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문제 정의
- 1). 본 논문에서는 라이코펜 생산 유전자가 도입된 재조합 대장균의 라이코펜 생산성을 향상시키기 위하여 transposon 및 NTG (nitrosoguanidine) 돌연변이 방법을 이용하였고, 이런 무작위 돌연변이 방법이 대사공학 기술을 이용한 균주개량 방법과 더불어 효율적으로 라이코펜 고생산성 균주를 개발하는데 적용될 수 있음을 제시하고 있다.
- 본 연구는 대사공학 기술을 이용해서 라이코펜 생산 균 주의 생산성을 향상시키는 것과 더불어 Tn 및 NTG를 이용한 무작위 돌연변이 기술이 라이코펜 생산 균주 개량에 효과적으로 적용될 수 있음을 제시하고 있다. 이것은 라이 코펜이 색소 물질로서 돌연변이로 생산성이 향상된 콜로니를 색깔로서 쉽게 선별할 수 있기 때문이다.
제안 방법
- 1차 선발된 돌연변이체의 Tn 부위를 형질도입 방법에 의해 pAC-LYCO4를 함유하는 재조합 MG1655 야생형 균 주에 옮겨서 라이코펜 생산성 증가가 그대로 유지되는지를 확인함으로써 최종적으로 5개의 Tn 돌연변이체를 선발하였다 (data not shown here). 이들 Tn 돌연변이체에 MEP 경로의 율속단계 유전자 広s를 갖는 pDdxs 플라스미드를 추가로 도입하고 야생형 MG1655 재조합 균주와의 라이코 펜 생산성을 비교하였다(Fig.
- 정제된 DNA는 희석하여 ligation 반응을 수행하고, 이를 주형으로 하고 TNPO 와 TNPI(14)를 primer로 하여 inverse PCR을 수행하였다. PCR 산물은 정제한 후 TNPO를 primer로 sequencing 반응을 수행하고 ABI 3100 genetic analyzer (ABI, US)를 이용하여 염기 서열을 결정하였으며, NCBI database (http://www.ncbi. nlm.nih.gov) 의 대장균 MG1655의 염색체 염기서열과 비교하여 Tn의 위치를 확인하였다. 염색체 DNA의 분리, 제한효소 처리 등은 Sambrook J.
- 라이코펜은 균체 내에 축적되는 물질로 생산 공정에서의 유기 용매 추출 공정을 고려할 때에 높은 균체 내 함량은 균주개량의 중요한 기준의 하나가 된다. Tn 삽입에 의해서 결손된 유전자를 파악하기 위하여 Tn 변이체의 염색체 DNA를 분리한 후에 &w3AI 또는 Taql 제한 효소로 절단하고 self-ligation 시켜서 얻은 반응액을 주형으로 하여 inverse PCR을 수행하였다. 그 후에 PCR 산물의 염기서열을 결정하고 NCBI database 상의 대장균 MG1655 균주의 염색체 염기서열과 비교하여 Tn이 삽입된 유전자의 위치를 확인하였다.
- Transposon 변이체 라이브러리 검색에서 라이코펜 생산이 증가된 균주를 배양 후 균체를 얻어 transposon (Tn) 이 삽입되어 있는 염색체 DNA를 추출하였고, 이를 TaqI 제한효소로 처리하여 잘려진 DNA를 PCR purification kit (솔젠트 (주), 대전)를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA는 희석하여 ligation 반응을 수행하고, 이를 주형으로 하고 TNPO 와 TNPI(14)를 primer로 하여 inverse PCR을 수행하였다.
- Tn 삽입에 의해서 결손된 유전자를 파악하기 위하여 Tn 변이체의 염색체 DNA를 분리한 후에 &w3AI 또는 Taql 제한 효소로 절단하고 self-ligation 시켜서 얻은 반응액을 주형으로 하여 inverse PCR을 수행하였다. 그 후에 PCR 산물의 염기서열을 결정하고 NCBI database 상의 대장균 MG1655 균주의 염색체 염기서열과 비교하여 Tn이 삽입된 유전자의 위치를 확인하였다. 그 결과, Tn3, Tn4, Tn5는 rfaH 유전자 (transcription antiterminator for polysaccharide associated operons) 위치에, Tnle treB 유전자 (PTS system enzyme Ⅱ, trehalose specific), Tn2는 B2436 유전자 (putative multimodular enzyme) 위치에 삽입되어 있음을 확인하였다.
