞춘 후 Biolog용 AN micro plate 에 100ul씩 분주하였다.
혐기배지에서 자란 균의 colony# 따서 Mac, BHI+B, BHI 배지에 배양한 후 Gram stain을 실시하였고 BHI 배지에서 자란 균의 colony를 따서 BUA+B 배지에 계대배양하였으며 BUA+B 배지에서 자란 균 중에 가장 마지막으로 자란 균을 따서 AN-IF에 넣고 탁도를 63%T로 맞춘 후 Biolog용 AN micro plate 에 100ul씩 분주하였다. 분주한 plate를 37°C 혐기 chamber 에서 20~24시간 동안 배양한 후 Biolog(Microstation, USA)를 실시하여 6두의 비정상자궁에서 공통적으로 존재 하는 미 생 물인 Bacteroides helcogenes와 Fusobacterium varium을 검출하였다.
Cor- nical tube에 NHQ을 자궁세척액과 1:1로 희석하여 적혈구를 용혈시킨 다음 1, 500 rpm에서 5분간 원심분리하여 cell을 가라 앉혔고 적혈구가 계속 남아 있으면 다시 한번 더 위의 과정을 반복하였다(적혈구 용혈). 상층액을 모두 버리고 cell을 FCS가 0.5% 들어 있는 RPMI 1640 배양액 1 ml에 부유시킨 다음 cell의 수가 bio15개 정도가 되도록 농도를 조절하였다(세포의 부유). 형광물질과 결합된 latex bead 10 μ1와 세포 부유액 1 ml를 24 multi-well 에 주입한 다음 CO2 incubator에서 1시간 동안 배양하여 eppendroff tube에 옮겨 담고 0.
세균 배양은 자궁 세척액을 Sabouraud dextrose agar에 멸균 면봉으로 spread하여 37°C incubator에서 배양하여 colony7} 자랐을 때 pure culture하여 세균을 동정하였고 자궁세척액 중의 세균수는 채취액을 10배 희석하혀 colo ny 를 세어서 계산하였다. 종 백혈구수(total leucocyte co- unt)는 Eppendroff tube에 자궁세척액과 Turk solution을 1:3으로 희석하여 적혈구를 용혈시킨 후 Hemocytometer 4개의 large square에서 전체 백혈구를 세어 계산(백혈구수xlCM0a)= 백혈구수/ ml)하였다.
시료의 UV 측정을 위하여, Sonic Processor(GEX- 400, USA)로 세포를 분쇄하였고 분쇄한 세포를 4°C에서 lOQOOrpm으로 10분간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 0.45 pn 필터로 여과한 다음 여과액을 취하여 UV로 standard(左 coli serotype 026 B6 LPS, Sigma) 와 sample (10배 및 20배 희석 액)을 측정하여 E. coil LPS와 동일한역 가를 가지 도록 조정하여 Bacteroides helcogenes와 Fuso bacterium var/tzm으로부터 50 의 lipopolysaccha- ride를 제조하였다(Fig. 1 및 Fig. 2).
를 세어서 계산하였다. 종 백혈구수(total leucocyte co- unt)는 Eppendroff tube에 자궁세척액과 Turk solution을 1:3으로 희석하여 적혈구를 용혈시킨 후 Hemocytometer 4개의 large square에서 전체 백혈구를 세어 계산(백혈구수xlCM0a)= 백혈구수/ ml)하였다. PMNL viability test는 자궁세척액과 Trypan blue(0.
24시간 배양하였다. 혐기배지에서 자란 균의 colony# 따서 Mac, BHI+B, BHI 배지에 배양한 후 Gram stain을 실시하였고 BHI 배지에서 자란 균의 colony를 따서 BUA+B 배지에 계대배양하였으며 BUA+B 배지에서 자란 균 중에 가장 마지막으로 자란 균을 따서 AN-IF에 넣고 탁도를 63%T로 맞춘 후 Biolog용 AN micro plate 에 100ul씩 분주하였다. 분주한 plate를 37°C 혐기 chamber 에서 20~24시간 동안 배양한 후 Biolog(Microstation, USA)를 실시하여 6두의 비정상자궁에서 공통적으로 존재 하는 미 생 물인 Bacteroides helcogenes와 Fusobacterium varium을 검출하였다.
대상 데이터
LPS 처리후 번식성적을 조사하기 위하여 2회 이상 인공수정을 실시하여도 수태가 되지 않은 개체를 대상으로대조구 3두 및 처리구 5두를 공시하였다. 처리구는 Singh 등(2000) 의 방법 에 따라 Bacteroids helcogenes와 Fusobac- terium van&m으로부터 분리한 LPS 100 pig을 PBS 용액 35 ml에 희석하여 수정란 이식용 카테타로 자궁 내에 무균상태를 유지하면서 주입 .
데이터처리
본 연구에서 얻어진 실험 자료의 통계처리는 MINI TAB™ 을 이용하여 평균간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
3두 및 처리구 5두를 공시하였다. 처리구는 Singh 등(2000) 의 방법 에 따라 Bacteroids helcogenes와 Fusobac- terium van&m으로부터 분리한 LPS 100 pig을 PBS 용액 35 ml에 희석하여 수정란 이식용 카테타로 자궁 내에 무균상태를 유지하면서 주입 . 관류하였고, 대조구는 PBS 용액 35 ml만을 주입하였다.
성능/효과
PMNL의 비율은 Table 2에서 보는 바와 같이 처리전(0 시간째)에는 대조구 및 처리구가 각각 41.0% 및 47.2%였으나 24시간째에는 41.7% 및 72.1%, 48시간째에는 41.0% 및 81.6%, 72시간째에는 44.3% 및 79.0%로 24시간째, 48 시간째 및 72시간째에 공히 처리구가 대조구에 비하 여유의 적(/X0.01)으로 높은 경향을 나타내었다.
PMNL의 생존율은 Table 3에서 보는 바와 같이 처리 전(0시간째)에는 대조구와 처리구가 각각 55.3% 및 42.9% 였고 24시간째에는 82.7% 및 73.0%, 48시간째에는 94.3% 및 91.6%, 72시간째에는 75.3% 및 66.6%로 시간이 경과함에 따라 대조구와 처리구간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
이상에서 세포벽 구성 성분이 Gram-negative로서 lipo- polysaccharide를 가지고 있는 미생물(Scanlan, 1988)인 Bacteroides와, Fusobacteriiun으로부터 분리한 LPS 100 pig 을 PBS 용액 35 ml에 희석하여 자궁 내에 주입한 후 관류액을 분석하여 LPS 처리전 (0시간째), 6시간째, 24시간째, 48시간째 및 72시간째와 같이 시간의 경과에 따른 총 백혈구의 수, PMNL의 비율, PMgL의 생존율 및 탐식 PMNL의 비율 등에 대하여 대조구와 비교분석을 하여보았는데 이전에 발표되었던 보고(Singh 등, 2000)와 PM- NL의 비율에 있어서는 일치하는 경향을 보였고 탐식 PMNL의 비율에 있어서는 비슷한 경향을 나타내었다. 그러나 총백혈구의 수 및 PMT^의 생존율에 있어서는 차이를 나타내었다.
후속연구
그러나 총백혈구의 수 및 PMT^의 생존율에 있어서는 차이를 나타내었다. 이는 개체간의 면역 반응에 대한 차이에 기인된 것으로 사료되므로 금후에는 좀더 많은 공시 축을 확보하여 분석에 사용함으로써 보다 정밀한 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
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