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문제 정의
- 본 연구에서는 유리 보다 훨씬 간편하게 제작할 수 있는 PDMS(polydimethylsiloxane) 위주로 제한효소 반응뿐만 아니라 그 반응물의 전기영동 (electrophoresis) 검출을 한 개의 칩 상에서 실행할 수 있는 마이크로바이오칩을 개발하고자 한다. 멤스 기술을 이용하여 제한효소 반응을 일으킬 수 있는 초소형 히터 반응조와 절단된 DNA의 분리 유무를 확인할 수 있는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis, CE)용 초소형 채널이 조합된 DNA 마이크로바이오 칩을 제작하였다.
- 유리 칩과 PDMS 칩 접합을 위해 행해지는 산소 플라즈마 칩 표면 처리는 소수성 PDMS를 친수성으로 변환시키지만, 시간이 경과됨에 따라 다시 소수성으로 돌아가게 된다. 산소 플라즈마 처리로 PDMS가 친수성으로 된 상태에서 모세관 현상이 가장 잘 일어날 수 있는 마이크로바이오칩 채널의 높이와 폭을 찾기 위한 실험을 행하였다. 채널 높이는 60,100 ㎛로 채널폭은 35, 50, 65, 80, 95 ㎛로 변화시키면서 각각의 채널 내에서의 IxTAE 완충액의 모세관 현상에 의한 유체 이동속도를 측정하였으며 그 결과는 Table 1과 같다.
- 제작된 칩에서 제한효소 반응이 완료되는데 필요한 시간을 알아보기 위하여, 여러 반응 수행 시간에 대한 반응 완료 여부 확인 실험을 하였다. pBR322 백 터를 제한효소 Hind Ⅲ 와 Sty I로 3, 5, 10, 15분간 별로 반응을 시켰다.
제안 방법
- 5 에서 ①번 열은 인덱스 마커(index marker)인 X DNA/EcoR I+Hind Ⅲ (Promega)을 전기영동 한 것이다. 3 분에서 15분까지의 각 시간대 별 반응 결과물들은 ②번 열부터 ⑤번 열까지 순서대로 주입하여 전기영동을 하였다. pBR322 백터를 제한효소 Hind Ⅲ 와 Sty I를 이용하여 절단하면 1340bp, 3021bp 길이의 DNA 절편들로 잘리게 된다.
- 선택된 백터의 절단 부위 선택 및 그에 따른 제한효소의 선정은 제한효소 지도를 참고하였다. DNA 클로닝에서는 백터에 삽입될 이종 DNA의 부착 말단(cohesive end) 염기서열과 제한효소에 의해 절단되어 생기는 백터의 부착 말단의 염기서열이 서로 상보적 이도록 제한효소를 선택하지만 본 논문에서는 앞서 말한 이종 DNA에 대한 고려 없이 임의의 제한효소 두 가지를 선택하여 제한효소 반응 실험을 하였다. pBR322 백터의 경우에는 Hind Ⅲ 와 Sty I를, pGEM®-4Z 백터는 Hind Ⅲ 와 Sea I를 각각 제한효소로 사용하였다.
- 제작된 칩에서 제한효소 반응이 완료되는데 필요한 시간을 알아보기 위하여, 여러 반응 수행 시간에 대한 반응 완료 여부 확인 실험을 하였다. pBR322 백 터를 제한효소 Hind Ⅲ 와 Sty I로 3, 5, 10, 15분간 별로 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후 반응 완료 여부를 확인하기 위해 일반 실험실에서 사용하는 전기영동 장치에 1% 아가로 우즈 겔(agarose gel)을 이용하여 100V에서 20분간 전기영동을 수행하였고 Fig.
- pGEM®-4Z 백터와 제한효소 Hind Ⅲ, Sea I에 대해서, 기존방법의 제한효소 반응과 마이크로칩을 이용한 반응의 결과를 비교해 보았다. 기존 방법 실험에 따라 ~25 成 시료를 37℃ 일반 항온 수조에서 2시간 동안 제한효소 반응을 수행하였다.
