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문제 정의
- 본 연구에서는 capillary electrophoresis 의 일종인 micellar electrokinetic capillary chromatography(MECC)법18과 Ion-Paring을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피법19을 이용하여 몇 가지 아조계 직접염료와 반응성 염료 및 그들의 중간체 그리고 디아조 염료의 환원반응을 통하여 얻은 디아조 성분 혹은 커플링 성분(Fig. 1 참조)에 대한 분석법을 연구하였다.
제안 방법
- Fig. 1에 나타낸 디아조계 염료의 환원은 이미 발표된 방법20,21을 약간 수정하여 수행하였다. 요약하면, 약 4.
- 005 g 을 초순수에 녹여 얻었다. Ion-Pair 크로마토그래프는 Shimadzu 사의 Shim-Pack CLC-ODS(15 cm) column을 사용하여 얻었으며, 이동상의 흐름 속도와 혼합비의 조정은 LC-10AD pump 2대를 이용하여 조정하였고, 검출기는 photodiode array가 장착된 UV detector(SPD-M10A)를 사용하여 얻은 후 240 nm에서의 신호를 이용하여 크로마토그램을 나타내었다.
- 본 연구에서는 Ion-Paring을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피법과 aminoacid, nucleic acid등 전하를 갖는 biomolecule들의 분리에서 발전된 후, 최근에는 금속이온과 같은 작은 이온은 물론 전하를 포함하지 않는 중성의 유기물질의 분리에 이르기까지 대단히 넓은 응용범위를 갖는 모세관 전기영동장치 (capillary electrophoresis)를 이용하여 H-acid의 OH기가 붙은 탄소의 이웃에 아민기가 하나 더 붙어있는 H-acid modifier와, 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid 등의 디아조 성분에 대하여 완전한 분리를 시도하였다. 실험 결과 Direct Blue 2, Direct Blue 6, Direct Blue 15등의 직접염료 그리고 Reactive Orange 4와 같은 반응성 염료에 대한 완전한 분리를 얻었으며, 특히 각 염료의 환원용액을 H-acid, J-acid, γ-acid, orthanilic acid, sulfanilic acid, 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid 등의 표준물질과 비교 분석한 결과 사용한 각 염료의 디아조 혹은 커플링 성분을 완벽하게 분석할 수 있음을 알 수 있었다.
- 이 크로마토그램은 Ion-Pair 크로마토그래피법을 이용하여 얻었는데, 이 방법은 전체적 혹은 부분적으로 해리된 이온시료나 극성이 매우 높은 시료의 분리에 이용되는 역상 크로마토그래피법의 일종으로22, 이 동상으로 메탄올, 프로판올과 같은 알콜용매나 아세토니트릴 같은 약간의 유기용매(organic modifier)와 분석 대상 이온과 반대전하를 띠는 counter ion을 포함하는 수용액이 많이 이용되며 일정한 pH를 유지하기 위하여 완충용액을 사용하는 것이 보통이다. 본 연구에서는 tetrabutylammonium hydrogensulfate 이온을 포함한 pH 6.5인 완충용액을 1.5 mL/min의 속도로 흘려주면서 얻었다. 이 아조염료에 대한 크로마토그램은 염료의 디아조 혹은 커플링 성분에 대한 확인 가능성을 확인하기 위하여 염료를 0,1N NaOH와 sodium hydrosulfate 존재 하에서 환원시킨 용액에 대한 크로마토그램(B의 c)과 비교하였다.
- 분해물의 분리 가능성을 알아보기 위하여 Fig. 6에 환원하면 각각 sulfanilic acid, 2-naphthylamine-1,5- disulfonic acid 그리고 H-acid의 디아조 성분으로 분해 되는 Acid Orange 7, Reactive Orange 4 그리고 Acid Blue 92의 혼합용액(Fig. 6의 A)과 혼합용액을 환원한 용액의 electropherogram(Fig. 6의 B)을 나타내었다. 위의 세 염료성분이 잘 분리된 electropherogram(Fig.
