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문제 정의
- 따라서 KACC에서는 서론에서 소개한 바와 같이 보유한 모든 균주에 대한 rDNA-ITS를 포함한 분류용 유전자의 염기서열을 분석하여 균주의 동정에 이용하고 나아가 이들을 데이터베이스화하여 상동성검색(BLAST 검색)이 가능하도록 제공하고자 한다. 아울러 KACC에 기탁되는 모든 균주에 대해서도 정식으로 등록하기 이전에 그들의 유전자 염기서열을 분석하여 동정을 확인하고 KACC에 등록하고자 한다.
- gloeosporioides 39 균주에서 흥미로운 결과를 얻었다. 이에 C. gloeosporioides와 이와 형태적으로 구분이 명확하지 않은 C. acutatum의 분류용 유전자 염기서열분석과 배양적 특성에 의한 종의 재동정 결과를 소개하그자 한다.
제안 방법
- GTG ACC CTT GGC-3') (Glass and Donaldson1995)를 사용하였다. ITS 영 역의 증폭을 위하여 2.5 mMdNTP 3 yil, 10X buffer 5100 uM primer 0.4)i/, 1.5 unit/g/ Taq DNA polymerase(SolGent Co., Ltd.) 0.3 \xl, genomic DNA 1 ul를 멸균수와 함께 혼합하여 최종 volume 을 50 로 하였다. PCR 조건은 95°C에서 predenaturation 4분 후에 95°C에서 denaturation 1분, 58°C에서 annealing 1분, 7TC에서 extension 2분을 35회 반복하고 최종 72°C 에서 extension 7분하여 ITS1, 5.
- 3 \xl, genomic DNA 1 ul를 멸균수와 함께 혼합하여 최종 volume 을 50 로 하였다. PCR 조건은 95°C에서 predenaturation 4분 후에 95°C에서 denaturation 1분, 58°C에서 annealing 1분, 7TC에서 extension 2분을 35회 반복하고 최종 72°C 에서 extension 7분하여 ITS1, 5.8S, ITS2 영역과 일부의 18S와 28S 영역을 포함한 약 570 bp의 단일밴드를 증폭시켰다. B-tubulin의 reaction mixture는 프라이머를 제외하고는 ITS의 경우와 동일하였고, PCR 조건 역시, annealing 64°C를 제외하고는 ITS와 동일한 조건으로 exon l~Intron 6 영역과 일부의 exon 6 영역을 포함하는 약 750 bp의 밴드를 증폭시켰다.
- PDA 배지와 Benomyl 배지에서 생장 측정. 분자적 분석 결과 C.
- 1 Cycle Sequence Kit(ABI 0401041)를 사용하여 sequencing PCR 반응을 하였고 반응에는 증폭에 사용한 것과 동일한 prime를 사용하였다. Sequencing PCR 산물을 Montage SEQ96 Sequencing Reaction Cleanup Kit(Millipore Corp., Bedford., LSKS 096 24)로 정재한 후 ABI 3100 DNA Sequencer* 사용하여 염기서열을 해독하였다. 해독한 염기서열은 DNASTAR 의 Seqmanll 를 이용하여 정리한 후에 MEGA v3.
- acutatum/C. gloeosporioides의 분류적인 특징과 국내 주요 기주별 분포 둥에 대하여 고찰하였다.
- 8S, ITS2 영역만을 이용하여 계통수를 작성하고 P-tubulin 은 exon 3~Intron 6 영역과 일부의 exon 6 영역을 이용하여 계통수를 작성하여 1, 000회의 bootstrap 분석을 통해 신뢰도를 평가하였다. 국내균주의 분류학적 위치를 비교하기 위해서 NCBI GenBank의 염기서열을 획득하여 함께 유연관계도를 작성하였다.
- 작성. 균주를 Potato Dextrose Broth(PDB)에 접종하고 25oC에서 3일간 진탕배양하여 균사체를 수확하였다. 1.
- PDA 배지와 Benomyl 배지에서 생장 측정. 분자적 분석 결과 C. 잉oeosporioides나 C. acutatum으로 예상되는 39 균주를 cork borer(06 mm)로 균사체 일부를 포함한 배지를 취하여 PDA배지 중앙에 접종한 후 25°C에서 5일 동안 암배양하고 균총의 직경을 측정하였다(Fig. 3A). 이와 함께 C.
