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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국내 국화 시설재배지에서 분포하고 있는 식물기생선충 상을 조사하고 그 중에서도 대표 종이라고 할 수 있는 뿌리썩이선충의 지역별 대표 군들을 선정하여 ITS-1과 28S 라이보좀 DNA 특징들을 이용하여 뿌리썩이선충의 분자생물학적인 종 동정법에 활용이 될 수 있는 방법을 제시하고자 한다.
가설 설정
- , Valencia, CA)를 이용하여 뿌리썩이선충 암컷 한 마리로부터 전체 genomic DNA를 분리하였으며, 그 방법은 다음 순서와 같다 1) 뿌리나 토양W서 분리된 선충은 일차적으로 살균 수에 여러번 헹구어 표면의 불순물을 제거한다. 2) 그런 다음 ATL buffer, 180 니1와 proteinase K, 20 ul를 섞은 용액을 microcentrifUge tube에 넣고 현미경하에서 건져 올린 선충을 옮긴다 3) 선충이 옮겨진 tube는 55℃ 항온수조에서 3시간 incubation 한다. 4) AL buffer, 200 ul를첨가하여 다시 70℃에서 10분간 incubation한다.
제안 방법
- PCR 증폭된 D3-28S ribosomal DNA는 PCR purification kit (QIAGEN, Valencia, CA)를 이용하여 DNA를 泌 분리한 다음, 코아바이오 sequencing lab에 염기서열 분석을 의뢰하였다 그 결과 각 지역별로 얻어진 뿌리썩이선충의 D3-28S DNA data는 DNASTAR Lasergene ver 6.0에 있는 MegAlign의 Clustal W 프로그램을 이용하여 multiplealignmente- 하였고 이를 기준으로 한 phylogenetic tree# 형성하였다. 또한 sequence간의 유사도와 차이점은 'Percent identity 및 divergence5 표를 참고로 하여 비교하였다.
- D3-28S 부분은 위의 동일 조건에서 annealing 온도를 62℃로 조정하였다. PCR 프로그램은 DNA thermal cycler PTC-0200 (MJ Research Inc. Waltham MA)을 이용하여 성공적으로 수행되 었으며 증폭 된 DNA는 1.2% agarose gel상에서 전기영동을 통하여 확인하였다.
- QIAGEN의 DNeasy tissue kit (QIAGEN-Inc., Valencia, CA)를 이용하여 뿌리썩이선충 암컷 한 마리로부터 전체 genomic DNA를 분리하였으며, 그 방법은 다음 순서와 같다 1) 뿌리나 토양W서 분리된 선충은 일차적으로 살균 수에 여러번 헹구어 표면의 불순물을 제거한다. 2) 그런 다음 ATL buffer, 180 니1와 proteinase K, 20 ul를 섞은 용액을 microcentrifUge tube에 넣고 현미경하에서 건져 올린 선충을 옮긴다 3) 선충이 옮겨진 tube는 55℃ 항온수조에서 3시간 incubation 한다.
- 0에 있는 MegAlign의 Clustal W 프로그램을 이용하여 multiplealignmente- 하였고 이를 기준으로 한 phylogenetic tree# 형성하였다. 또한 sequence간의 유사도와 차이점은 'Percent identity 및 divergence5 표를 참고로 하여 비교하였다.
- vulnus 등 일반적으로 많이 분포하는 6종의 뿌리썩이선충을 동정할 수 있는 방법을 제시하기도 하였다. 비슷한 방법이지만 D3가 아닌 다른 ribosomal DNA를 이용하여종 특이적 인 primer를 개발하여 P. coffeae왁 P. loo si를 구별화한 빙.법이 있으며(Uehara et al.
- 뿌리썩이선충 암컷 한 마리로부터 전체 genomic DNA를 추출하고, PCR의 template DNA로 이용하였다. ITS 증폭 실험에서는 PCR 결과 48℃ annealing 온도조건하에서 '마산', '구미', '태안', 정읍 지역의 뿌리썩이선충에서는 약 800 bp 크기의 ITS가 증폭되었지만, '무안 isolate는 이보다 200 bp가 큰 1 kb 크기로 증폭되었다 따라서, 무안계통은 타 지역의 뿌리썩이선충들과 일차적으로 ITS 크기에서 차별화 되었다.
- 한편, D3-28S ribosomal DNA는 62℃ annealing 온도의 PCR 조건하에서 성공적으로 증폭되었으며 그 크기는 모든 지역의 뿌리썩이선충에서 약 320 bp 크기로 동일하게 나타났다. 증폭된 DNA는 PCR purification system kit를 이용해 DNA만을 순수 분리한 후 Corebio의 sequencing Lab에 염기서열을 분석 의뢰를 하였다.