- 앞에서 언급한 바와 같이 아조염료는 방향족 아민류를 디아조화(diazotization) 해서 얻는 디아조 화합물인 디아조 성분과 페놀(phenol)류, 나프톨(naphthol)류, 아닐린(anilin)류, 나프틸아민(naphthylamine)류, 그리고 활성 메틸렌 화합물 등의 커플링 성분을 결합 시켜서 제조한다. 아조염료는 염색 혹은 착색과정 중에서 혹은 염색과정 후의 반복되는 세탁등의 과정에서 분해 되어 방향족 아릴아민류의 화합물이 생성되는데, Fig 2에 아조염료 중의 하나인 Reactive Orange 4가 분해 되는 과정과 생성되는 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid와 나프탈렌류의 분해물질의 구조를 나타내었다.
대상 데이터
- 한편 환원반응에 이용된 시약은 sodium hydrosulfite(Kanto Chemical)과 charcoal(EP급, Yakuri)등이다. Fig. 1에 분석에 사용된 디아조 성분 혹은 커플링 성분과 염료의 구조를 나타내었는데 이들은 Sigma(content : 75 %)나 혹은 Aldrich(content : 40 %) 제품을 구입하여 정제하지 않고 사용하였다.
- 시료의 분석에 이용한 capillary column은 50 μm×60 cm(effective length 52.5 cm, Polymicro Technologies INC, AZ, lUSA)로 Waters 사의 CIA 장비를 사용하였으며, 시료의 검출은 185 nm 혹은 254 nm에서 수행하였다. 한편 UV/VIS 스펙트럼은 Shimadzu 사의 spectrophotometer(UV-1601PC)를 사용하여 각 염료 0.
- 완충용액 조제를 위한 시약은 tetrabutylammonium hydrogen sulfate(98 %, Janssen), dipotassium hydrophosphate(GP급, Kanto Chemical), 2-propanol(HPLC급, EM Science), sodium tetraborate(1급, Shinyo Pure Chemical), sodium dodecyl sulfate(EP, Aldrich), boric acid(EP, Aldrich) 등을 사용하였는데 모두 EM Science의 초순수(HPLC급)를 이용하여 조제하였다. 한편 환원반응에 이용된 시약은 sodium hydrosulfite(Kanto Chemical)과 charcoal(EP급, Yakuri)등이다.
- 크로마토그래피용 완충용액에는 분석에 사용된 염료가 음이온성이므로, 그 counter ion인 tetrabutylammonium hydrogen sulfate를 사용하였다. 완충용액 0.
성능/효과
- 아조염료 Reactive Orange 4는 표준용액에 대한 크로마토그램(B의 b)에서 보는 바와 같이 Reactive Orange 4에 해당하는 retention time ~8 min에서의 주성분(peak 7)과 ~3 min 에서의 보조성분의 두 peak 를 나타내었는데 ~3 min peak는 이 염료의 환원 용액(B의 c)과 표준물질(B의 a)인 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid의 그것과 잘 일치하는 것으로 보아 보조성분은 2-naphthylamine1,5-disulfonic acid로 애초에 포함된 불순물의 형태나 혹은 염료 자체의 분해로 생성된 것으로 판단된다. 한편, 염료용액을 환원한 후 얻은 크로마토그램(B의 c)는 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid 표준용액의 크로마토그램(B의 a)와 잘 일치하는 것으로 보아 Reactive Orange 4의 분해물질에 대한 분석이 가능함을 알 수 있었다. 이러한 분석결과는 분해능이 좋은 MECC법에서 더욱 두드러졌는데, Reactive Orange 4의 electropherogram(A의 b)에 의하면 실험에 사용된 염료는 주성분(peak 4) 외에 peak 5등 적어도 2가지 이상의 불순물을 포함하는 것으로 판단되며 그의 환원 용액의 경우(A의 a) 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid(peak 2) peak 1, 3 등의 다른 성분을 포함하고 있으며 특히 peak 1의 경우 환원 반응 후 시간이 경과함에 따라 띠 너비가 넓어지는 등의 변화를 보이는 것으로 보아 염료의 다른 이온 성분으로 수용액 속에서 hydrolysis가 진행되는 것으로 판단되나 이에 대하여는 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.
