선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 각 실리카를 동일한 조건으로 고정화한 활성의 변화를 측정해 보았다. 평균 공극이 50 nm 실리카에 고정화된 트립신이 10 nm에 비해 1.
- 대규모 산업공정을 위한 효소 고정화 담체로서 나노세공 실리카의 상용화 가능성을 조사하였다. 정량반응 시스템을 이용하여 1차 입자의 생성조건을 변화시킴으로써 여러 세공크기를 갖는 나노세공 실리카를 만들었으며, 비표면적, 세공 용적, 공극 크기 등의 물성 제어를 하였다 실리카와 효소 사이의 원활한 공유결합을 유도하기 위해, 실리카의 표면을 알데하이드기로 개질하였으며, Lucifer yellow라는 형광 dye를 이용하여 표면 개질을 확인하였다.
- 또한, 표면 기능기의 차이에 따른 고정화 양에 대해서도 알아보았다. 일반적으로 효소 고정화는 효소의 아민기와 지지체의 알데하이드기 간의 공유결합에 의해 일어난다고 알려져 있다.
- 본 연구에서는 규산나트륨을 이용한 sol-gel 공정에 의하여 고기능성 나노세공 실리카를 제조하기 위한 최적 합성 조건을 확립하고자 하였다. 이를 위하여 규산나트륨의 산 분해과정을 연속 공정에 의하여 수행하였고, 이때 농도, pH, 온도 등의 변수를 변화시키면서 합성되는 나노세공 실리카의 물성과의 관계를 조사하였다.
- 표면 개질된 실리카 위에 트립신을 고정화시켜 실리카의 공극크기와 표면 기능기에 따른 고정화 양을 측정하였고, 또한 고정화된 효소의 활성을 측정하였다. 이 결과를 다른 상용화되어 있는 지지체와 비교하여 실리카 지지체의 산업화 가능성을 평가하였다.
- 또 재사용 시 고정화된 트립신의 활성 변화를 관찰, 활성이 90%까지 유지되는 동안 10회 이상의 반복 사용이 가능함을 확인하였다. 이를 통하여 고정화 효소 시스템의 산업적 이용을 위한 가능성을 확인하였다. 실리카의 상용화 가능성을 평가하기 위하여 현재 상용화 되고 있는 지지체와 유사한 조건에서 실험 후 결과를 비교해 본 결과 나노세공 실리카의 효소 고정화용 지지체로서의 상용화 가능성을 발견할 수 있었다.
제안 방법
- 100℃ 이하에서 silicate 수용액과 무기산을 반응시켜 침전된 실리카를 제조하였다. 제조를 위한 monomer는 Si(OH)4이며, 이 monomer들은 water-glass 용액과 황산 수용액의 반응으로 생성된다.
- 10℃ 이하로 제어된 규산나트륨과 황산이 노즐 속에서 순간적으로 일정하게 정량적으로 만남으로 해서 혼합한 후 gelling시 primary 입자들이 균일하게 형성되도록 하였다 (Fig. 1). 또한 sol-gel 과정을 거쳐 실리카 표면을 Si-OH (silanol)기로 만들어 주었다.
- Gelling 반응이 진행된 슬러리를 고상 및 액상을 분리한 후 Fig. 1과 같은 시스템에서 요구되는 물성을 제어하기 위해 온도 및 유량제어, 산 및 알칼리 처리가 요구되는 물성이 될 때까지 진행하여 Na+, SO42- 이온을 제거함과 동시에 실리카의 중합 정도를 제어하였다(Fig. 2).
- 다공성 나노크기로 제조된 실리카 입자의 비표면적을 측정하였다. 비표면적 측정기 (ASAP 2020, Micromeritics, USA)를 이용하여 시료 0.
- 다른 지지체에 트립신을 고정화하여 실리카에 고정화된 트립신의 활성 및 고정화량을 비교하였다. 지지체로는zirconia, glycidyl-methacrylate, kieselgel silica, EU dragit S-100, PVCA, chitosaii을 사용하였다.
