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문제 정의
- 본 연구에서는 유전자 발현 조절 수준에서 멜라닌 색소 생합성에 관여하는 효소로 알려진 티로시나아제의 생합성 억제 물질을 탐색하고자 항산화 효과를 비롯하여 생리활성효과가 우수한 것으로 알려진 복분자로부터 물질을 추출.분획하여 티로시나아제 프로모터가 삽입되어 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell에 처리하여 그 프로모터의 발현 유무 및 세포독성에 미치는 효과를 조사하였다.
가설 설정
- The supernatants were used for luciferase assay. 2. Values are the means of results from triplicate experiments.
제안 방법
- B16 mouse melanoma cell 내에 tyrosinase 프로모터가 삽입된 유전자를 도입하기 위해 LipofectAMINE(Life Technologies Inc.)을 이용한 다음과 같은 방법으로 stable transfection을 실시하였다.
- B16 mouse melanoma cell 을 RPMI Medium 1640 평판배지에 세포수가 3-4 x105, 이 되도록 접종한 후 24 시간 배양한 다음, 배양액 1 mL에 6 pL LipofectAMINE과 2 μg의 total plasmid DNA를 5 시간 처리함으로써 형질전환을 실시하였다.
- Plasmid DNA는 luciferase gene을 지닌 pGL2-basic vector(Promega)의 Sami site에 1.5 Kb의 neomycin 저항성 유전자를 삽입한 다음 1 Kb의 사람 티로시나아제 프로모터를 EcdSl/KprA site에 클로닝을 하였다.
- 그 후 각각의 well에 복분자 메탄올 추출물은 10 μg/mL, 100 μg/mL, 1 mg/mL의농도로, 용매 분획물은 1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL의 농도로 6 시간 동안 처리한 다음 luciferase 활성도를 측정하여 티로시나아제 프로모터 억제에 미치는 효과를 조사하였다.
- 1). 복분자 메탄올 추출물의 농도를 각각 10 μg/mL, 100 μg/mL, 1 mg/mL로 달리하여 세포에 처리하였을 때 1 mg/mL의 고농도에서는 세포독성 이심하여 티로시나아제 프로모터의 발현율을 측정하는 것이 불가능하였지만 10 μg/mL와 100 μg/mL의 농도에서는 대조군의 약 98% 와 90%로서 티로시나아제 프로모터의 억제효과는 추출액의 처리농도에 비례하였다. 이는 티로시나아제 효소 활성을 저해하는 것으로 알려진 대황a 감초% 목단피9)등의 추출물들과는 다른 결과를 보여 주었다.
- 분말로 된 추출물 및 분획물 100 mg에 에탄올과 디메칠설퍼옥사이드(dimethyl sulfoxide)가 1:1로 혼합된 용매 1 mL씩을 가하여 완전히 용해시킨 후 여과하여 티로시나아제 프로모터의 발현능과 세포독성을 측정하는데 이용하였다.
- 물질을 추출.분획하여 티로시나아제 프로모터가 삽입되어 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell에 처리하여 그 프로모터의 발현 유무 및 세포독성에 미치는 효과를 조사하였다.
- 세포내 유전자 도입을 통해 얻은 B16 mouse melanoma cell의 형질전환 유무를 확인하기 위하여 luciferase 활성도를 측정하였다. 형질전환을 통하여 얻은 콜로니들을 Trypsin-EDTA를 처리하여 떼어낸 후 24 well plate에 세포수가 well당 6x104되게 분주하여 24.
- 시료의 추출은 건조된 생약 0.2 kg을 취한 다음 메탄올을 가하여 실온에서 1 주일 동안 정치시킨 후 3 회 추출.여과 하였다.
- 농축하여 동결건조시킨 후 분말 형태로 제조하였다. 용매분획은 분말화 된 추출물을 증류수로 현탁한 다음, 극성도가 다른 methylene chloride, ethyl acetate, butyl alcohol, 물을 이용하여 4 개의 층으로 분획하여 메탄올 추출물과 같은 방법으로 농축하였다. 그리고, 그 후 이 농축물은 동결.
- 8의 25 mM Tris-Phosphate 완충용액으로 용해하였다. 용해된 세포들을 취하여 원심분리한 다음 얻어진 상등액에 대해 Luminometer(Lumat LB 9507, Berthold)를 이용하여 luciferase 활성도를 측정하였으며 luciferase 활성도가 가장 , 높게 나타난 B16 mouse melanoma cell을 선별하여 이용하였다.