- 채집한 시료로부터 선충을 분리하기 위해서 우선 토양과 국화 뿌리는 각각 나누어 처리하였다. 토양의 경우 흙 200 cc를 정량하叫 60 mesh와 400 mesh 체에서 순서대로 거른 다음, 설탕물을 이용한 원심분리법으로 선충을 분리하였다.
대상 데이터
- DNA 분석 실험을 위한 뿌리썩이선충은 전국에서 채집한 시료 중에서 각 도별 대표지역을 선정하여 분리한 선충을 사용하였다. 선정된 지역은 '마산'(경남), '구미(경북), '무안'(전남), '정읍'(전북), '태안'(충남)으로 총 5개 지역이다 각 지역에서 분리한 선충은 소국(spray 국화)에 재접종하여 온실에서 유지 .
- 국화포장에서 발생하는 선충 조시를 위하여 2005년 5월과 6월에 걸쳐 경남 지역의 부산, 마산, 김해, 창원에서 32개 시료, 전남지역의 무안, 광주에서 10개, 전북 정읍에서 2개, 충남 태안에서 6개 등 총 50개 포장에서 국화 뿌리와 토양을 채취하였다 또한 DNA 분석을 위한 경북지역의 시료를 추가하기 위하여 구미 원예수출공사에서 채집 한국화에서 뿌리썩이선충을 분리하여 분석에 이용하였다.
- 사용하였다. 선정된 지역은 '마산'(경남), '구미(경북), '무안'(전남), '정읍'(전북), '태안'(충남)으로 총 5개 지역이다 각 지역에서 분리한 선충은 소국(spray 국화)에 재접종하여 온실에서 유지 . 증식하였다.
데이터처리
- 얻어진 D3-28S DNA 염기서열은 DNASTAR의 MegAlign 프로그램을 이용하여 분석하였다. Primer 부분을 제외한 증폭된 전체 D3 DNA 크기는 300-303 bp 범위 내에 속하였다.
이론/모형
- Shiga, Japan), 그리고 5 p.1 DNA template를 포함하여 총 50 μ1의 반응 용액을 준비하였다 ITS 증폭을 위하여는 Ferris 등(1993)이 고안한 forward primer, 5, -CGTAA-CAAGGTAGCTGTAG3와 reverse primer 5, -TCCT-CCGC TAAATGATATG3를 선택하였고, D3-28S rDNA 의 증폭을 위해서는 Baldwin 등(1997)이 고안한 D3A, forward primer, 5'・GACC CGTCTTGAAACACGGA-3'와 D3B, reverse primer 5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA・3' 를 이용하였다. ITS 부분의 PCR 증폭을 위한 적정 조건은 초기 95℃ 5분간 denaturation과 이어진 95℃, denaturation L분/48 ℃, annealing 30초/72 ℃, extension 1분으로 구성된 총 35 cycle, 그리고 마지막 72℃에서의 10분간 Phylogenetic tree based on D3-28S ribosomal DNA sequence from different species and isolate of Pratylenchus spp. The tree was constructed by using MegAlign program in DNASTAR.
- 토양의 경우 흙 200 cc를 정량하叫 60 mesh와 400 mesh 체에서 순서대로 거른 다음, 설탕물을 이용한 원심분리법으로 선충을 분리하였다. 국화 뿌리는 물에 깨끗이 씻은 다음 표면의 물기를 제거한 후 가위로 0.5 cm 크기로 잘게 잘라 1 g 을 정량하여 변형깔대기법(Modified Baermann funnel) (Hooper, 1990)을 이용하여 48시간동안 체에 올려둔 다음 선충을 분리하였다 각각의 방법에서 분리한 선충은 해부현미경하에서 속별로 계수하였다.
성능/효과
- vulnus와 가장 높은 유사도를 나타내 었다. '구미'와 '태안'의 경우 상호 유사도가 100%로서 완전히 일치함을 알 수 있었고, '정읍'의 경우는 '구미', '태안' isolate와 99.7%의 유사성을 가지고 있었다. P.
