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문제 정의
- 먼저 benomyl과 procymidorg의 저항성균주를 선발하여 기존의 잿빛 곰팡이병 방제 약제와 동일한 계통의 약제에 대한 저항성 정도를 비교하였다. 기존 약제에 저항성인 균주에 대한mepanipyrim의 효과를 실험실에서 검정한 후 온실 내 실험을 통해 실제로 병원균과 식물의 병발생 상호작용을 효과적으로 억제할 수 있는가를 규명하고자 하였다. 위의 실험 결과를 바탕으로 benzimidazole과 dicaboximide계 살균제 저항성인 병원균주가 혼재되어 있을 것으로 예상되는 실제 농가 포장에서 잿빛 곰팡이병에 대한 anilinopyrimidine계 살균제인mepanipyrim의 사용 가능성을 검정하였다.
- 적용 가능성을 검정하는 것이였다. 본 실험은 균사 생육억제 실험을 통해 잿빛곰팡이 병원균의 살균제 저항성 보고를1) 기초로 하여 포자 발아 억제 실험을 통해 살균제 저항성 균주를 선발하였다. 실험의 편리성에 의해 균사생장 억제실험이 저항성 판단의 주요한 방법으로 이용되고 있다.
- 본 실험은 딸기, 오이, 토마토, 포도에서 benomyl과 procymidone에 저항성을 나타내는 잿빛 곰팡이균을 분리하고 새로운 작용점을 갖는 약제인mepanipyrim으로 이들 저항성균을 효과적으로 방제할 수 있는가를 검정한 것이다. 먼저 benomyl과 procymidorg의 저항성균주를 선발하여 기존의 잿빛 곰팡이병 방제 약제와 동일한 계통의 약제에 대한 저항성 정도를 비교하였다.
- 본 실험의 목적은 잿빛 곰팡이병을 방제하기 위해 사용되어 온 benzimidazole 및 dicarboximide계 살균제에 저항성인 균주를 선발하여 기존 약제에 저항성인 균주에 대한 anilinopyrimidine계 mepanipyrim의 약효를 검정하고 이를 바탕으로 포장시험을 통해 적용 가능성을 검정하는 것이였다. 본 실험은 균사 생육억제 실험을 통해 잿빛곰팡이 병원균의 살균제 저항성 보고를1) 기초로 하여 포자 발아 억제 실험을 통해 살균제 저항성 균주를 선발하였다.
- 기존 약제에 저항성인 균주에 대한mepanipyrim의 효과를 실험실에서 검정한 후 온실 내 실험을 통해 실제로 병원균과 식물의 병발생 상호작용을 효과적으로 억제할 수 있는가를 규명하고자 하였다. 위의 실험 결과를 바탕으로 benzimidazole과 dicaboximide계 살균제 저항성인 병원균주가 혼재되어 있을 것으로 예상되는 실제 농가 포장에서 잿빛 곰팡이병에 대한 anilinopyrimidine계 살균제인mepanipyrim의 사용 가능성을 검정하였다.
제안 방법
- l00㎍ ai/ml의 benomyl과 procymidone이 각각 첨가된 PDA에 살균된 cellophane을 올려놓고 그 위에 포자 현탁액을 10㎕씩 떨어뜨렸다. 20℃에서 6시간 배양 후 광학현미경 100배 시야에서 전체 포자 수와 발아된 포자 수를 관찰하여 발아율을 구하였다. 무처리에서의 포자 발아율에 대한 약제처리에 의한 포자 발아율의 비율을 구하여 약제 저항성을 판단하였다.
- 동일 계통 살균제에 대한 교차저항성. Benomyl과 procymidone 에 대해저항성과 감수성인 균주들이 동일 계통의 다른 약제에대하여도 교차저항성을 갖는지를 판단하기 위해서, benomyl과 procymidone 두 약제 모두에 저항성인 2균주(BC34, BC46)와 두 약제 모두에 감수성인 2균주(BC25, BC40)에 대하여 동일 계통의 다른 약제가 100㎍ a.i./ml이 첨가된 PDA에서의 균사생육과 포자 발아 억제율을 조사하였다. Benomyl이 속한 benzimidazole계통의 약제로는 carbendazim, thiophanate-methyl이 사용되었으며 procymidone이 속한 dicarboximide 계통의 약제로는 iprodione과 vinclozolin이 사용되었다.