- 라이코펜 생산성이 증가된 돌연변이체를 선별하기 위해서 다양한 농도의 NTG를 처리하고, 한 개의 LB 한천 고체 배지에 약 500 ~ 800개의 콜로니가 자랄 수 있도록 희석하여 도말하였다. 그 후에 약 25,000개 이상의 콜로니의 색깔을 비교 관찰하여 MG1655 야생형 재조합 균주의 콜로니 색깔보다 더 진한 붉은색을 나타내는 20개의 돌연변이체를 1차 선발하였다. 또한 대장균 MG1655 염색체 DNA에 변이 가 일어나지 않고 pAC-LYCO4 플라스미드에 변이가 일어나 서 라이코펜 생산성이 증가될 수 있는 가능성을 배제하기 위하여 1차 선별한 돌연변이 균주로부터 pAC-LYCO4 플라스미드를 제거한 후에 변이가 없는 pAC-LYCO4 플라스미드를 돌연변이 균주에 재도입하여 라이코펜 생산성을 정량하였다.
- 대장균 MG1655 균주의 염색체 DNA 내에 존재하는 특정 유전자의 기능이 상실되었을 때 라이코펜 생산성이 증 가되는 변이체를 선발하기 위해서 transposon 돌연변이를 수행하였다. 우선 transposon (Tn) 인 TnphoA-4, 가 숙주 균주의 염색체 DNA 내에 무작위로 삽입된 약 25,000개의 변 이체 라이브러리를 제조하였다.
- 라이코펜 생산성을 향상시키기 위하여 몇 가지 대장균 균주들을 대상으로 생산성 시험을 한 결과 MG1655 균주가 가장 우수하였다. 대장균 MG1655 균주의 염색체 DNA 내에 존재하는 특정 유전자의 기능이 상실되었을 때 라이코펜 생산성이 증가되는 변이체를 선발하기 위해 transposon 돌연변이를 수행하였으며, 5종의 우수 transposon 변이체를 얻었다. 특히, Tn4 변이체는 야생형 MG1655에 비해서 라이코펜 생산량은 6배, 균체 내 함량은 7배로 가장 높았다.
- 라이코펜 생산성에 별다른 문제가 없으면서 유전학적 방법들의 도입이 용이한 균주를 찾기 위해서 실험실에서 사용되는 몇 가지의 대장균 균주들을 대상으로 하여 라이 코펜 생산성을 시험하였다. 대장균 OW1, MG1655, W3110 균주에 pDdxs와 pAC-LYCO4 플라스미드(Table 1)를 도입해서 라이코펜 생산능력을 부여한 후 기존에 이용되었던 상동성 재조합이 불가능한 대장균 DH5a와 라이코펜 생산성 정도를 LB 한천 고체 배지 상에서의 콜로니 색상으로 비교하였다. 라이코펜은 붉은색의 색소 물질로 라이코펜 생 산량에 비례해서 콜로니의 색은 붉은색을 띄게 된다.
- 그 후에 약 25,000개 이상의 콜로니의 색깔을 비교 관찰하여 MG1655 야생형 재조합 균주의 콜로니 색깔보다 더 진한 붉은색을 나타내는 20개의 돌연변이체를 1차 선발하였다. 또한 대장균 MG1655 염색체 DNA에 변이 가 일어나지 않고 pAC-LYCO4 플라스미드에 변이가 일어나 서 라이코펜 생산성이 증가될 수 있는 가능성을 배제하기 위하여 1차 선별한 돌연변이 균주로부터 pAC-LYCO4 플라스미드를 제거한 후에 변이가 없는 pAC-LYCO4 플라스미드를 돌연변이 균주에 재도입하여 라이코펜 생산성을 정량하였다. 이 과정을 통해서 최종적으로 5개의 돌연변이 균주를 선별하였다(data not shown here).
- Transposon 삽입에 의해 결손된 유전자를 파악하기 위해 inverse PCR을 통해 염기서열을 확인하였으며, 결손된 유전자는 rfaH, treB, B2436으로 규명되었다. 또한 특정 유전자 기능의 상실뿐만 아니라 기능의 강화나 변화 등에 의한 라이코펜 생산성이 증가된 변이체를 선발하기 위해 NTG 돌연변이를 수행하였으며, 4개의 우수한 NTG 변이체를 얻었다. 이들 중에 NTG4 변이체가 가장 높은 라이코펜 생산량을 보였다.
- 라이코펜 생산성에 별다른 문제가 없으면서 유전학적 방법들의 도입이 용이한 균주를 찾기 위해서 실험실에서 사용되는 몇 가지의 대장균 균주들을 대상으로 하여 라이 코펜 생산성을 시험하였다. 대장균 OW1, MG1655, W3110 균주에 pDdxs와 pAC-LYCO4 플라스미드(Table 1)를 도입해서 라이코펜 생산능력을 부여한 후 기존에 이용되었던 상동성 재조합이 불가능한 대장균 DH5a와 라이코펜 생산성 정도를 LB 한천 고체 배지 상에서의 콜로니 색상으로 비교하였다.
