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문제 정의
- 따라서 본 연구는 담배연기 중에 존재하는 aromatic amine 화합물을 분석하는데 있어서 중성이나 음이온의 방해물질을 제거하기 위한 cation exchange mechanism의 SPE cartridge 와 상대적으로 hydrophobicity 작은 방해물질을 제거하기 위한 hydophobic interaction mechanism의 SPE cartridge를 사용하여 간편하고도 분석시간이 단축되며, 정밀도와 정확도가향상된 새로운 분석법을 개발하고자 수행되었다.
- 본 연구에서는 SPE를 이용하여 담배연기 중에 함유되어있는 4종의 aromatic amine의 분석법을 확립하였다. 두 가지 다른 형태의 SPE를 사용함으로서 aromatic amine의 방해물질들을 분리하였고, 복잡한 전처리 과정도 단순화 하였다.
제안 방법
- 새로운 PFPA 유도체화 반응의 정량성과 검출 한계를 aromatic amine의 표준용액을 제조하여 GC/MS분석을 통해 알아보았다. 4종의 aromatic amine의 표준용액을 0.5 ~ 30 ng/mL의 농도로 제조하여 PFPA 유도체화를 시킨 후 GC/MS로 분석하였다. GC/MS 상에 나타난 내부표준물질과 표준물질의 peak area 비를 이용하여 검량선을 작성한 결과 결정계수(If) 는 0.
- 여기에 sodium sulfate 를 적당량 가하여 수분을 제거한 후 약 1 mL를 autosampler vial로 옮긴 다음 10 mL의 trimethylamine (TMA) 용액과 4 pL pentafluoropropionic anhydride (PFPA)를 가하였다. Dry-bath를 이용하여 80 ℃에서 30분간 반응시켜 aromatic amine을 유도체화 시킨 후 GC/MS를 이용하여 분석하였다. SPE를 이용한 clean up 과정은 Fig.
- 세번째 단계인 PFPA 유도체화는 유도체화 시간에 따른 회수율을 조사하여 최적시간을 탐색하였다. PFPA의 반응 온도인 80 ℃ 에서 5분부터 15분, 30분, 60분 및 90분의 다섯 조건으로 반응시간 별 회수율을 측정하였다. GC/MS 분석 결과 15분 이후부터는 aromatic amine의 peak area가 증가하지 않았으며, 따라서 15분이면 aromatic amine이 충분히 반응함을 알 수 있었다.
- 05 N NaOH 수용액 8 mL를 가하여 희석하였다. 다시 Waters Oasis HLB cartridge (6 mL, 150 mg)를 4 mL의 메탄올로 세척하고 증류수 4 mL를 가하여 평형화시킨 후 MCX cartridge에서 용리된 시료를 모두 가하였다. 여기에 4 mL의 0.
- 담배의 연기 중 입자상물질은 2R4F 표준담배 5개비를 자동흅연장치 (Cerulean ASM 500, UK) 를 이용하여 ISO 표준흡연조건 (puff volume : 35 mL, puff frequency : 60 초, puff duration 2초)하에서 연소시켜 44 mm Cambridge filter pad를 이용하여 포집하였다. 모든 담배는 흡연전에 상대습도 60 ± 3 %와 온도 22 ± 1 ℃로 조절되는 조화실에서 48시간 이상 조화한 후 사용하였다.
- 두 가지 다른 형태의 SPE를 사용함으로서 aromatic amine의 방해물질들을 분리하였고, 복잡한 전처리 과정도 단순화 하였다. 새롭게 확립된 분석법은 97 ~ 106 % 회수율과 0.
- 따라서 각 단계의 용리액인 5 % NHqOH/MeOH과 toluene의 양을 조절해 가며 최적의 조건을 탐색하였다. 실험 결과 두 단계의 clean up 과정 모두 2 mL의 용리액이면 정량하기에 충분한 회수율을 보임을 알 수 있었다.
- aromatic aminee 휘발성이 적어 gas chromatography 적용을 위해서는 유도체화가 필요하다. 본 실험에서는 유도체 화합물로 PFPA를 사용하였으며, 이전에 발표된 문헌들 (Pieraccini et al., 1992; Luceri et al., 1993; Health Canada, 1999)보다 그 과정을 단순화 하였다. 새로운 PFPA 유도체화 반응의 정량성과 검출 한계를 aromatic amine의 표준용액을 제조하여 GC/MS분석을 통해 알아보았다.