- Louis, USA) 1 mg/ml 용액 20 ㎕를 첨가하였다. 반응 후, 용액의 상층액을 분리한 후 단백질 정량분석하여, 각 조건에 따른 고정화 양을 측정하였다(10).
- 이 지지체는 다공성 (평균 공극직경은 100 nm)으로 평균지름이 65 ㎛이며, 표면이 알데하이드기로 되어있다. 비교를 위해 두 가지 모두 동일 농도와 양의 트립신을 사용하였다. 실험 결과 두 경우의 차이는 거의 없다고 볼 수 있다(Table 1).
- 다공성 나노크기로 제조된 실리카 입자의 비표면적을 측정하였다. 비표면적 측정기 (ASAP 2020, Micromeritics, USA)를 이용하여 시료 0.1-0.2 gram 정도 평량한 후 250℃ 에서 3시간 동안 처리한 후 무게를 측정하였고, BET (Braunauer Emmett Teller) 표면적 측정기를 이용하여 각각의 입자를 최소한 50 point까지 측정하였다.
- 실리카 외에 다른 담체들에 트립신을 고정화시켜 고정화 양과 트립신의 활성에 대해 비교하였다. 실리카가 다른 두 가지 지지체들에 비해 높은 고정화 양을 보임을 알 수 있다(Table 2).
- 실리카 표면이 알데하이드기로 개질되었는지 확인하기 위해 세 가지 다른 기능기를 가진 표면의 실리카를 lucifer yellow와 반응시켰다. 하이드록실기는 아주 미세한 형광을 보이고, 아민기는 전혀 형광을 검출할 수 없는 반면, 알데하이드기의 표면은 강한 형광을 나타내는 것을 볼 수 있다.
- 일반적으로 효소 고정화는 효소의 아민기와 지지체의 알데하이드기 간의 공유결합에 의해 일어난다고 알려져 있다. 실제로 이러한 이론이 어느 정도의 차이를 보여주는지 알아보기 위하여 서로 다른 기능기에서 고정화 실험을 해보았다. 하이드록실, 아민, 알데하이드기를 나타내는 세 가지 silica에 동일 조건에서 고정화하여 그 결과를 비교하였다.
- 알데하이드기로 표면 개질된 실리카 위에 고정화를 위한 최적의 트립신 농도를 찾기 위해, 0.2, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 2.2, 2.5, 2.9, 3.3 mg/ml의 트립신 용액을 silica 위에 고정화시켜 주었다. 고정화 량은 2.
- 알데하이드기로 표면개질시킨 silica의 개질 여부를 확인하기 위하여 Lucifer yellow ethylenediamine (Molecular Probes, Netherlands)과 반응시켰다. Lucifer yellow는 아민기를 갖고 있어 알데하이드기를 갖는 물질과 반응하여 강한 형광을 나타내는 dye이다(Fig.
- 표면 개질하였다. 우선 실리카의 표면을 깨끗하게 하기 위해 35% HCl과 absolute methanol (1 : 1) 혼합용액에 30분간 반응을 시켰다. 반응 후 증류수로 세척한 후, 97% H2SO4와 30분간 반응시켰다.
- 확립하고자 하였다. 이를 위하여 규산나트륨의 산 분해과정을 연속 공정에 의하여 수행하였고, 이때 농도, pH, 온도 등의 변수를 변화시키면서 합성되는 나노세공 실리카의 물성과의 관계를 조사하였다. 이 연구 결과는 고 기능성 실리카의 세공 크기, 형태, 세부구조 등을 제어하여 이상적인 나노 세공체의 제조를 가능하게 하는데 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
- 0)를 사용 3차례 세척하였다. 이와 같은 과정을 반복하면서 각 단계의 활성을 측정하였다.
- 재사용에 따른 고정화 트립신의 활성 변화를 측정하였다. 고정화된 트립신 용액 10 ㎕, 기질로서 a-N-benzoyl-L- arginine-p-nitroanilide hydrochloride (BAPNA, Sigma, St.