- Mepanipyrim의 농도에 따른 반응. Benomyl과 procymidone에 대하여 저항성과 감수성으로 선발된 각각의 2균주을 이용하여 mepanipyrim의 농도에 따른 균사생 장율과 포자 발아율을 측정하였다. 균사생 장율은 mepanipyrim의 농도 증가에 따라서 저항성과 감수성균주 모두 비슷한 수준으로 현저히 감소하였다 (Fig.
- Benomyl이 속한 benzimidazole계통의 약제로는 carbendazim, thiophanate-methyl이 사용되었으며 procymidone이 속한 dicarboximide 계통의 약제로는 iprodione과 vinclozolin이 사용되었다. Benzimidazole 또는 dicarboximide 계통의 약제가 첨가된 PDA에서 생장한 균사직경의 길이를 비교한 상대적 생장율과, 발아한 포자 수를 전체 포자수로 나누어 발아율을 결정하고 상대적 포자 발아율을 구하여 저항성 균주와 감수성균주를 구분하고 교차저항성을 판단하였다.
- /ml을 병발생 직전 7일 간격으로 4회 처리하였다. Mepanipyrim의 딸기, 오이, 포도의 잿빛 곰팡이병 방제 효과를 비교하기 위한 대조약제로는 procymidone 500 a.i./ml 을 mepanipyrim과 동일한 방법으로 살포하였다. 무처리 구는 아무 약제도 처리하지 않았다.
- 약제 처리 및 병원균 접종. Mepanipyrim이 benomyl과 procymidone에 저항성인 잿빛곰팡이병원 균의 기주식물체 침입을 억제하는지를 조사하기 위해서 benomyl, procymidone, 그리고 mepanipyrim을 각각 처리한 후 앞서 언급한 바와 같은 benomyl과 procymidone에 저항성을 나타내는 균주(BC34, BC46)를 각각 접종하였다. 위의 3가지 약제를 각각 125, 250㎍ a.
- 포장을 임차하여 2001년도에 수행하였다. 경종 방법은 일반농가의 관행적인 방법에 따라 재배하였으며, mepanipyrim 처리구, 대조약제 처리구, 무처리구의 세처리에 대해, 난 괴법 3 반복으로 딸기 및 오이는 각각 구당 20m2, 포도는 구당 1주를 시험구로 하고, 약제처리는 mepanipyrim 250㎍ a.i./ml을 병발생 직전 7일 간격으로 4회 처리하였다. Mepanipyrim의 딸기, 오이, 포도의 잿빛 곰팡이병 방제 효과를 비교하기 위한 대조약제로는 procymidone 500 a.
- 접종기주식물인 오이의 품종으로서는 신흑진주가 사용되었으며 원예용 상토(피트모스: 질석 = 1 : 1)와 밭흙을 1 : 1로 섞은 토양을 사용하여 유리온실에서 재배하여 1엽의 3/4 이 전개된 식물체가 접종기주식물로 사용되었다. 균사 배양과 포자 형성은 benomyl과 procymidone에 저항성인 잿빛 곰팡이 병원균 균사를 PDA 배지에서 접종하여 20℃, 암 상태에서 7일간 배양한 후 다시 7일 동안 12시간 광암을 교차하여 배양함으로써 수행하였다. 형성된 포자는 무처리구에서 충분한 병 발생을 위하여 2.
- Mepanipyrim의 농도에 따른 반응. 균사생육 억제와 포자발아억제실험을 모두 약제가 첨가된 PDA상에서 각각 수행하였다. 균사생육은 앞서 언급한 바와 같이 benomyl이나 procymidone이 첨가된 배지에서 선발된 저항성 2균주와 감수성 2균주를 mepanipyrim이 일련의 농도(0.
- 균사생육 억제와 포자발아억제실험을 모두 약제가 첨가된 PDA상에서 각각 수행하였다. 균사생육은 앞서 언급한 바와 같이 benomyl이나 procymidone이 첨가된 배지에서 선발된 저항성 2균주와 감수성 2균주를 mepanipyrim이 일련의 농도(0.1, 10, 100, 250, 500㎍ a.i./ml)로 첨가된 PDA에 이식한 후 20℃에서 4일간 배양 후 균사 길이를 측정하였다. 포자발아는 포자상대 발아율 실험과 동일한 방법으로 준비한 포자현탁액을 (1.