- 라이코펜 생산성이 증가된 돌연변이체를 선별하기 위해서 다양한 농도의 NTG를 처리하고, 한 개의 LB 한천 고체 배지에 약 500 ~ 800개의 콜로니가 자랄 수 있도록 희석하여 도말하였다. 그 후에 약 25,000개 이상의 콜로니의 색깔을 비교 관찰하여 MG1655 야생형 재조합 균주의 콜로니 색깔보다 더 진한 붉은색을 나타내는 20개의 돌연변이체를 1차 선발하였다.
- 라이코펜 합성 유전자를 함유한 MG1655 재조합 균주에 강력한 돌연변이 원인 NTG를 처리하여 무작위 돌연변이를 시킨 다음 라이코펜 생산성이 증가된 돌연변이체를 선별하였다. 상기한 transposon 돌연변이는 변이가 일어난 유전자를 알 수 있지만 유도 가능한 변이는 transposon 삽입에 의한 결손으로 제한되는 단점이 있다.
- 균주 및 플라스미드는 Table 1에 나타내었다. 모든 대장균 균주의 배양은 LB (Luria Bertanii) 배지, 또는 LB 한천 고체 배지에서 수행하였다. 선별 항생제로서 ampicillin, kanamycin 및 chloramphenicol을 각각 100, 25 및 50 μg/ml의 농도로 첨가하였으며, pBAD24(ll) 플라스미드에 대한 유도물질인 arabinose는 물에 용해하였고 후에 기술한 농도에 따라 투여하였다.
- 모든 대장균 균주의 배양은 LB (Luria Bertanii) 배지, 또는 LB 한천 고체 배지에서 수행하였다. 선별 항생제로서 ampicillin, kanamycin 및 chloramphenicol을 각각 100, 25 및 50 μg/ml의 농도로 첨가하였으며, pBAD24(ll) 플라스미드에 대한 유도물질인 arabinose는 물에 용해하였고 후에 기술한 농도에 따라 투여하였다.
- 를 함유하는 재조합 MG1655 야생형 균 주에 옮겨서 라이코펜 생산성 증가가 그대로 유지되는지를 확인함으로써 최종적으로 5개의 Tn 돌연변이체를 선발하였다 (data not shown here). 이들 Tn 돌연변이체에 MEP 경로의 율속단계 유전자 広s를 갖는 pDdxs 플라스미드를 추가로 도입하고 야생형 MG1655 재조합 균주와의 라이코 펜 생산성을 비교하였다(Fig. 2). 라이코펜 생산량과 균체 내 함량 면에서 모두 Tn 돌연변이체가 야생형인 균주에 비해서 2배 이상 높았고, 특히 Tn4 변이체의 경우에는 라 이코펜 생산량은 6배, 균체 내 함량은 7배로 가장 높았다.
- Transposon 변이체 라이브러리 검색에서 라이코펜 생산이 증가된 균주를 배양 후 균체를 얻어 transposon (Tn) 이 삽입되어 있는 염색체 DNA를 추출하였고, 이를 TaqI 제한효소로 처리하여 잘려진 DNA를 PCR purification kit (솔젠트 (주), 대전)를 이용하여 정제하였다. 정제된 DNA는 희석하여 ligation 반응을 수행하고, 이를 주형으로 하고 TNPO 와 TNPI(14)를 primer로 하여 inverse PCR을 수행하였다. PCR 산물은 정제한 후 TNPO를 primer로 sequencing 반응을 수행하고 ABI 3100 genetic analyzer (ABI, US)를 이용하여 염기 서열을 결정하였으며, NCBI database (http://www.
대상 데이터
- 그 결과, W3110과 OW1 균주의 라이코펜 생산성은 DH5a의 라이코펜 생산성보다 매우 낮았으나 MG1655 균주의 경우에는 DH5a의 라이코펜 생산성과 거의 유사하였다(Table 2). 따라서 유전체 염기서열 분석이 완료되어서 유전학적 연구가 용이할 뿐만 아니라 라이코펜 생산성도 우수한 MG1655 균주를 돌연변이를 이용한 라이코펜 생산성 향상 연구의 숙주 균주로 선정하였다.