- 실리카의 상용화 가능성을 조사하였다. 정량반응 시스템을 이용하여 1차 입자의 생성조건을 변화시킴으로써 여러 세공크기를 갖는 나노세공 실리카를 만들었으며, 비표면적, 세공 용적, 공극 크기 등의 물성 제어를 하였다 실리카와 효소 사이의 원활한 공유결합을 유도하기 위해, 실리카의 표면을 알데하이드기로 개질하였으며, Lucifer yellow라는 형광 dye를 이용하여 표면 개질을 확인하였다. 실리카 위에 목적 효소인 트립신을 각 조건에 따라 고정화 시킨 결과 충분한 고정화를 위해서는 50 nm 정도의 공극 크기가 필요함을 알았고, 표면 차이에 따른 고정화 차이를 통해 고정화에 있어 표면개질의 중요성을 볼 수 있었다.
- 고정화 목적 효소로는 트립신을 사용하였다. 트립신 표면의 아민기와 실리카 표면 사이의 공유결합을 유도하기 위하여(6) 실리카를 알데하이드기로 표면 개질을 시도하였으며, 이를 Lucifer yellow dye와 반응시킨 후 confocal microscopy를 사용하여 결과를 확인하였다. 표면 개질된 실리카 위에 트립신을 고정화시켜 실리카의 공극크기와 표면 기능기에 따른 고정화 양을 측정하였고, 또한 고정화된 효소의 활성을 측정하였다.
- 0)에 녹여 1 mg/ml을 만들어 사용하였으며, 사용된 실리카는 공극 크기 별 비교를 제외한 모든 실험에서 50 nm 공극 크기인 실리카를 사용하였다. 트립신을 알데하이드기로 표면 개질된 실리카 위에 고정화시키기 위해 상온에서 3시간동안 반응을 시켜주었으며, 트립신의 아민기와 실리카의 알데하이드간의 원활한 공유결합을 유도하며 생성된 SchifFs base를 안정화시키기 위해 환원제인 95% sodium cyanoborohydride (NaBH3CN} Aldrich, St. Louis, USA) 1 mg/ml 용액 20 ㎕를 첨가하였다. 반응 후, 용액의 상층액을 분리한 후 단백질 정량분석하여, 각 조건에 따른 고정화 양을 측정하였다(10).
- 평균 공극 크기가 10, 50 nm인 나노세공 실리카를 이용하여 공극 크기가 활성에 미치는 영향을 알아보았다. 각 실리카를 동일한 조건으로 고정화한 활성의 변화를 측정해 보았다.
- 트립신 표면의 아민기와 실리카 표면 사이의 공유결합을 유도하기 위하여(6) 실리카를 알데하이드기로 표면 개질을 시도하였으며, 이를 Lucifer yellow dye와 반응시킨 후 confocal microscopy를 사용하여 결과를 확인하였다. 표면 개질된 실리카 위에 트립신을 고정화시켜 실리카의 공극크기와 표면 기능기에 따른 고정화 양을 측정하였고, 또한 고정화된 효소의 활성을 측정하였다. 이 결과를 다른 상용화되어 있는 지지체와 비교하여 실리카 지지체의 산업화 가능성을 평가하였다.
- 실제로 이러한 이론이 어느 정도의 차이를 보여주는지 알아보기 위하여 서로 다른 기능기에서 고정화 실험을 해보았다. 하이드록실, 아민, 알데하이드기를 나타내는 세 가지 silica에 동일 조건에서 고정화하여 그 결과를 비교하였다. 알데하이드 표면 실리카에서는 트립신이 350 ㎍/m2가 고정화되어 하이드록실 표면보다는 17배, 아민기 표면보다는 35배 높은 결과를 나타냈다.
- 2)로 5차례 세척하였다. 형광 발광 여부는 confocal microscopy (TSC SL, Leica, Germany)를 사용하여 관찰하였다.