- 유전자 발현 조절수준에서 멜라닌 색소 생합성에 관여하는 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 물질을 탐색하고자 티로시나아제 프로모터를 지닌 B16 mouse melanoma cell에 복분자 메탄올 추출물을 처리하였다. 그 결과 복분자 메탄올 추출물은 100 μg/mL의 농도에서 대조군의 약 90%의 발현율로서 티로시나아제 프로모터를 억제하는 효과를 나타내었으며, 세포생존율은 1 μg/mL, 10 /zg/mL, 50 /zg/mL, 100 μg/mL의 농도에서 약 106%, 105%, 93%, 83%로서 세포독성이 매우 낮게 나타났다, Methylene chloride, butyl alcohol, 물 용매 분획물은 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 효과가 없었지 만 ethyl - acetate 용매 분획물은 티로시나아제 프로모터의 발현 억제하였으며, 특히 1003g/mL의 농도에서 대조군 세포에 비하여 약 11% 정도 억제효과가 낮게 나타났다.
대상 데이터
- B16 mouse melanoma celKATCC CRL 6323)은 10%(w/v)의 Fetal Bovine Serum(FBS, GibcoBRL), l%(w/v) Antibiotic(Gibco BRL), 그리고 2 mM의 L-Glutamine이 포함된 RPMI Medium 1640(Gibco BRL)에서 CO2 분압을 5%로 조절하여 37P에서 배양하였으며, 세포는 36-48 시간 주기로 계대배양하여 유지하였다.
- 선택배지에서. 배양한 후 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell을 선별하였다.
- 본 실험에 사용한 복분자는 2005년 11월 광주시내 한약 건재상에서 구입하여 감정한 후 사용하였으며, 표준품은 동강대학 식품건강연구소에 보관하였다.
이론/모형
- 2 × 104 되게 접종한 다음 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 복분자 메탄올 추출물을 각각의 well에 1 /zg/mL, 10 μg/mL, 50 "g/mL, 그리고 100 ug/mL의 농도로 6 시간 동안 처리한 다음 Mosmann25, S] 방법에 따라 ELISA(BioTek Inc.) 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 평가하였다.
- Then, the cells were solubilized with lysis buffer and entrifuged at 13, 000 xg for 2 ~ 3 minutes. The supernatants were used for luciferase assay. 2.
성능/효과
- 2). 복분자 메탄올 추출물을 처리하였을 때 농도의 증가에 세포의 생존율이 감소하는 결과를 보여주었으나 1 μg/mL, 10 "g/mL, 50 fig/mL, 그리고 100 μg/ml/] 농도로 처리하였을 때 세포의 생존 활성율이 대조군에 비해 각각 약 106%, 105%, 93%, 83%로 세포독성이 매우 낮게 나타났다. 따라서 복분자 메탄올 추출물은 세포독성이 낮으면서도 효소 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 효과를 보여 주는 것으로 보아 멜라닌 색소.
- 1. Transfected B16 melanoma cells were incubated with 6 x 10 34 in RPMI 1640 medium for 24 hours and treated solvent fractions of Rubus coreanum for 6 hours. Then, the cells were solubilized with lysis buffer and entrifuged at 13, 000 xg for 2 ~ 3 minutes.
- 그러나 1 mg/mL의 고농도에서는 세포독성이 심하게 나타나 methylene chloride 용매 분획물과 유사한 결과를 보여 주었다. Butyl alcohol과물의 용매로 분획하여 얻은 추출물은 ethyl acetate 용매로 분획하여 얻은 물질들과는달리 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하기 보다는 오히려 증진시키는 효과를 보여주었다. 특히, 분획물을 1μg/mL와 100μg/mL의농도로 처리하였을 때에는 대조군에 비해 약 10~20% 정도 티로시나아제 프로모터의 발현이 증진되었다.
- 그 결과 복분자 메탄올 추출물은 100 μg/mL의 농도에서 대조군의 약 90%의 발현율로서 티로시나아제 프로모터를 억제하는 효과를 나타내었으며, 세포생존율은 1 μg/mL, 10 /zg/mL, 50 /zg/mL, 100 μg/mL의 농도에서 약 106%, 105%, 93%, 83%로서 세포독성이 매우 낮게 나타났다, Methylene chloride, butyl alcohol, 물 용매 분획물은 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 효과가 없었지 만 ethyl - acetate 용매 분획물은 티로시나아제 프로모터의 발현 억제하였으며, 특히 1003g/mL의 농도에서 대조군 세포에 비하여 약 11% 정도 억제효과가 낮게 나타났다.