- 이 아조염료에 대한 크로마토그램은 염료의 디아조 혹은 커플링 성분에 대한 확인 가능성을 확인하기 위하여 염료를 0,1N NaOH와 sodium hydrosulfate 존재 하에서 환원시킨 용액에 대한 크로마토그램(B의 c)과 비교하였다. 아조염료 Reactive Orange 4는 표준용액에 대한 크로마토그램(B의 b)에서 보는 바와 같이 Reactive Orange 4에 해당하는 retention time ~8 min에서의 주성분(peak 7)과 ~3 min 에서의 보조성분의 두 peak 를 나타내었는데 ~3 min peak는 이 염료의 환원 용액(B의 c)과 표준물질(B의 a)인 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid의 그것과 잘 일치하는 것으로 보아 보조성분은 2-naphthylamine1,5-disulfonic acid로 애초에 포함된 불순물의 형태나 혹은 염료 자체의 분해로 생성된 것으로 판단된다. 한편, 염료용액을 환원한 후 얻은 크로마토그램(B의 c)는 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid 표준용액의 크로마토그램(B의 a)와 잘 일치하는 것으로 보아 Reactive Orange 4의 분해물질에 대한 분석이 가능함을 알 수 있었다.
- 이들을 혼합한 용액을 환원한 후 얻은 electropherogram은 매우 많은 peak로 이루어져 있음에도 불구하고 각 염료를 별도로 환원한 용액에 대한 electropherogram(data는 나타내지 않음) 들을 모두 합한 것과 매우 유사하여, Acid Orange 7가 분해된 sulfanilic acid(peak 6), Reactive Orange 4가 분해된 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid(peak 8) 그리고 Acid Blue 92에서 유래된 H-acid(peak 11) 등을 확인할 수 있었다. 그 외의 peak는 불순물이나 미확인 물질에서 유래한 것으로 peak 5는 잔류한 Acid Orange 7, peak 7과 9는 Reactive Orange 4의 환원용액에서 그리고 peak 10은 Acid Blue 92의 환원용액에서 기인하는 것으로 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 Ion-Paring을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피법과 aminoacid, nucleic acid등 전하를 갖는 biomolecule들의 분리에서 발전된 후, 최근에는 금속이온과 같은 작은 이온은 물론 전하를 포함하지 않는 중성의 유기물질의 분리에 이르기까지 대단히 넓은 응용범위를 갖는 모세관 전기영동장치 (capillary electrophoresis)를 이용하여 H-acid의 OH기가 붙은 탄소의 이웃에 아민기가 하나 더 붙어있는 H-acid modifier와, 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid 등의 디아조 성분에 대하여 완전한 분리를 시도하였다. 실험 결과 Direct Blue 2, Direct Blue 6, Direct Blue 15등의 직접염료 그리고 Reactive Orange 4와 같은 반응성 염료에 대한 완전한 분리를 얻었으며, 특히 각 염료의 환원용액을 H-acid, J-acid, γ-acid, orthanilic acid, sulfanilic acid, 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid 등의 표준물질과 비교 분석한 결과 사용한 각 염료의 디아조 혹은 커플링 성분을 완벽하게 분석할 수 있음을 알 수 있었다. 이런 결과를 바탕으로 Ion-Pair 크로마토그래피법과 모세관 전기영동법은 미지의 염료에 대한 성분확인 및 디아조 혹은 커플링 성분분석에 응용할 수 있음을 보였다.
- 6의 A)에서 보는 바와 같이 Acid Orange 7(peak 1)과 Reactive Orange 4(peak 2와)의 경우 다른 실험으로부터 얻은 electropherogram(data는 나타내지 않음)과 유사하게 매우 좁은 띠 너비의 peak를 나타내며 Acid Blue 92(peak 3)의 상대적으로 넓은 띠 너비도 다른 결과와 일치하며, peak 4는 Reactive Orange 4의 불순물이다. 이들을 혼합한 용액을 환원한 후 얻은 electropherogram은 매우 많은 peak로 이루어져 있음에도 불구하고 각 염료를 별도로 환원한 용액에 대한 electropherogram(data는 나타내지 않음) 들을 모두 합한 것과 매우 유사하여, Acid Orange 7가 분해된 sulfanilic acid(peak 6), Reactive Orange 4가 분해된 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid(peak 8) 그리고 Acid Blue 92에서 유래된 H-acid(peak 11) 등을 확인할 수 있었다. 그 외의 peak는 불순물이나 미확인 물질에서 유래한 것으로 peak 5는 잔류한 Acid Orange 7, peak 7과 9는 Reactive Orange 4의 환원용액에서 그리고 peak 10은 Acid Blue 92의 환원용액에서 기인하는 것으로 확인할 수 있었다.