- pGEM®-4Z 백터와 제한효소 Hind Ⅲ, Sea I에 대해서, 기존방법의 제한효소 반응과 마이크로칩을 이용한 반응의 결과를 비교해 보았다. 기존 방법 실험에 따라 ~25 成 시료를 37℃ 일반 항온 수조에서 2시간 동안 제한효소 반응을 수행하였다. 마이크로바이오칩을 이용한 실험에서는 10분간 반응을 수행하였다.
- 기존의 유리기 반의 칩보다 재료비가 저렴하고 제작 방법도 간단한 PDMS 기반의 DNA용 바이오칩을 개발하였다. 반응조와 채널이 있는 마이크로 PDMS 칩은 공정이 간단한 복사형틀 법으로 제작하고, 생화학 반응에 필요한 열에너지를 공급할 수 있는 마이크로히터가 있는 유리 칩은 금 속박 막 패터닝으로 제작하였다.
- 그 결과 마커의 인덱스 DNA 띠들이 예상되는 절편들의 분자량별로 분리 검출됨을 확인할 수 있었다. 다음에는 플라스미드 pGEM®-4Z를 제한효소 Hind Ⅲ, Sea I 와 함께 마이크로바이오칩의 반응조에서 반응을 시킨 후 연속적으로 같은 칩의 마이크로채널에서 모세관 전기영동을 수행하여 형광 검출하였다. Fig.
- 기존 방법 실험에 따라 ~25 成 시료를 37℃ 일반 항온 수조에서 2시간 동안 제한효소 반응을 수행하였다. 마이크로바이오칩을 이용한 실험에서는 10분간 반응을 수행하였다. 반응 결과물들을 일반 전기영동 장치에서 0.
- 본 연구에서는 유리 보다 훨씬 간편하게 제작할 수 있는 PDMS(polydimethylsiloxane) 위주로 제한효소 반응뿐만 아니라 그 반응물의 전기영동 (electrophoresis) 검출을 한 개의 칩 상에서 실행할 수 있는 마이크로바이오칩을 개발하고자 한다. 멤스 기술을 이용하여 제한효소 반응을 일으킬 수 있는 초소형 히터 반응조와 절단된 DNA의 분리 유무를 확인할 수 있는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis, CE)용 초소형 채널이 조합된 DNA 마이크로바이오 칩을 제작하였다. 제작된 마이크로 바이오칩으로 DNA 제한효소 반응을 수행하였고 그 반응 결과물을 같은 칩 상에서 모세관 전기영 동으로 분리 및 확인할 수 있었다.
- 마이크로바이오칩을 이용한 실험에서는 10분간 반응을 수행하였다. 반응 결과물들을 일반 전기영동 장치에서 0.8% 아가로 우즈 겔를 이용하여 인가전압 50V로 40분간 전기영동 하였으며, 그 결과는 Fig. 6 와 같다. Fig.
- pBR322 백 터를 제한효소 Hind Ⅲ 와 Sty I로 3, 5, 10, 15분간 별로 반응을 시켰다. 반응이 끝난 후 반응 완료 여부를 확인하기 위해 일반 실험실에서 사용하는 전기영동 장치에 1% 아가로 우즈 겔(agarose gel)을 이용하여 100V에서 20분간 전기영동을 수행하였고 Fig. 5 는 그 결과를 보여준다. Fig.
- 기존의 유리기 반의 칩보다 재료비가 저렴하고 제작 방법도 간단한 PDMS 기반의 DNA용 바이오칩을 개발하였다. 반응조와 채널이 있는 마이크로 PDMS 칩은 공정이 간단한 복사형틀 법으로 제작하고, 생화학 반응에 필요한 열에너지를 공급할 수 있는 마이크로히터가 있는 유리 칩은 금 속박 막 패터닝으로 제작하였다. 최종적으로 이 두 칩을 결합하여 DNA 제한효소 반응을 수행하고 그 결과물을 모세관 전기영 동으로 검출할 수 있는 마이크로바이오칩을 제작하였다.