- 20℃에서 4일간 배양한 후 균사길이를 측정하였다. 농약이 첨가되지 않은 배지에서의 균사생장 길이 대비 농약이 첨가된 배지에서의 균사 생장길이의 비율에 기준하여 약제 저항성을 판단하였다.
- 수 있는가를 검정한 것이다. 먼저 benomyl과 procymidorg의 저항성균주를 선발하여 기존의 잿빛 곰팡이병 방제 약제와 동일한 계통의 약제에 대한 저항성 정도를 비교하였다. 기존 약제에 저항성인 균주에 대한mepanipyrim의 효과를 실험실에서 검정한 후 온실 내 실험을 통해 실제로 병원균과 식물의 병발생 상호작용을 효과적으로 억제할 수 있는가를 규명하고자 하였다.
- 20℃에서 6시간 배양 후 광학현미경 100배 시야에서 전체 포자 수와 발아된 포자 수를 관찰하여 발아율을 구하였다. 무처리에서의 포자 발아율에 대한 약제처리에 의한 포자 발아율의 비율을 구하여 약제 저항성을 판단하였다.
- 균사생장에 의한 약제 저항성. 실험 실 수준에서 잿빛곰팡이병 방제에 널리 사용된 대표적인 기존 약제에 대한 저항성 균주를 선발하기 위하여 100㎍ a.i./m/의 benomyl과 procymidone이 각각 첨가된 PDA와 약제가 첨가되지 않은 PDA에 잿빛곰팡이병원 균 23균주의 균사조각을(직경, 6mm) 이식하였다. 20℃에서 4일간 배양한 후 균사길이를 측정하였다.
- Mepanipyrim이 benomyl과 procymidone에 저항성인 잿빛곰팡이병원 균의 기주식물체 침입을 억제하는지를 조사하기 위해서 benomyl, procymidone, 그리고 mepanipyrim을 각각 처리한 후 앞서 언급한 바와 같은 benomyl과 procymidone에 저항성을 나타내는 균주(BC34, BC46)를 각각 접종하였다. 위의 3가지 약제를 각각 125, 250㎍ a.i./ml의 농도로 각 병원균이 접종되기 24시간 전에 각각 오이1엽이 충분히 젖을 정도로 살포하였다. 5 mm paper disc에 미리 준비한 각 병원균의 포자 접종원을 충분히 흡습시킨 후, 농약이 처리된 오이잎에 흡습시킨 paper disc를 얹어 접종하였다.
- 5 mm paper disc에 미리 준비한 각 병원균의 포자 접종원을 충분히 흡습시킨 후, 농약이 처리된 오이잎에 흡습시킨 paper disc를 얹어 접종하였다. 접종된 식물체는 접종한 후 20℃, 상대 습도 90% 이상의 배양기에서 6일간 배양한 후 병반을 조사하였다. 침입억제 유무는 병반면적율을 무병징(-)에서 50% 이상 병반면적율 (+++)의 4가지 등급으로 나누어 수행하였다.
- 50×105 conidia/ml) 살균된 cellophane을 올려놓은 mepanipyrim이 첨 가된 PDA에 10㎕씩 떨어뜨렸다. 처리 후 20℃에서 6시간 배양 후 광학 현미경 100배 시야에서 전체 포자수와 발아된 포자수를 관찰하였다.
- 접종된 식물체는 접종한 후 20℃, 상대 습도 90% 이상의 배양기에서 6일간 배양한 후 병반을 조사하였다. 침입억제 유무는 병반면적율을 무병징(-)에서 50% 이상 병반면적율 (+++)의 4가지 등급으로 나누어 수행하였다.
- 포자 발아율에 의한 약제 저항성.포자 생성을 위해서는 PDA 에 병원균 균사를 접종하고 20℃에서 5일간 배양 후 12시간씩 광암이 교차되는 배양기(4,000 lux)에서 4일간 배양하여 형성시켰다. 포자현탁액은 포자가 형성된 배지에 멸균수를 붓고 멸균된 붓으로 포자를 수확하여 3겹의 멸균된 거즈로 걸러 만들었다 (약 1.