- 즉, 극성도가 가장 낮은 methylene chloride 용매로 분획하여 얻은 복분자 추출물은 티로시나아제 프로모터를 억제하지 못하였다. 그러나 methylene chloride 용매 분획물은 1 mg/mL의 고농도에서 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 효과를 나타내었지만 세포가 분해 될 정도로 매우 심한 독성을 나타내 그 효과는 세포독성과 밀접한 관련이 있는 것으로 확인되었다. Ethyl acetate 용매 분획물은 10 μg /mL의 농도이하에서는 티로시나아제 프로모터를 억제하는 효과를 보여주지 못했지만 100 μg/mL의 농도에서는 메탄올 추출물과 유사한 억제 효과를 보여 주었다.
- 복분자 메탄올 추출물을 처리하였을 때 농도의 증가에 세포의 생존율이 감소하는 결과를 보여주었으나 1 μg/mL, 10 "g/mL, 50 fig/mL, 그리고 100 μg/ml/] 농도로 처리하였을 때 세포의 생존 활성율이 대조군에 비해 각각 약 106%, 105%, 93%, 83%로 세포독성이 매우 낮게 나타났다. 따라서 복분자 메탄올 추출물은 세포독성이 낮으면서도 효소 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 효과를 보여 주는 것으로 보아 멜라닌 색소.생합성을 억제하는 우수한 물질로 추측된다.
- 즉 대황, 감초, 목단피 등의 추출물은 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하기 보다는 오히려 증진시키는 결과를 보여 주었으나, 복분자 메탄올 추출물은 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 효과를 나타내었다. 따라서 복분자 메탄올 추출물은 유전자 발현 조절수준에서 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 것으로 보아 멜라닌 색소의 생합성을 보다 효과적으로 제어할 수 있는 천연물질이라 판단된다.
- 세포내 유전자 도입을 통하여 제조된 B16 mouse melanoma cell에 복분자 메탄올 추출물을 처리하여 티로시나아제 프로모터의 발현유무를 조사한 결과, 복분자 메탄올 추출물은 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 효과를 나타냈다(Fig. 1). 복분자 메탄올 추출물의 농도를 각각 10 μg/mL, 100 μg/mL, 1 mg/mL로 달리하여 세포에 처리하였을 때 1 mg/mL의 고농도에서는 세포독성 이심하여 티로시나아제 프로모터의 발현율을 측정하는 것이 불가능하였지만 10 μg/mL와 100 μg/mL의 농도에서는 대조군의 약 98% 와 90%로서 티로시나아제 프로모터의 억제효과는 추출액의 처리농도에 비례하였다.
- 그리고 이들 용매분획물들의 세포독성 또한 매우 낮게 나타났다. 이 와 같은 결과를 통해서 '우리는 4가지 복분자 용매 분획물들 중에서 ethyl acetate 용매 분획물만이 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제시키는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이는 Chin 등16)이 보고한 율피 메탄올 주출물과는 약간 다른 결과를 보여 주는 것으로서 복분자내에 함유되어 있는 티로시나아제 프로모터의 억제 성분들은 비교적 극성도가 낮은 물질이라 추측되어진다.
- 이는 티로시나아제 효소 활성을 저해하는 것으로 알려진 대황a 감초% 목단피9)등의 추출물들과는 다른 결과를 보여 주었다. 즉 대황, 감초, 목단피 등의 추출물은 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하기 보다는 오히려 증진시키는 결과를 보여 주었으나, 복분자 메탄올 추출물은 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 효과를 나타내었다. 따라서 복분자 메탄올 추출물은 유전자 발현 조절수준에서 티로시나아제 프로모터의 발현을 억제하는 것으로 보아 멜라닌 색소의 생합성을 보다 효과적으로 제어할 수 있는 천연물질이라 판단된다.
- 형질전환 된 B16 mouse melanoma cell에 각각의 복분자 용매 분획물을 처리한 결과 티로시나아제 프로모터의 발현은 용매 분획물에 따라 다양한 양상을 나타내었다(Table 1). 즉, 극성도가 가장 낮은 methylene chloride 용매로 분획하여 얻은 복분자 추출물은 티로시나아제 프로모터를 억제하지 못하였다.
후속연구
- 본 연구결과 복분자 추출물에는 멜라닌색소 생합성 초기반응에 관여하는 효소 인티로시나아제의 프로모터 발현을 억제하는 효과가 높은 성분이 함유하고 있다는 것이 확인 되었으며, 앞으로 보다 많은 연구를 통하여 복분자가 미백 화장품 및 의약품의 천연원료로서 산업적으로 보다 널리 이용될 것으로 기대된다.
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