- 따라서 KACC에서는 서론에서 소개한 바와 같이 보유한 모든 균주에 대한 rDNA-ITS를 포함한 분류용 유전자의 염기서열을 분석하여 균주의 동정에 이용하고 나아가 이들을 데이터베이스화하여 상동성검색(BLAST 검색)이 가능하도록 제공하고자 한다. 아울러 KACC에 기탁되는 모든 균주에 대해서도 정식으로 등록하기 이전에 그들의 유전자 염기서열을 분석하여 동정을 확인하고 KACC에 등록하고자 한다.
- acntahim의 구별에 사용되는 Benomyl-PDA에서의 생장량도 측정하였다. 위와 동일한 방법으로 균사체 일부를 취하여 PDA에 Benomyl [벤 레이트 수화제; 신젠타 코리아(주)]을 각각 0.5 mg/m/, 2 mg/m/* 첨가한 배지에 치상하여 25°C에서 5일간 암 배양한 후에 균총의 직경을 측정하였다(Table 1, Fig. 3B).
- 3A). 이와 함께 C. gloeosporioides와 C. acntahim의 구별에 사용되는 Benomyl-PDA에서의 생장량도 측정하였다. 위와 동일한 방법으로 균사체 일부를 취하여 PDA에 Benomyl [벤 레이트 수화제; 신젠타 코리아(주)]을 각각 0.
- 증폭된 유전자는 PCR96 Cleanup Plates(Millipore Corp., Bedford., MA 01730)로 정재한 후 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit(ABI 0401041)를 사용하여 sequencing PCR 반응을 하였고 반응에는 증폭에 사용한 것과 동일한 prime를 사용하였다. Sequencing PCR 산물을 Montage SEQ96 Sequencing Reaction Cleanup Kit(Millipore Corp.
- , LSKS 096 24)로 정재한 후 ABI 3100 DNA Sequencer* 사용하여 염기서열을 해독하였다. 해독한 염기서열은 DNASTAR 의 Seqmanll 를 이용하여 정리한 후에 MEGA v3.1 의 Neighbor-Joining(NJ) (Kumar 등, 2004) 의 방법을 이용하여 ITS는 18S와 28S 영역을 제외한 ITS1, 5.8S, ITS2 영역만을 이용하여 계통수를 작성하고 P-tubulin 은 exon 3~Intron 6 영역과 일부의 exon 6 영역을 이용하여 계통수를 작성하여 1, 000회의 bootstrap 분석을 통해 신뢰도를 평가하였다. 국내균주의 분류학적 위치를 비교하기 위해서 NCBI GenBank의 염기서열을 획득하여 함께 유연관계도를 작성하였다.
대상 데이터
- truncatum/C. dematium RG12에 위치하였다. 국외의 미생물자원센터로부터 C.
- PDA 배지와 Benomyl 배지에서 생장 측정. rDNA ITS 와 p-tubulin 유전자의 유연관계도(Fig. 1, 2)에서 C. acutatum 그룹에 소속되었던 19 균주는 PDA 배지에서 5 일간 27〜45(평균 38.1) mm 생장하였다(Table 1, Fig. 3). 반면에 C.
- 공시균주의 rDNA-FTS영역을 증폭하기 위해 White 등 (1990)이 사용한 primer ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3)과 ITS4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3)를 사용하였고 p-tubulin 영역의 증폭을 위해서는 T1(5'-AAC ATG CGT GAG ATT GTA AGT-3') (O'Donnell and Cigelnik 1997)과 bt2b(5'-ACC CTC ACT GTA GTG ACC CTT GGC-3') (Glass and Donaldson1995)를 사용하였다. ITS 영 역의 증폭을 위하여 2.
- 한국농업 미 생 물자원 센 터 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 보존되어 있는 Colletotrichum gloeo sporioides 39 균주와 C. acutatum 5 균주를 ribosomal DNA-ITS와 8-tubulin 부분염기서열과 PDA와 Benomyl-PDA배지에서의 생장 특성에 의하여 재동정 하였다. 그 결과 13 균주가 Talhinhas 등의 C.