- 효소 재사용 시 활성의 변화를 측정하였다. 약 12회 재사용까지는 효소 활성이 서서히 감소하여 초기 활성의 약 90% 수준을 유지하였으나 12회 이후부터는 활성의 뚜렷한 저하 현상을 관찰할 수 있었다(Fig.
대상 데이터
- 고정화 목적 효소로는 트립신을 사용하였다. 트립신 표면의 아민기와 실리카 표면 사이의 공유결합을 유도하기 위하여(6) 실리카를 알데하이드기로 표면 개질을 시도하였으며, 이를 Lucifer yellow dye와 반응시킨 후 confocal microscopy를 사용하여 결과를 확인하였다.
- 공극 크기 영향에 대한 실험에는 각 10, 14, 50 nm의 평균 공극 크기를 갖는 실리카를 사용하였다. 10, 14 nm 공극 크기 실리카에서는 고정화 양이 미미하였으나, 50 nm 공극 크기 실리카에서는 18배 정도 많은 350 ㎍/m2이 고정화되어 상대적으로 매우 높은 고정화 양을 보여준다.
- 이 실험에서 사용된 silica bead의 상용화 가능성을 증명하기 위해 비교 목적으로 사용된 지지체는 Toyopearl AF-Formyl-650M (Tosoh, Yamaguchi, Japan)이다. 이 지지체는 다공성 (평균 공극직경은 100 nm)으로 평균지름이 65 ㎛이며, 표면이 알데하이드기로 되어있다.
- (Tosoh, Yamaguchi, Japan)이다. 이 지지체는 다공성 (평균 공극직경은 100 nm)으로 평균지름이 65 ㎛이며, 표면이 알데하이드기로 되어있다. 비교를 위해 두 가지 모두 동일 농도와 양의 트립신을 사용하였다.
- 활성 및 고정화량을 비교하였다. 지지체로는zirconia, glycidyl-methacrylate, kieselgel silica, EU dragit S-100, PVCA, chitosaii을 사용하였다. 다만, 사용된 버퍼, 기질 등은 동일하지는 않았다(13-17).
- 트립신 (Sigma, St. Louis, USA)의 농도는 Langmuir plot을 제외한 모든 실험에서 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 10.0)에 녹여 1 mg/ml을 만들어 사용하였으며, 사용된 실리카는 공극 크기 별 비교를 제외한 모든 실험에서 50 nm 공극 크기인 실리카를 사용하였다. 트립신을 알데하이드기로 표면 개질된 실리카 위에 고정화시키기 위해 상온에서 3시간동안 반응을 시켜주었으며, 트립신의 아민기와 실리카의 알데하이드간의 원활한 공유결합을 유도하며 생성된 SchifFs base를 안정화시키기 위해 환원제인 95% sodium cyanoborohydride (NaBH3CN} Aldrich, St.
성능/효과
- 특히 고정화된 효소의 활성도 거의 비슷하여 실리카도 효소 활성을 유지할 수 있는 지지체임을 확인하였다. 고정화와 활성의 두 가지 비교를 통하며 상용화 bead와 큰 차이가 나지 않음을 볼 수 있으며, 이를 바탕으로 silica bead의 상용화 가능성을 확인할 수 있었다.
- 실리카 위에 목적 효소인 트립신을 각 조건에 따라 고정화 시킨 결과 충분한 고정화를 위해서는 50 nm 정도의 공극 크기가 필요함을 알았고, 표면 차이에 따른 고정화 차이를 통해 고정화에 있어 표면개질의 중요성을 볼 수 있었다. 또 재사용 시 고정화된 트립신의 활성 변화를 관찰, 활성이 90%까지 유지되는 동안 10회 이상의 반복 사용이 가능함을 확인하였다. 이를 통하여 고정화 효소 시스템의 산업적 이용을 위한 가능성을 확인하였다.