- 본 연구에서 확립된 aromatic amine의 시료전처리는 cation exchange mechanism을 이용하여 산성조건에서 중성 방해물질을 제거하는 단계, 염기성 조건에서 hydrophobic interaction mechanism을 이용한 hydrophobicity/} 적은방해물질의 제거 단계 그리고 PFPA를 이용한 amine의 유도체화 등 3단계로 나눌 수 있다. 처음 두 단계의 SPE clean up 과정은 회수율 시험을 통하여 전처리 효율성을 알아보았으며 PFPA 유도체화는 반응시간에 따른 최적 반응시간을 알아보았다.
- , 1993; Health Canada, 1999)보다 그 과정을 단순화 하였다. 새로운 PFPA 유도체화 반응의 정량성과 검출 한계를 aromatic amine의 표준용액을 제조하여 GC/MS분석을 통해 알아보았다. 4종의 aromatic amine의 표준용액을 0.
- 그러나 보다 정확한실험을 위하여 4 mL의 용리액을 최적 조건으로 확립하였다. 세번째 단계인 PFPA 유도체화는 유도체화 시간에 따른 회수율을 조사하여 최적시간을 탐색하였다. PFPA의 반응 온도인 80 ℃ 에서 5분부터 15분, 30분, 60분 및 90분의 다섯 조건으로 반응시간 별 회수율을 측정하였다.
- 05 N NaOH 수용액과 30 % 메탄올 수용액을 가하여 세척한 다음 톨루엔 5 mL를가하여 시료를 용리시켰다. 여기에 sodium sulfate 를 적당량 가하여 수분을 제거한 후 약 1 mL를 autosampler vial로 옮긴 다음 10 mL의 trimethylamine (TMA) 용액과 4 pL pentafluoropropionic anhydride (PFPA)를 가하였다. Dry-bath를 이용하여 80 ℃에서 30분간 반응시켜 aromatic amine을 유도체화 시킨 후 GC/MS를 이용하여 분석하였다.
- 즉, 5 % HCl 추출용액에 1-aminonaphthalene 으로서 100 ng 에 해당하는 양의 표준용액을 가하고 내부표준용액을 첨가한 후 30분의 추출과정을 거쳤다. 이후 두 단계의 SPE를 거쳐 PFPA 유도체화를 시킨 다음 GC/MS를 이용하여 분석하였다.
- 정밀도는 2R4F 표준담배를 동일 조건 하에서 5회반복 시험하여 구하였으며 relative standard deviation (RSD) 으로 표현하였다. 시험 결과 1-aminonaphthalene의 RSD는 2.
- 처음 두 단계의 SPE clean up 과정은 회수율 시험을 통하여 전처리 효율성을 알아보았으며 PFPA 유도체화는 반응시간에 따른 최적 반응시간을 알아보았다.
대상 데이터
- (Quebec, Canada) 에서 구입하였다. Solid-phase extraction cartridge는 Waters사 (Milford, MA, USA) 에서 구입하였으며, 2R4F 표준담배는 Kentucky Tobacco Research & Development Center (University of Kentucky, Lexington, KY, USA)로부터 구입하였다. 이 외에 사용되는 시약들은 Aldrich사에서 구입하였으며, 유기용매는 모두 HPLC grade를 사용하였다.
- 내부 표준물질로 사용된 [2H7]2-aminonaphthalene, [2H9]4-aminobiphenyle CDN lostopes Inc. (Quebec, Canada) 에서 구입하였다. Solid-phase extraction cartridge는 Waters사 (Milford, MA, USA) 에서 구입하였으며, 2R4F 표준담배는 Kentucky Tobacco Research & Development Center (University of Kentucky, Lexington, KY, USA)로부터 구입하였다.
- 본 실험에서 사용한 표준물질 중 1 - aminonaphthalene, 2-aminonaphthalene, 4-aminobiphenyle Aldrich사 (Milwaukee, WI, USA)에서 구입하였으며 3 - aminob iphenyle TCI 사 (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 내부 표준물질로 사용된 [2H7]2-aminonaphthalene, [2H9]4-aminobiphenyle CDN lostopes Inc.
- 준비된 시료의 분석에는 Agilent 6890/5973 GC/MS system을 이용하였고 분석 컬럼은 30 m X 0.25 mm I.D., 0.25 μm의 film thickness 규격의 IIP-5MS capillary column을 이용하였다. 오븐은 80 ℃ 에서 1분간 멈춘 후 5 ℃/min 의 속도로 200 ℃ 까지 가열한 다음 다시 20 ℃/ min의 속도로 280 ℃까지 가열하였다.
이론/모형
- 질량분석은 electron impact ionization (EI) 방법으로 single ion monitoring (SIM) mode를 이용하였고 정량분석에 사용한 PFPA 유도체의 질량은 Table 1에 나타내었다. 시료의 분석은 내부표준물질과 분석물질의 peak area 비를 이용하여 외부정량법을 이용하여 정량하였다.