- 대장균 MG1655 균주의 염색체 DNA 내에 존재하는 특정 유전자의 기능이 상실되었을 때 라이코펜 생산성이 증 가되는 변이체를 선발하기 위해서 transposon 돌연변이를 수행하였다. 우선 transposon (Tn) 인 TnphoA-4, 가 숙주 균주의 염색체 DNA 내에 무작위로 삽입된 약 25,000개의 변 이체 라이브러리를 제조하였다. 이 라이브러리에 라이코펜 생합성 유전자 함유 PAC-LYCO4 플라스미드를 도입하였고 한천 고체 배지 상의 콜로니 색깔을 비교함으로써 야생형 균주의 콜로니 색깔보다 더 진한 붉은 색을 띠는 돌연변이체 14개 균주를 1차 선발하였다
- 또한 대장균 MG1655 염색체 DNA에 변이 가 일어나지 않고 pAC-LYCO4 플라스미드에 변이가 일어나 서 라이코펜 생산성이 증가될 수 있는 가능성을 배제하기 위하여 1차 선별한 돌연변이 균주로부터 pAC-LYCO4 플라스미드를 제거한 후에 변이가 없는 pAC-LYCO4 플라스미드를 돌연변이 균주에 재도입하여 라이코펜 생산성을 정량하였다. 이 과정을 통해서 최종적으로 5개의 돌연변이 균주를 선별하였다(data not shown here).
- 우선 transposon (Tn) 인 TnphoA-4, 가 숙주 균주의 염색체 DNA 내에 무작위로 삽입된 약 25,000개의 변 이체 라이브러리를 제조하였다. 이 라이브러리에 라이코펜 생합성 유전자 함유 PAC-LYCO4 플라스미드를 도입하였고 한천 고체 배지 상의 콜로니 색깔을 비교함으로써 야생형 균주의 콜로니 색깔보다 더 진한 붉은 색을 띠는 돌연변이체 14개 균주를 1차 선발하였다
이론/모형
- gov) 의 대장균 MG1655의 염색체 염기서열과 비교하여 Tn의 위치를 확인하였다. 염색체 DNA의 분리, 제한효소 처리 등은 Sambrook J. 등(15)에 명시된 방법에 따라 수행하였으며, 반응된 DNA의 정제, ligation 및 PCRe 솔젠트(주)의 제품을 사용하여 수행하였다.
성능/효과
- Arabinose 0.013 mM이 첨가된 LB 배지에서 NTG4 돌연 변이주는 6 mg/L 와 4 mg/g DCW의 라이코펜 생산성을 보였고, 이것은 MG1655 야생형 재조합 균주에 비해서 농도 는 18배, 균체 내 함량 면에서는 12배 이상 라이코펜 생산성이 증대된 것이다.
- 특히, Tn4 변이체는 야생형 MG1655에 비해서 라이코펜 생산량은 6배, 균체 내 함량은 7배로 가장 높았다. Transposon 삽입에 의해 결손된 유전자를 파악하기 위해 inverse PCR을 통해 염기서열을 확인하였으며, 결손된 유전자는 rfaH, treB, B2436으로 규명되었다. 또한 특정 유전자 기능의 상실뿐만 아니라 기능의 강화나 변화 등에 의한 라이코펜 생산성이 증가된 변이체를 선발하기 위해 NTG 돌연변이를 수행하였으며, 4개의 우수한 NTG 변이체를 얻었다.
- pAC-LYCO4 플라스미드를 지니고 있는 이들 4개 NTG 돌연변이 균주에 pDdxs 플라스미드를 부가적으로 도입하여 라이코펜 생산성을 확인해 본 결과, 4개의 돌연변이 주 중에서 NTG4로 명명된 돌연변이 균주가 가장 높은 라이 코펜 생산성을 나타냈다(Fig. 3). NTG4 돌연변이 균주의 또 다른 장점은 소량의 arabinose 첨가로도 높은 라이코펜 생산성을 얻을 수 있는 것이다(Fig.
- 그 후에 PCR 산물의 염기서열을 결정하고 NCBI database 상의 대장균 MG1655 균주의 염색체 염기서열과 비교하여 Tn이 삽입된 유전자의 위치를 확인하였다. 그 결과, Tn3, Tn4, Tn5는 rfaH 유전자 (transcription antiterminator for polysaccharide associated operons) 위치에, Tnle treB 유전자 (PTS system enzyme Ⅱ, trehalose specific), Tn2는 B2436 유전자 (putative multimodular enzyme) 위치에 삽입되어 있음을 확인하였다. 이들 유전자의 기능 상실이 어떻게 해서 라이코펜 생산성 증진에 영향을 미치는지는 유추하기가 쉽지 않았으나, 무작위 transposon 돌연변이를 통해서 기존에 보고가 되지 않은 라이코펜 생산과 관련된 신규 유전자 3개를 발굴하게 되었다.