- 실리카가 다른 두 가지 지지체들에 비해 높은 고정화 양을 보임을 알 수 있다(Table 2). 또한, 활성 관련 비교를 보아도 실리카가 다른 지지체들에 비하여 specific activity와 재사용에 따른 활성의 감소율 역시 월등하게 좋음을 알 수 있다. 이는 실리카는 효소 고정화에 있어서 상당히 좋은 특성을 갖게 하는 지지체임을 보여주는 결과이다(13-17).
- 정량반응 시스템을 이용하여 1차 입자의 생성조건을 변화시킴으로써 여러 세공크기를 갖는 나노세공 실리카를 만들었으며, 비표면적, 세공 용적, 공극 크기 등의 물성 제어를 하였다 실리카와 효소 사이의 원활한 공유결합을 유도하기 위해, 실리카의 표면을 알데하이드기로 개질하였으며, Lucifer yellow라는 형광 dye를 이용하여 표면 개질을 확인하였다. 실리카 위에 목적 효소인 트립신을 각 조건에 따라 고정화 시킨 결과 충분한 고정화를 위해서는 50 nm 정도의 공극 크기가 필요함을 알았고, 표면 차이에 따른 고정화 차이를 통해 고정화에 있어 표면개질의 중요성을 볼 수 있었다. 또 재사용 시 고정화된 트립신의 활성 변화를 관찰, 활성이 90%까지 유지되는 동안 10회 이상의 반복 사용이 가능함을 확인하였다.
- 이를 통하여 고정화 효소 시스템의 산업적 이용을 위한 가능성을 확인하였다. 실리카의 상용화 가능성을 평가하기 위하여 현재 상용화 되고 있는 지지체와 유사한 조건에서 실험 후 결과를 비교해 본 결과 나노세공 실리카의 효소 고정화용 지지체로서의 상용화 가능성을 발견할 수 있었다.
- 실험에 사용된 공극 크기 별 실리카의 BET를 측정한 결과 공극크기가 증가할수록 BET, 즉 비표면적은 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 하이드록실, 아민, 알데하이드기를 나타내는 세 가지 silica에 동일 조건에서 고정화하여 그 결과를 비교하였다. 알데하이드 표면 실리카에서는 트립신이 350 ㎍/m2가 고정화되어 하이드록실 표면보다는 17배, 아민기 표면보다는 35배 높은 결과를 나타냈다. 이는 표면이 아민기를 나타내는 경우는 트립신과 electrostatic 결합 형태를 보이는 반면에 표면이 알데하이드기를 나타내는 경우는 트립신의 아민기와 쉽게 공유결합을 형성하기 때문이라 할 수 있디-.
- 효소 재사용 시 활성의 변화를 측정하였다. 약 12회 재사용까지는 효소 활성이 서서히 감소하여 초기 활성의 약 90% 수준을 유지하였으나 12회 이후부터는 활성의 뚜렷한 저하 현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 6). 하지만 약 10회까지의 재사용에도 초기 활성 대비 약 90%의 활성을 유지하였으므로 실리카 담체에 공유결합을 통해 고정화된 경우 효소 재사용에도 유리하다 할 수 있다(12).
- 실험 결과 두 경우의 차이는 거의 없다고 볼 수 있다(Table 1). 특히 고정화된 효소의 활성도 거의 비슷하여 실리카도 효소 활성을 유지할 수 있는 지지체임을 확인하였다. 고정화와 활성의 두 가지 비교를 통하며 상용화 bead와 큰 차이가 나지 않음을 볼 수 있으며, 이를 바탕으로 silica bead의 상용화 가능성을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 이를 위하여 규산나트륨의 산 분해과정을 연속 공정에 의하여 수행하였고, 이때 농도, pH, 온도 등의 변수를 변화시키면서 합성되는 나노세공 실리카의 물성과의 관계를 조사하였다. 이 연구 결과는 고 기능성 실리카의 세공 크기, 형태, 세부구조 등을 제어하여 이상적인 나노 세공체의 제조를 가능하게 하는데 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.