- 본 연구에서는 pBR322와 pGEM®-4Z (Promega)를 백터로 사용하였다. 선택된 백터의 절단 부위 선택 및 그에 따른 제한효소의 선정은 제한효소 지도를 참고하였다. DNA 클로닝에서는 백터에 삽입될 이종 DNA의 부착 말단(cohesive end) 염기서열과 제한효소에 의해 절단되어 생기는 백터의 부착 말단의 염기서열이 서로 상보적 이도록 제한효소를 선택하지만 본 논문에서는 앞서 말한 이종 DNA에 대한 고려 없이 임의의 제한효소 두 가지를 선택하여 제한효소 반응 실험을 하였다.
- 전원 공급기를 통해 칩에 일정량의 전압을 히터에 공급한다. 신호 처리기를 통해 데이터 수집 보드에 연결된 열전대로 반응조 내부의 온도를 측정한다. 제어기는 측정된 온도를 제한효소 반응을 수행하기 위해 필요한 온도인 37℃와 비교하여 전원을 점멸제어해 주게 된다.
- PDMS 칩은 복사형틀 법 (replica molding)을 이용하여 제작하였다. 실리콘 웨이퍼에 음성후막감광제(negative photoresist, SU8)를 100 ㎛ 두께로 스핀 코팅한 후 열처리를 한다. 열처리가 끝난 후 사진 공정(photolithography) 기법을 이용하여 반응조 모양 및 마이크로 채널 형상을 갖는 형틀(mold) .
- 제작된 마이크로바이오 칩 상에서 먼저 X DNA/EcoR I+ffind Ⅲ 마커를 모세관 전기영동으로 분리하여 형광 검출해 보았다. 그 결과 마커의 인덱스 DNA 띠들이 예상되는 절편들의 분자량별로 분리 검출됨을 확인할 수 있었다.
- 산소 플라즈마 처리로 PDMS가 친수성으로 된 상태에서 모세관 현상이 가장 잘 일어날 수 있는 마이크로바이오칩 채널의 높이와 폭을 찾기 위한 실험을 행하였다. 채널 높이는 60,100 ㎛로 채널폭은 35, 50, 65, 80, 95 ㎛로 변화시키면서 각각의 채널 내에서의 IxTAE 완충액의 모세관 현상에 의한 유체 이동속도를 측정하였으며 그 결과는 Table 1과 같다. 측정 결과, 채널폭이 80 ㎛, 채널 높이가 100 ㎛ 일 때, 비교적 가장 빨리 모세관 현상으로 빈 채널이 용액으로 채워지는 것을 알 수 있었다.
- 반응조와 채널이 있는 마이크로 PDMS 칩은 공정이 간단한 복사형틀 법으로 제작하고, 생화학 반응에 필요한 열에너지를 공급할 수 있는 마이크로히터가 있는 유리 칩은 금 속박 막 패터닝으로 제작하였다. 최종적으로 이 두 칩을 결합하여 DNA 제한효소 반응을 수행하고 그 결과물을 모세관 전기영 동으로 검출할 수 있는 마이크로바이오칩을 제작하였다. 제작된 칩을 통해 기존 생화학 실험실에서 90분 가량 소모되던 제한효소 반응실험을 10분 이내로 단축 할 수 있었으며 검출에 걸리던 시간도 기존의 방법보다 줄일 수 있었다.
- 금속 배선 히터가 부착될 유리 칩은 유리(pyrex7740, Coming) 웨이퍼에 열기상증착법 (thermal evaporation)으로 크롬과 금 박막을 각각 200A/1000A 두께로 증착시킨다. 히터 설계 형상을 사진 공정 기법으로 패터닝을 한 후 시료와 히터와의 생화학적 절연을 위해 플라즈마 강화 화학기상증착법 (PECVD)로 1 网1 두께의 산화막 (SiO, 을 증착한다.