-
사용균주. 한국농업 미 생 물자원센터 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 보유하고 있는 C. gloeo- spofioides와 C. acutatum 44 균주(국내 31 균주, 국외도입 13 균주)를 실험에 사용하였으며 분리지역, 분리기주, 분리일자 등의 자세한 내용은 Table 1에 요약되어 있다. 균주들은 Potato Dextrose Agar(PDA) 사면배지에 배양하여 4
이론/모형
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- acutatum strains held in KACC. The tree was constructed from Neighbor-Joining analysis of rDNA-ITS sequence. ITS sequence of C.
성능/효과
- 이에 KACC에서는 2005년부터 분류용 핵심유전자의 염기서열을 포함한 분자생물학적 특성평가와 형태적 특성평가를 통하여 보유 군주에 대한 재동정을 실시하고 있다. 127 균주를 보유하고 있는 Conetotrichum속균에 대한 재동정을 실시하던 중에 C. gloeosporioides 39 균주에서 흥미로운 결과를 얻었다. 이에 C.
- gloeosporioides 로 동정되었다. C. acutatum과 C. gloeosporioides^ 조성과 국내의 지역과 균주의 분리년도와는 특별한 상관관계를 보이지 않았다.
- gloeosporioides 그룹인 RG4에 속 하였고 각각 2 균주가 RG5, 6에 속하였다. C. gloeosporioides 로 동정된 균주들은 CBS 510.97(39 mm) 제외하고는 모 두 55~6%평균 59.5) mm 생장하여 C. acutatum(45 mm 이 하)보다 빠른 성장을 보였다. Benomyl 배지에서 생장은 대부분이 감수성을 나타내었으나 6 균주는 0.
- acutatum 의 유전적 거리보다 더 큰 것을 고려한다면 Genealogical Concordance Phylogenetical Species Recognition(GCPSR) 개념 (Taylor 등, 2000; Hong 등, 2005)에 따라 RG6 역시 신종으로 분리되어야 마땅할 것으로 생각된다. 결국 KACC 가 보유한 Colletotrichum 균 중에서 RG4에 속한 18 균주만이 C. gloeosporioides이며 RG5의 두 균주는 C. borinense로 명명하여야 마땅할 것이며, RG6의 두 균주는 우선은 C. gloeosporioides로 명명할 수밖에 없으나 결국 다른 학명으로 바뀌어 질 것으로 예상된다.
- acutatum 5 균주를 ribosomal DNA-ITS와 8-tubulin 부분염기서열과 PDA와 Benomyl-PDA배지에서의 생장 특성에 의하여 재동정 하였다. 그 결과 13 균주가 Talhinhas 등의 C. acutatum A2 그룹으로, 5 균주가 C. acutatum A3 그룹으로, 1 균주가 C. acutatum A4 그룹으로, 18 균주가 Moriwaki 등의 C. gloeosporioides ribosomal DNA group(RG) 4로 2 균주가 C. gloeosporioides RG6로 2 균주가 C. boninense RG5로 2 균주는 C. coccodes RG2 그리고 1 균주는 C. dematium RG12 로 재동정되었다. 이들 중에서 한국에서 분리된 31 균주는 12 균주가 C.
- dematium 1 균주로 재동정되었다. 보유균주의 한계로 종합적인 결론을 도출하기는 어렵지만 국내 균주의 경우에기주에 따른 C. gloeosporioides와 C. 의 분포를 보면 고주에서 분리된 균주는 6 균주가 C. 이었고 2 균주가 C. g/oeosporioides였는데 딸기와 스타티스의 경우는 3 균주 모두가 C. g/oeosporioides이었다(Table 1). 한편 사과에서 분리된 5 균주는 2 균주가 C.
- 위의 분류기준에 의하면 C. gloeosporioides KACC에 기탁된 39 균주 중에서 rDNA-ITS와 P-tubulin 유전자 계 통도(Fig. 1, 2)에서 C. acutatum A2~6 그룹에 속하였던 14 균주는 C. acutatum으로 동정된다고 말할 수 있다. 이 들 분자적 동정결과는 PDA 배지에서의 생장속도와 Benomyl 에 대한 반응성에서도 대체적으로 일치하였는데 C.
- acutatum으로 동정된다고 말할 수 있다. 이 들 분자적 동정결과는 PDA 배지에서의 생장속도와 Benomyl 에 대한 반응성에서도 대체적으로 일치하였는데 C. acutatum 으로 재동정된 균주들은 PDA 배지에서 5일간 배양하였 을 때 45 mm 이 하(평 균 38.1 mm)의 생 장을 보였으며 Benomyl에 대하여 중도저항성을 보였다(Table 1, Fig. 3). C.