대상 데이터
- 병원균 분리. 1998년과 1999년에 경상북도 경주시 사방, 이조, 나원, 현곡, 황남지역의 시설배재포장으로부터 딸기, 오이, 토마토, 포도의 이병식물 및 이 병과실을 채집하였다. 병반을 20℃, 상대 습도 90% 이상의 항온항습실에서 2일간 습실처리 한 후 streptomycin 200㎍ a.
- 본 실험에 사용된 잿빛 곰팡이병 공시약제는 모두 주식회사 경농중앙연구소에서 분양받아 본 실험에서 이용하였다. 기존 잿빛곰팜이 병 방제약제와 다른 작용기작을 갖는 새로운 약제로 본 실험에서 사용된 약제는 anilinopyrimidine계인 mepanipyrim(50% a.i. 수화제, 경농, 서울, 한국)이 사용되었다. 기존에 사용되어진 공시약제는 benzimidazole계의 대표적 살균제로 benomyl(50% a.
- 수화제, 경농, 서울, 한국)을 사용하였다. 또 다른 계통의 기존 약제로는 dicarboximide계의 대표적 살균제로 procymidone(50% a.i. 수화제, 경농, 서울, 한국)을 사용하였으며 동일 계통의 약제에 대한 교차저항성 검정을 위해 iprodione (50% a.i. 수화제, 동부한농, 서울, 한국), vinclozolin(47% a.i. 수화제, 한국삼공, 서울, 한국)을 사용하였다(Table 1).
- 공시 약제. 본 실험에 사용된 잿빛 곰팡이병 공시약제는 모두 주식회사 경농중앙연구소에서 분양받아 본 실험에서 이용하였다. 기존 잿빛곰팜이 병 방제약제와 다른 작용기작을 갖는 새로운 약제로 본 실험에서 사용된 약제는 anilinopyrimidine계인 mepanipyrim(50% a.
- /ml 첨가된 potato dextrose agar(PDA)에 올려놓아 병반에서 자라 나온 곰팡이의 균사선단을 새로운 배지에 이식하여 잿빛 곰팡이병균 64균주를 분리하고 분리된 균은 4℃의 저온실에 보관하였다. 선발된 병원균 중 곰팡이 포자를 이용한 실험을 위하여 PDA에서 충분한 양의 포자를 형성하는 23균주를 선발하여 본 실험에서 사용하였다.
- 잿빛 곰팡이병에 대한 mepanipyrim의 약제 방제 효과 시험은 딸기(보교조생), 오이(만춘천장), 포도(켐벨)에 대해 실제 농가재배 포장을 임차하여 2001년도에 수행하였다. 경종 방법은 일반농가의 관행적인 방법에 따라 재배하였으며, mepanipyrim 처리구, 대조약제 처리구, 무처리구의 세처리에 대해, 난 괴법 3 반복으로 딸기 및 오이는 각각 구당 20m2, 포도는 구당 1주를 시험구로 하고, 약제처리는 mepanipyrim 250㎍ a.
- 기주식물 및 병원균 접종원 제조. 접종기주식물인 오이의 품종으로서는 신흑진주가 사용되었으며 원예용 상토(피트모스: 질석 = 1 : 1)와 밭흙을 1 : 1로 섞은 토양을 사용하여 유리온실에서 재배하여 1엽의 3/4 이 전개된 식물체가 접종기주식물로 사용되었다. 균사 배양과 포자 형성은 benomyl과 procymidone에 저항성인 잿빛 곰팡이 병원균 균사를 PDA 배지에서 접종하여 20℃, 암 상태에서 7일간 배양한 후 다시 7일 동안 12시간 광암을 교차하여 배양함으로써 수행하였다.
데이터처리
- 무처리 구는 아무 약제도 처리하지 않았다. 잿빛곰팡이병에 대한약제의 약효조사는 딸기는 처음 약제 처리 30일 후에, 오이는 25일 후에, 그리고 포도는 40일 후에 각 처리구별로 구당 200과 이상에 대해 건전과의 개수와 이병과의 개수를 구하여 이병과율(%)을 계산하였으며, 평가된 결과는 Duncan's multiple range test(DMRT)를 이용하여 통계 분석하였다.