대상 데이터
- DNA 클로닝에서는 백터에 삽입될 이종 DNA의 부착 말단(cohesive end) 염기서열과 제한효소에 의해 절단되어 생기는 백터의 부착 말단의 염기서열이 서로 상보적 이도록 제한효소를 선택하지만 본 논문에서는 앞서 말한 이종 DNA에 대한 고려 없이 임의의 제한효소 두 가지를 선택하여 제한효소 반응 실험을 하였다. pBR322 백터의 경우에는 Hind Ⅲ 와 Sty I를, pGEM®-4Z 백터는 Hind Ⅲ 와 Sea I를 각각 제한효소로 사용하였다. pBR322(4361bp) 백터는 Hind Ⅲ와 Styl 로 제한효소 반응을 수행하면 1340bp, 3021bp 길이의 DNA 절편들로 잘리게 되고 pGEM®-4Z 백터는 Hind Ⅲ 와 Sea I로 반응시키면 984bp, 1762bp 길이의 절편들로 잘린다.
- 본 실험에 사용된 모세관 전기영동 장치에는 4개의 고전압 전극이 있으며, 레이저 유도 형광 검출법으로 시료를 측정한다. 시료 측정에 사용된 레이저는 532nm, 10mW 녹색광이며, 빛전자증 배관 광학 검출기로 형광 신호를 획득하였다.
- 본 연구에서는 pBR322와 pGEM®-4Z (Promega)를 백터로 사용하였다. 선택된 백터의 절단 부위 선택 및 그에 따른 제한효소의 선정은 제한효소 지도를 참고하였다.
- 본 실험에 사용된 모세관 전기영동 장치에는 4개의 고전압 전극이 있으며, 레이저 유도 형광 검출법으로 시료를 측정한다. 시료 측정에 사용된 레이저는 532nm, 10mW 녹색광이며, 빛전자증 배관 광학 검출기로 형광 신호를 획득하였다. 제작된 마이크로바이오칩으로 전기영동을 수행할 때에 채널 끝 단들에 인가한 전압들은 Table 2와 같다.
- Table 2와는 다른 전압들을 인가할 때에는 마이크로채널 내에서 시료가 타버리거나 기포가 생겨서 측정이 불가능하였다. 전기영동 실험에는 선행 실험에서 모세관 현상이 가장 양호했던 채 널 폭은 80㈣, 채널 높이는 100网1 로 제작된 칩을 사용하였다.
- 이러한 특징으로 인해 DNA 클로닝(cloning)에 있어서 필수적인 과정 중 하나이다. 제한효소로 자를 DNA로, 대장균 등에서 염색체와 별도로 존재하는 큰 고리 모양의 이중나선 DNA인 플라스미드(plasmid)를 선택하였다. 플라스미드는 균의 증식에 있어서 필수적인 것은 아니지만 자기복제능 을 가지고 있는 DNA이다.
- 2와 같다. 칩의 주재료로, 바이오 멤스 분야에서 생화학적 안전성이 검증된 PDMS와 유리를 사용하였다. DNA와 제한효소를 반응시키기 위한 반응조와 반응 산물을 전기영동하기 위한 마이크로 채널들은 PDMS 칩으로 제작하었고, 금 박막 형태의 마이크로 히터는 유리 칩 위에 제 작하였다.
이론/모형
- PDMS 칩은 복사형틀 법 (replica molding)을 이용하여 제작하였다. 실리콘 웨이퍼에 음성후막감광제(negative photoresist, SU8)를 100 ㎛ 두께로 스핀 코팅한 후 열처리를 한다.
- 마이크로 반응조의 제한효소 반응 결과물을 바이오칩 내의 마이크로 채널로 연결하여 모세관 전기영동을 수행하게 되는데, 전기영동의 구동과 전기영동으로 분리된 DNA 절편들의 검출을 위하여 본 연구에서는 상용장치인 Digital Bio 社의 DBMA-100 를 사용하였다.
- 5℃이다. 이렇게 제한효소 반응조의 온도를 37'C로 유지해주는 제어를 위해■ Lab VIEW 7.0 (National Instrument) 소프트웨어를 이용하였다.