- Injector 온도는 250 ℃, split ratio는 20 : 1, 유속은 1 mL/ min의 조건으로 분석하였다. 질량분석은 electron impact ionization (EI) 방법으로 single ion monitoring (SIM) mode를 이용하였고 정량분석에 사용한 PFPA 유도체의 질량은 Table 1에 나타내었다. 시료의 분석은 내부표준물질과 분석물질의 peak area 비를 이용하여 외부정량법을 이용하여 정량하였다.
성능/효과
- 으로 가장 높은 값을 나타내었다. 2R4F 표준담배를 분석하여 보고한 참고문헌의 값이 다소 차이가 있기는 하나 각각 일관성 있는 결과를 보이고 있으며, 본 연구에서 분석한 aromatic amine의 함량과 유사한 경향성을 나타냄을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서 확립된 분석법은 담배연기 중의 aromatic amine 의 분석에 신뢰성 있는 결과를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
- PFPA의 반응 온도인 80 ℃ 에서 5분부터 15분, 30분, 60분 및 90분의 다섯 조건으로 반응시간 별 회수율을 측정하였다. GC/MS 분석 결과 15분 이후부터는 aromatic amine의 peak area가 증가하지 않았으며, 따라서 15분이면 aromatic amine이 충분히 반응함을 알 수 있었다. 그러나 보다 재현성 있는 실험을 위하여 최적 반응시간을 30분으로 설정하였다.
- 5 ~ 30 ng/mL의 농도로 제조하여 PFPA 유도체화를 시킨 후 GC/MS로 분석하였다. GC/MS 상에 나타난 내부표준물질과 표준물질의 peak area 비를 이용하여 검량선을 작성한 결과 결정계수(If) 는 0.998 이상의 높은 직선성을 나타내었으며 이들의 검출 한계도 0.12 ~ 0.16 ng/mL로 상당히 낮은 값을 보였다. 담배연기 중에 포함되어 있는 aromatic amine의 양은 수 ng/cig.
- 가장 낮은 결과를 보인 3-aminobiphenyle 97.0 %의 회수율을 보였으며, 2-aminonaphthalene 이 가장 높은 105.6 %의 회수율을 보였다. 본 연구에서 2R4F 표준담배를 분석하여 얻은 aromatic amine의 함량은 4-aminobiphenyl이 2.37 ng/cig.으로 가장 낮았으며, 1-aminonaphthalene이 15.
- 두 가지 다른 형태의 SPE를 사용함으로서 aromatic amine의 방해물질들을 분리하였고, 복잡한 전처리 과정도 단순화 하였다. 새롭게 확립된 분석법은 97 ~ 106 % 회수율과 0.12 ~ 0.16 ng/mL의 정량한계, RSD 2.0 ~ 8.8 %의 높은 정밀도를 보였으며, 2R4F 표준담배를 분석한 결과 문헌에 이미 발표된 값과 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 본 연구에서 확립된 SPE 를 이용한 분석법은 담배연기 중 aromatic amine의 분석에 효율적으로 적용될 수있을 것으로 판단된다.
- 정밀도는 2R4F 표준담배를 동일 조건 하에서 5회반복 시험하여 구하였으며 relative standard deviation (RSD) 으로 표현하였다. 시험 결과 1-aminonaphthalene의 RSD는 2.0 %의 값을 보였으며 가장 높은 3-aminobiphenyl도 8.8 %의 값을 나타내었다. 이러한 결과는 이미 보고된 문헌(Chen et al.
- 따라서 각 단계의 용리액인 5 % NHqOH/MeOH과 toluene의 양을 조절해 가며 최적의 조건을 탐색하였다. 실험 결과 두 단계의 clean up 과정 모두 2 mL의 용리액이면 정량하기에 충분한 회수율을 보임을 알 수 있었다. 그러나 보다 정확한실험을 위하여 4 mL의 용리액을 최적 조건으로 확립하였다.
후속연구
- 8 %의 높은 정밀도를 보였으며, 2R4F 표준담배를 분석한 결과 문헌에 이미 발표된 값과 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 본 연구에서 확립된 SPE 를 이용한 분석법은 담배연기 중 aromatic amine의 분석에 효율적으로 적용될 수있을 것으로 판단된다.
- 2R4F 표준담배를 분석하여 보고한 참고문헌의 값이 다소 차이가 있기는 하나 각각 일관성 있는 결과를 보이고 있으며, 본 연구에서 분석한 aromatic amine의 함량과 유사한 경향성을 나타냄을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서 확립된 분석법은 담배연기 중의 aromatic amine 의 분석에 신뢰성 있는 결과를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
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