성능/효과
- 12) Benzimidazole 및 dicarboximide계 살균제에 대하여 저항성으로 선발된 균주를 오이식물체에 접종했을 때, 위 두 가지 계통의 살균제 처리로는 잿빛 곰팡이병을 충분히 방제하지 못하였지만, mepanipyrim은 효과적으로 병원균의 침입을 억제하였다(Table 2). 또한 딸기를 대상으로 한 실험에서는 anilinopyrimidine계인 mepanipyrim의 효과는 dicarboximide계인 procymidone 약제보다 더 효과적으로 나타나(Table 3) 현재 기존 약제에 대한 저항성이 발현된 포장에서도 잿빛 곰팡이병을 효과적으로 방제할 수 있음을 제시하여 주었다.
- Benomyl과 procymidone 두 약제에 대해 저항성으로 선발된 균들은 benomyl과 같은 benzimidazole계통에 속하는 다른 약제인 carbendazim과 thiophanate-methyl에도 교차저항성을 보였다(Fig. 2A and Fig. 3A). 이것은 포장에서 분리된 benomyl 저항성 균이 benzimidazole 계통의 다른 약제간에도 교차 저항성이 있다는 여러 연구 결과에 의하여 보고된 바와 같다.
- 동일 계통 살균제에 대한 교차저항성. Benzimidazole 또는 dicarboximide 계통의 약제가 100㎍ a.i./ml로 농도로 첨가된 PDA 배지에서의 균사직경의 길이는 benzimidazole계통의 약제에 대해서 저항성 균주는 49~61mm, 감수성균주는 34〜34 mm로 나타났다. Dicarboximide계통의 약제에 대해서는 저항성 균주가 0〜13 mm, 감수성균주는 0~4mm로 나타났다(Fig.
- 3A and B). Dicarboximide 계통약제에 대해서는 저항성 균주가 vinclozolin에 대해서만 0.71의 발아율을 보였으며 저항성 균주와 감수성 균주에 대한 vinclozolin외의 나머지 2가지 약제에 대하여는 0.04 미만의 포자발아율을 보였다(Fig. 3A and B). Benzimidazole 계통 약제에 대한포자발아율은 저항성 균주나 감수성균주 모두 균사생장율과 비슷한 정도를 나타내었다(Fig.
- 2A and B) 비해 차이가 없어 보였다. Mepanipyrim의 농도의 증가에 따른 저항성 및 감수성균주의 포자 발아는 억제되지 않았지만 (Fig. 5A and B) 현미경으로 관찰한 결과 l00㎍ a.i./ml 이상의 농도에서는 발아된 균사가 더 이상 정상적으로 생장하지 못하는 것을 관찰할 수 있었다(data not shown).
- 방제효과. Mepanipyrim의 효과를 일반 농가의 관행재배 형태로 재배되는 딸기, 오이, 포도에 약제를 살포한 후 약제방제효과를 조사한 결과, 딸기의 경우 무처리구의 이병과율이 48.8%인데 반해 mepanipyrim 처리구의 이병과율은 7.6%로 나타났다(Table 3). 이것은 무처리구는 물론 대조약제인 procymidone 처리구의 이병과율 9.
- Prochymidone보다는 benomyl에 저항성인 균주들이 더 많이 분리되어서 포장에서 benomyl에 대한 저항성 잿빛곰팡이균이 더 널리 퍼져 있다고 사료되었다. benomyl은 살균 작용 범위가 넓고 침투성이며 낮은 농도에서 약효가 우수하여 다른 병에도 널리 사용되어 왔기 때문에 세계 각국에서 살균제 저항성 문제로 현재 그 사용량이 매우 감소하게 되었다.
- 3A and B). Vinclozolin을 제외한 다른 dicarboximide 계통의 약제는 저항성 균주나 감수성균주에 상관없이 포자 발아를 억제하는 경향을 보였으나 vinclozolin은 저항성 균주의 포자 발아를 억제하지 못하는 것으로 나타났다(Fig. 3A and B).