성능/효과
- 6의 첫 번째 열은 X DNA/EcoR 1+Hind Ⅲ 인덱스 마커에 해당하며, a 열은 일반 항온 수조를 이용한 효소 반응 실험 결과이고 b 열은 마이크로바이오칩을 이용한 실험 결과이다. Fig. 6 에서 알 수 있듯이, 마이크로바이오칩을 이용할 경우 훨씬 짧은 반응시간과 적은 시료의 양으로도 기존의 실험방 법과 동일한 결과를 낼 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 칩에서 반응시킨 결과물들의 전기영동 결과들을 인덱스 마커의 DNA 절편 띠 (band) 들과 비교하면, 예상되는 절편 크기의 DNA들로 분리된 것을 알 수가 있다. 각 시간대별로 모두 제한효소 반응이 제대로 일어났지만 3분간 반응을 실행한 결과의 전기영동 된 DNA 절편 띠의 색깔이 다른 반응시간 대의 결과물들보다 약간 흐림을 알 수 있다. 따라서 본 연구에서 제작된 마이크로바이오칩의 경우 제한효소 반응을 5분 이상 수행해야 안전하다.
- 제작된 마이크로바이오 칩 상에서 먼저 X DNA/EcoR I+ffind Ⅲ 마커를 모세관 전기영동으로 분리하여 형광 검출해 보았다. 그 결과 마커의 인덱스 DNA 띠들이 예상되는 절편들의 분자량별로 분리 검출됨을 확인할 수 있었다. 다음에는 플라스미드 pGEM®-4Z를 제한효소 Hind Ⅲ, Sea I 와 함께 마이크로바이오칩의 반응조에서 반응을 시킨 후 연속적으로 같은 칩의 마이크로채널에서 모세관 전기영동을 수행하여 형광 검출하였다.
- . 따라서 마이크로 바이오칩에서 제한효소 반응뿐만 아니라 그 결 과물의 전기영동 분리 검출도 정상적으로 이루어짐을 보여주고 있다.
- 멤스 기술을 이용하여 제한효소 반응을 일으킬 수 있는 초소형 히터 반응조와 절단된 DNA의 분리 유무를 확인할 수 있는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis, CE)용 초소형 채널이 조합된 DNA 마이크로바이오 칩을 제작하였다. 제작된 마이크로 바이오칩으로 DNA 제한효소 반응을 수행하였고 그 반응 결과물을 같은 칩 상에서 모세관 전기영 동으로 분리 및 확인할 수 있었다.
- 최종적으로 이 두 칩을 결합하여 DNA 제한효소 반응을 수행하고 그 결과물을 모세관 전기영 동으로 검출할 수 있는 마이크로바이오칩을 제작하였다. 제작된 칩을 통해 기존 생화학 실험실에서 90분 가량 소모되던 제한효소 반응실험을 10분 이내로 단축 할 수 있었으며 검출에 걸리던 시간도 기존의 방법보다 줄일 수 있었다. 하지만 PDMS 자체의 소수성 성질 때문에 마이크로바이오칩이 완성된 후 8시간 이상이 지나면 모세관 현상이 사라져 전기영동 실행에 문제가 있음이 밝혀졌다.
- 채널 높이는 60,100 ㎛로 채널폭은 35, 50, 65, 80, 95 ㎛로 변화시키면서 각각의 채널 내에서의 IxTAE 완충액의 모세관 현상에 의한 유체 이동속도를 측정하였으며 그 결과는 Table 1과 같다. 측정 결과, 채널폭이 80 ㎛, 채널 높이가 100 ㎛ 일 때, 비교적 가장 빨리 모세관 현상으로 빈 채널이 용액으로 채워지는 것을 알 수 있었다. 하지만 산소 플라즈마 처리로 칩을 접합한 후 8 시간 이상 경과되면 마이크로채널에서는 더 이상 모세관 현상에 의한 액체 이 동이 발생하지 않았다.
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