- ) 이 60%, 참선訊万어s sp.) 30% 순으로 조사되었다 뿌리썩이선충은 지역별 차이가 크지 않고, 전국적으로 고르게 분포하고 있는 것으로 나타났으나, 일반적으로 재배 연수가 10년 이상의 재배 농가의 경우 연작 장애와 더불어 수세가 약해진 포장에서 선충의 밀도가 높게 나타났다 특히, 부산, 김해 지역은 염류 집적에 의해서 작물의 수세가 약해짐에 따라 흰녹병 등의 지상부 식물병해와 더불어 토양의 선충 피해도 증가하는 경향을 나타내었다. 마산 지역은 국내에서 가장 오래된 국화재배지역으로 비교적 최근의 대규모 시설단지가 형성된 부산, 김해와는 다르게 소규모의 재배 농가들이 산발적으로 비닐하우스 단지를 형성하고 있었는데, 이 곳에서는 재배 기간이 30~40년 이상 된 농가들이 많았고 이들 대부분의 농가에서는 뿌리썩이선충이 검출되었다.
- 1) 뿌리나 토양W서 분리된 선충은 일차적으로 살균 수에 여러번 헹구어 표면의 불순물을 제거한다. 2) 그런 다음 ATL buffer, 180 니1와 proteinase K, 20 ul를 섞은 용액을 microcentrifUge tube에 넣고 현미경하에서 건져 올린 선충을 옮긴다 3) 선충이 옮겨진 tube는 55℃ 항온수조에서 3시간 incubation 한다.
- 국내의 경우 户. vulnus 와 가까운 종으로 나타난 '구미', '태안', '정읍' isolate와 P. penetrans와 일치하는 종으로 나타난 ‘마산 isolate의 경우 Si의 결과와 동일한 0.8 kb에서 PCR 증폭이 되 었다 새로운 사실은 P. bmchy讨us와 거의 유사하게 나타난 , 무안, isolate의 경우 P. cqffkae와 동일한 1.0 kb에서 증폭이 있었다는 점이다. Orui의 보고에 의하면, Alu I, Dde I, Hha I, Hinf I 등의 제한효소를 이용한 polymorphism을 이용하면 P- vulnus, P.
- 7%의 유사도를 나타내었다. 따라서 이상의 결과로 볼 때 우리나라 주요 지역별 국화재배지의 뿌리썩이선충 종은 P. vulnus, P. penetrans, P. brach:沖ws와 동일하거나 근연종임을 확인할 수 있었다. 이와 같은 사실은 Fig.
- 1). 이 중에 뿌리썩이선충이 전체 50개 시료 중 43개 시료에서 검출됨으로써 86%의 검출율을 나타내며 가장 높은 분포를 나타내었다. 그 다음으로는 침선충 (Paratylenchus sp.
- 이상의 결과로 볼 때 D3-28S ribosomal DNA는 형태적인 구별이 어려운 뿌리썩이선충의 종간 특성이 잘 보존되어 있는 유전자 마커라고 할 수 있다. 이와 같은 특성을 이용하여 2004년 Al-Banna 등은 D3-28S ribosomal DNA 에서, 종 특이적인 primer, 를 고안하여 P.
- 전국 국화재배지 50개 포장에서 수집한 토양 시료를 조사한 결과 총 7개 속(genus)의 식물기생선충이 검출되었다(Table 1). 이 중에 뿌리썩이선충이 전체 50개 시료 중 43개 시료에서 검출됨으로써 86%의 검출율을 나타내며 가장 높은 분포를 나타내었다.
- ITS 증폭 실험에서는 PCR 결과 48℃ annealing 온도조건하에서 '마산', '구미', '태안', 정읍 지역의 뿌리썩이선충에서는 약 800 bp 크기의 ITS가 증폭되었지만, '무안 isolate는 이보다 200 bp가 큰 1 kb 크기로 증폭되었다 따라서, 무안계통은 타 지역의 뿌리썩이선충들과 일차적으로 ITS 크기에서 차별화 되었다. 한편, D3-28S ribosomal DNA는 62℃ annealing 온도의 PCR 조건하에서 성공적으로 증폭되었으며 그 크기는 모든 지역의 뿌리썩이선충에서 약 320 bp 크기로 동일하게 나타났다. 증폭된 DNA는 PCR purification system kit를 이용해 DNA만을 순수 분리한 후 Corebio의 sequencing Lab에 염기서열을 분석 의뢰를 하였다.
후속연구
- 종 특이적 프라이머의 제작으로 종 동정에 이용할 수가 있고 sequence data 그 자체로서 새로운 종이나 변이 종의 특성을 제시할 수도 있기 때문에 유용한 정보로서 가치가 있다. 따라서 본 논문에서 제시한 Pratylenchus 의 D3-28S rDNA와 ITS의 복합적인 정보는 국내에서는 처음으로 다루어진 Pratylenchiis의 유전적 특징으로서 의의가 있으며, 향후 국화뿐만。] 아니라 다양한 기주와 다양한 지역의 뿌리썩이선충의 분류 및 동정을 위한 기초 자료로 활용될 것으로 기대한다.
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