- 실험 결과 Direct Blue 2, Direct Blue 6, Direct Blue 15등의 직접염료 그리고 Reactive Orange 4와 같은 반응성 염료에 대한 완전한 분리를 얻었으며, 특히 각 염료의 환원용액을 H-acid, J-acid, γ-acid, orthanilic acid, sulfanilic acid, 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid 등의 표준물질과 비교 분석한 결과 사용한 각 염료의 디아조 혹은 커플링 성분을 완벽하게 분석할 수 있음을 알 수 있었다. 이런 결과를 바탕으로 Ion-Pair 크로마토그래피법과 모세관 전기영동법은 미지의 염료에 대한 성분확인 및 디아조 혹은 커플링 성분분석에 응용할 수 있음을 보였다.
후속연구
- 한편, 염료용액을 환원한 후 얻은 크로마토그램(B의 c)는 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid 표준용액의 크로마토그램(B의 a)와 잘 일치하는 것으로 보아 Reactive Orange 4의 분해물질에 대한 분석이 가능함을 알 수 있었다. 이러한 분석결과는 분해능이 좋은 MECC법에서 더욱 두드러졌는데, Reactive Orange 4의 electropherogram(A의 b)에 의하면 실험에 사용된 염료는 주성분(peak 4) 외에 peak 5등 적어도 2가지 이상의 불순물을 포함하는 것으로 판단되며 그의 환원 용액의 경우(A의 a) 2-naphthylamine-1,5-disulfonic acid(peak 2) peak 1, 3 등의 다른 성분을 포함하고 있으며 특히 peak 1의 경우 환원 반응 후 시간이 경과함에 따라 띠 너비가 넓어지는 등의 변화를 보이는 것으로 보아 염료의 다른 이온 성분으로 수용액 속에서 hydrolysis가 진행되는 것으로 판단되나 이에 대하여는 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.
- 고부가가치의 다양한 염료의 개발과 더불어 이와 같은 고감도와 높은 선택성을 지니는 염료 분석법의 개발은 몇 가지 이상의 복합물질로 배합된 염료의 성분확인에도 이용될 수 있으므로 염료성분의 직접개발은 물론 성분이 확인되지 않은 수입염료에 수입대체품 개발에 대한 기초기술로 활용가능하여 매우 중요한 기초 기술로서 다양한 활용성을 기대할 수 있을 것이다.
- 이러한 염료 혹은 염색에 의한 환경오염과 폐수문제를 해결하기 위해서는 공장폐수 등에 존재하는 잔류 염료성분에 대한 좋은 선택성과 감도를 갖는 정성 및 정량분석이 대단히 중요하다. 이러한 분석기술의 확립은 나아가 몇 가지 이상의 복합물질로 배합된 염료의 성분확인에도 이용될 수 있으므로 염료성분의 직접개발은 물론 성분이 확인되지 않은 수입염료에 수입대체품 개발에 대한 기초 기술로 활용 가능하여 다양한 활용성을 기대할 수 있을 것이다.
- 한편 Ion-Pair 액체 크로마토그래피법은 모세관 전기영동법에 비하여 상대적으로 넓은 띠 너비를 보이는 등 여러 가지 제약에도 불구하고 정립된 이론을 바탕으로 많이 보급된 액체 크로마토그래피를 이용하므로 실험자가 쉽게 접근할 수 있다는 점에서 더 많은 염료분석에의 응용이 기대되며, 모세관 전기영동법은 매우 높은 이론단수와 고분해능으로 인하여 복잡한 염료혼합물 분석에의 응용성이 기대된다.
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