- 라이코펜은 붉은색의 색소 물질로 라이코펜 생 산량에 비례해서 콜로니의 색은 붉은색을 띄게 된다. 그 결과, W3110과 OW1 균주의 라이코펜 생산성은 DH5a의 라이코펜 생산성보다 매우 낮았으나 MG1655 균주의 경우에는 DH5a의 라이코펜 생산성과 거의 유사하였다(Table 2). 따라서 유전체 염기서열 분석이 완료되어서 유전학적 연구가 용이할 뿐만 아니라 라이코펜 생산성도 우수한 MG1655 균주를 돌연변이를 이용한 라이코펜 생산성 향상 연구의 숙주 균주로 선정하였다.
- 2). 라이코펜 생산량과 균체 내 함량 면에서 모두 Tn 돌연변이체가 야생형인 균주에 비해서 2배 이상 높았고, 특히 Tn4 변이체의 경우에는 라 이코펜 생산량은 6배, 균체 내 함량은 7배로 가장 높았다. 라이코펜은 균체 내에 축적되는 물질로 생산 공정에서의 유기 용매 추출 공정을 고려할 때에 높은 균체 내 함량은 균주개량의 중요한 기준의 하나가 된다.
- 라이코펜 생산성을 향상시키기 위하여 몇 가지 대장균 균주들을 대상으로 생산성 시험을 한 결과 MG1655 균주가 가장 우수하였다. 대장균 MG1655 균주의 염색체 DNA 내에 존재하는 특정 유전자의 기능이 상실되었을 때 라이코펜 생산성이 증가되는 변이체를 선발하기 위해 transposon 돌연변이를 수행하였으며, 5종의 우수 transposon 변이체를 얻었다.
- 이들 중에 NTG4 변이체가 가장 높은 라이코펜 생산량을 보였다. 특히, NTG4 변이체는 발현유도물질인 arabinose의 소량 (0.013mM) 첨가 시에 라이코펜 농도, 6 mg/L 와 균체 내 함량 4 mg/g DCW로 최대의 라이코펜 생산성을 보였고, 이것은 야생형 MG1655에 비해서 각각 18배와 12배 높은 생산성이다.
- 대장균 MG1655 균주의 염색체 DNA 내에 존재하는 특정 유전자의 기능이 상실되었을 때 라이코펜 생산성이 증가되는 변이체를 선발하기 위해 transposon 돌연변이를 수행하였으며, 5종의 우수 transposon 변이체를 얻었다. 특히, Tn4 변이체는 야생형 MG1655에 비해서 라이코펜 생산량은 6배, 균체 내 함량은 7배로 가장 높았다. Transposon 삽입에 의해 결손된 유전자를 파악하기 위해 inverse PCR을 통해 염기서열을 확인하였으며, 결손된 유전자는 rfaH, treB, B2436으로 규명되었다.
후속연구
- 벡터 PBAD24 내에 도입된 외래 유전자의 발현 유도물질로서 사용되는 arabinose는 가격이 비싸서 라이코 펜 대량 생산 공정에 사용하기가 어려운 측면이 있다. 그러나 NTG4 돌연변이 균주를 이용하게 되면 arabinose를 소량 첨가하여도 최대의 생산성을 얻을 수 있으므로 라이코 펜 대량생산이 가능할 것으로 기대된다.
- 앞에서 언급한 바와 같이 무작위 Tn 돌연변이 연구를 통해서 염색체상의 rfaH, treB, B2463 유전자들이 Tn 삽입에 의해 기능이 상실되었을 때 라이코펜 생산성이 증진되는 것을 확인한 바가 있다. 따라서 라이코펜 생산성이 증가된 Tn 변이주들의 변이를 P1 형질도입을 이용해서 NTG 처리에 의해 얻어진 우량 돌연변이 균주 NTG4에 옮긴다면 라이코펜 생산성이 더욱 증가된 새로운 변이주를 얻는 것도 가능할 것이다.
- 이들 유전자의 기능 상실이 어떻게 해서 라이코펜 생산성 증진에 영향을 미치는지는 유추하기가 쉽지 않았으나, 무작위 transposon 돌연변이를 통해서 기존에 보고가 되지 않은 라이코펜 생산과 관련된 신규 유전자 3개를 발굴하게 되었다. 이러한 결과를 통해서 앞으로 라이코펜 생산 균주로 사용하게 될 재조합 대장균에 이들 유전자의 결손을 유도함으로써 부가적으로 라이코펜 생산성을 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.
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