- dematium RG12 로 재동정되었다. 이들 중에서 한국에서 분리된 31 균주는 12 균주가 C. acutatum A2 그룹으로, 1 균주가 C. acutatum A3 그룹으로, 14 균주가 C. gloeosporioides RG4 로 2 균주가 C. gloeosporioides RG6로 1 균주가 C. boninense RG5로 그리고 1 균주는 C. dematium RG12로 동정 되었다. 더불어 C.
- gloeosporioides ribosomal DNA 그룹(RG) 4, 5, 6에 속하였다. 이들 중의 대부분인 18 균주는 전형적인 C. gloeosporioides 그룹인 RG4에 속 하였고 각각 2 균주가 RG5, 6에 속하였다. C.
- 이상과 같이 C. gloeosporioides 39 균주와 C. acutatum 5 균주는 C. gloeosporioides 20 균주, C. acutatum 19 균주, C. boninense 2 균주, C. coccodes 2 균주 그리고 C. dematium 1 균주로 재동정되었다. 보유균주의 한계로 종합적인 결론을 도출하기는 어렵지만 국내 균주의 경우에기주에 따른 C.
- 의 분류적인측면을 고찰할 때 rDNA-ITS DNA 염기서열에 의하여 두 종이 명확히 구분되었으며 p-tubulin 부분 염기서열 또한 ITS와 동일한 구분을 할 수 있었다. 하지만 본 실험의 결과에서는 C. gloeosporioides RG4의 18 균주 중에서 1 균주(CBS 510.97)의 성장이 C. acWamm의 성장범위와 겹치고 6 균주가 Benomyl에 대하여 중도저항성을 나타냄으로서 PDA와 Benomyl-PDA에서 생장특성이 두 종을 구분할 수 있다고 한 Talhinhas 등(2002)의 주장은 항상 옳은 것은 아닌 것으로 나타났으며 따라서 이들 특성들은 두 종을 구분하는 참고적인 특징으로만 사용할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서 rDNA-ITS와 P-tubulin 유전자 염기서열이 현재까지는 이 종을 구분할 수 있는 결정적인 특징으로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
- g/oeosporioides이었다(Table 1). 한편 사과에서 분리된 5 균주는 2 균주가 C. acutatum이었고 2 균주가 C. gloeosporioides였다. 국내 재배 고 주의 경우 탄저병의 주요 원인균이 C.
- 한편으로 C. gloeosporioides와 C. 의 분류적인측면을 고찰할 때 rDNA-ITS DNA 염기서열에 의하여 두 종이 명확히 구분되었으며 p-tubulin 부분 염기서열 또한 ITS와 동일한 구분을 할 수 있었다. 하지만 본 실험의 결과에서는 C.
후속연구
- acWamm의 성장범위와 겹치고 6 균주가 Benomyl에 대하여 중도저항성을 나타냄으로서 PDA와 Benomyl-PDA에서 생장특성이 두 종을 구분할 수 있다고 한 Talhinhas 등(2002)의 주장은 항상 옳은 것은 아닌 것으로 나타났으며 따라서 이들 특성들은 두 종을 구분하는 참고적인 특징으로만 사용할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서 rDNA-ITS와 P-tubulin 유전자 염기서열이 현재까지는 이 종을 구분할 수 있는 결정적인 특징으로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 그리고 RG6 균주는 oblong의 분생포자를 형성하며 PDA 배지에서 자낭각 (perithecium)을 쉽게 만드나 RG4와 형태적으로 명확하게 구분되지 않는 것으로 보고하였디-. 하지만 RG6와 RG4의 rDNA-ITS와 g-tubulin에서 유전적 거리가 RG4와 C. acutatum 의 유전적 거리보다 더 큰 것을 고려한다면 Genealogical Concordance Phylogenetical Species Recognition(GCPSR) 개념 (Taylor 등, 2000; Hong 등, 2005)에 따라 RG6 역시 신종으로 분리되어야 마땅할 것으로 생각된다. 결국 KACC 가 보유한 Colletotrichum 균 중에서 RG4에 속한 18 균주만이 C.
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