- Benomyl과 procymidone에 대하여 저항성과 감수성으로 선발된 각각의 2균주을 이용하여 mepanipyrim의 농도에 따른 균사생 장율과 포자 발아율을 측정하였다. 균사생 장율은 mepanipyrim의 농도 증가에 따라서 저항성과 감수성균주 모두 비슷한 수준으로 현저히 감소하였다 (Fig. 4A and B). 균주에 따라서는 500㎍ a.
- 저항성 및 감수성균주 선발. 균사생장율 및 포자 발아율을 통한 benomyl과 procymidone에 대한 약제반응을 조사한 결과 두 약제 사이의 유의한 상관관계는 없었으며, 특히 두 약제에 대해 모두 완전히 저항성이거나 또는 두 약제 모두에 대하여 완전히 감수성인 균주를 찾을 수 없었지만 두 약제에 대한 균사생장율 및 포자 발아율의 결과를 종합하여 저항성 균주로는 BC34와 BC46을 선발하였고 감수성균주로 BC25와 BC40을 선발하여 이후의 시험에 대표균주로 사용하였다.
- 4A and B). 균주에 따라서는 500㎍ a.i./ml에서도 균사생장이 완전히 억제되지 않은 것(Fig. 4 A and B)으로 보아 mepanipyrim에 의한 균사생장 억제는 기존의 다른 약제에 (Fig. 2A and B) 비해 차이가 없어 보였다. Mepanipyrim의 농도의 증가에 따른 저항성 및 감수성균주의 포자 발아는 억제되지 않았지만 (Fig.
- 2%로 나타나 서 mepanipyrim의 방제 효과가 유의하였다. 그러나, mepanipyrim 처리구의 이병과율은 procymidone 처리구의 이병과 율 7.6%와는 유의성이 있지 않았지만 두 약제 모두 무처리구와는 유의한 차이가 있었다(DMRT, p<0.05) (Table 3).
- 대조약제로 사용된 benomyl과 procymidone을 250㎍ a.i./ml의 농도로 처리한 오이에서의 병 반면적율은 10~50% 인 반면 mepanipyrim을 동일한 농도로 처리한 오이에서는 병반이 형성되지 않아 benomyl과 procymidone에 대한 저항성 균주에 대해 침입 억제효과가 높게 나타났다(Table 2).
- 14-16) 김 등3)의 연구에 의하면 시설원예작물과 감귤에서 분리한 잿빛 곰팡이 균주들 중에서 prochymidone 2 ppm에서 균시생장이 억제되는 BC-2, KC-5 등 7개의 균주가 1,250 ppm의 benomyl에서 생장이 억제되지 않은 저항성을 보였다고 하였다. 또한, 전체 112개 균주들 중benomyl에 저항성을 보인 균주는 60.7%로서 benomyl에 대한저항성 균주가 prochymidone에 대한 저항성 균주보다 더욱 많은 비율을 차지하고 있을 보여주어서 본 연구 결과와 유사하였다.
- 하지만 예방적 살균제의 경우 포자발아의 억제가 중요한 저항성 판단의 기준이 될 수 있다. 본 실험에서도 균사생장 억제와 포자 발아 억제는 서로 상관관계가 없음을 알 수 있었다. 그러므로 살균제 저항성 판단은 약제의 특성에 맞게 결정해야 함을 알 수 있었다.
- 05). 오이에서 무처리구의 이 병과율은 33.9%로 나타났지만, mepanipyrim 처리구의 이 병과율은 4.9%로 대조약제인 procymidone 처리구의 이병과율 5.6%와는 유의한 차이가 없었으나 두 약제 모두 무처리와는 현저한 차이를 보였다(DMIH, p<0.05). 포도에서도 무처리구의 이병과율은 16.
- 2A and B). 위의 결과는 균사생장은 benomyl과 procymidone에 대한 저항성 균주가 감수성균주에 비하여 동일 계통 내에서 약제에 대해 저항성 정도가 더 높다는 것을 나타낸다. 또한 저항성과 감수성 각각의 균주는 동일한 계통의 약제에서 비슷한 저항성 또는 감수성을 보여주고 있다(Fig.
- 6%로 나타났다(Table 3). 이것은 무처리구는 물론 대조약제인 procymidone 처리구의 이병과율 9.1%와 비교하여도 방제효과가 유의하였다(DMRT, p<0.05). 오이에서 무처리구의 이 병과율은 33.
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