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문제 정의
- 이에 본 연구에서는지치과식물중의 하나인 지치에 대한 약리성만이 아닌 식품 소재로서 활용되기 위한 정확한 품질 구분을 위해 화합물의 확인작업이 필요하다. 따라서 지치 뿌리의 shikonin 화합물에 대한 기능성은 일부 밝혀졌으나 (8, 15-20) 기능성 식품 원료로서 사용되게 하려면 지치의 종 에 따른 정 확한 성 분물질 동정 이 우선적으로 고려 되 어 야 할 사항이므로(15), 지치로부터 추출한 용매 분획물을 안정화 된 화합물로 유도하지 않고 원성 분을 변 형 하지 않고 그대로 사용하여 재배방법 에 대한 화합물의 구성 차이를 알아보고 자 하였다.
가설 설정
- 1)Values are mean±SD (n=3). *p<0.
제안 방법
- 01 M formic acid를 녹여 HPLC로 분석하였다(16). HPLC 분석은 UV/VIS 검출 기 U20000] 장착된 Thermo Finnigan AQA P4000(Thermo Finnigan Co., Japan) 을 사용하였으며, 용매 A (acetonitrille with 0.01 M formic acid)와 용매 B(distilled water)의 gra dient condition-c- concave 5번 (0~10분 50:50, 10 〜 20분 60: 40, 20〜40분 75:25, 40〜60분 95:5%(v/v))으로 실시 하였다. 이와 같은 조건으로 야생 및 재배 지치의 n-hexane 용매 분획물이 구성하고 있는 색소 물질을 분리하였으며, 물질 확인은 표품의 retention time(RT)과 비교하였다.
- 21 g)을 얻었다. 건조한 재 배 지치(100 g)에 대하여서도 야생 지치의 경우와 같은 방법 으로 methanol 추출물(36.23 g)과 n-hexane 분획 물(2.47 g) 을 조제하였다(16).
- 야생 및 재배 지치의 n-hexane 용매 분획물이 구성하고 있는 shikonin 화합물의 분리는 지치의 주 색소물질로 알려 진 shikonin과 그 유도체 화합물의 표품(4종)으로부터 알아 내었다. 본 연구의 야생 및 재배 지치의 n-hexane 분획물은 어 떠 한 전처 리 공정 을 거 치 지 않고 acetonitrile 용매 (HPLC grade, Aldrich Chemical Co., USA)에 0.01 M formic acid를 녹여 HPLC로 분석하였다(16). HPLC 분석은 UV/VIS 검출 기 U20000] 장착된 Thermo Finnigan AQA P4000(Thermo Finnigan Co.
- 야생 및 재배 지치에서 용매 분획물의 shikonin 화합물 정량은 HPLC-MS을 통하여 표품과 비교 확인하는 방법으 로 실 시 하였다. 색 소 물질 인 shikonin 과 deoxyshikonin 등의 표품에 대하여 농도와 peak 면적 과의 상관관계를 알아보고 검 량선을 각기 구하여 야생 및 재배 지치의 용매 분획물에서 각각 확인된 물질 함량 측정은 해당 물질의 검량선에 대입하 여 일정한 농도를 구한 다음 용매 분획물 분석 시 소요된 총량으로 나누어 계산하였다(18).
- 야생 및 재배 지치에서 용매 분획물의 shikonin 화합물 정량은 HPLC-MS을 통하여 표품과 비교 확인하는 방법으 로 실 시 하였다. 색 소 물질 인 shikonin 과 deoxyshikonin 등의 표품에 대하여 농도와 peak 면적 과의 상관관계를 알아보고 검 량선을 각기 구하여 야생 및 재배 지치의 용매 분획물에서 각각 확인된 물질 함량 측정은 해당 물질의 검량선에 대입하 여 일정한 농도를 구한 다음 용매 분획물 분석 시 소요된 총량으로 나누어 계산하였다(18).
- 야생 및 재배 지치의 n-hexane 분획물의 구성 물질로 밝 혀진 shikonin과 deoxyshikonin 화합물의 정확한 품질 지표 설정을 위해 함량을 측정하였다. 이때 shikonin 과 deoxy - shikonin의 표품 각각에 대하여 농도와 peak 면적으로 검 량 선을 구하였다.
- 야생 및 재배 지치의 n-hexane 분획물의 구성 물질을 HPLC 상에서 표준품의 shikonin과 deoxyshikonin의 RT 비교만 가지고 정확한 물질동정을 했다고 할 수 없으므로 분취 HPLC를 이용해 shikonin으로 추정되는 compound I 과 deoxyshikonin으로 추정 되는 compound II의 물질을 받 아'H, 13C-NMR 스펙트럼을 이용해서 구조 확인을 실시하 였다.
- 야생 및 재배 지치의 n-hexane 용매 분획물이 구성하고 있는 shikonin 화합물의 분리는 지치의 주 색소물질로 알려 진 shikonin과 그 유도체 화합물의 표품(4종)으로부터 알아 내었다. 본 연구의 야생 및 재배 지치의 n-hexane 분획물은 어 떠 한 전처 리 공정 을 거 치 지 않고 acetonitrile 용매 (HPLC grade, Aldrich Chemical Co.
- 야생 및 재배 지치의 shikonin 화합물 구조 확인은 단순하 게 표품과 비교하지 않고 HPLC-MS에서 분리된 peak로부 터 분취 HPLC(Acme, Younglin Ins. Co., Ltd., Korea)를 이 용하여 원하는 peak 물질을 얻은 후 NMR(nuclear magnetic resonance spectrophotometer)로부터 물질구조를 확인하였 다. 'H, 13C-NMR spectrum 은 Vari an Unity Inova 300 MHz (Varian Inc.
- 야생 및 재배 지치의 정확한 품질 조사를 위해 지치의 methanol 추출물로부터 n-hexane 용매 분획 물을 조제, 이 들 각각의 용매 분획물이 구성하고 있는 물질을 HPLC로 분석하기 위해 shikonin 및 그 유도체 화합물인 표품의 RT(retention time)는 shikonin0] 15.97분, deoxyshikonin은30.37분, PJ3-dimethylacrylshikonin은 35.18분, 2-methyl- butyrylshikonin은 36.77분인 것으로 확인하였다.
- 야생 및 재배지치의 methanol 추출물로 조제한 n-hexane 용매 분획 물에 대하여 shikonin 및 그 유도체 화합물을 표품 으로 해서 HPLC/MS로 물질을 분리하였다. 분리된 물질의 구조 확인을 위해 'H-NMR, ^C-NMR을 통해 분석한 결과, compound I 은 화학식 이 이 며 분자량이 288.
- 야생 및 재배 지치의 n-hexane 분획물의 구성 물질로 밝 혀진 shikonin과 deoxyshikonin 화합물의 정확한 품질 지표 설정을 위해 함량을 측정하였다. 이때 shikonin 과 deoxy - shikonin의 표품 각각에 대하여 농도와 peak 면적으로 검 량 선을 구하였다. 이를 기준으로 하여 야생 및 재배 지치 n- hexane 분획물의 shikonin과 deoxyshikonin 함량을 Table 3과 같이 계산하였다.
- 01 M formic acid)와 용매 B(distilled water)의 gra dient condition-c- concave 5번 (0~10분 50:50, 10 〜 20분 60: 40, 20〜40분 75:25, 40〜60분 95:5%(v/v))으로 실시 하였다. 이와 같은 조건으로 야생 및 재배 지치의 n-hexane 용매 분획물이 구성하고 있는 색소 물질을 분리하였으며, 물질 확인은 표품의 retention time(RT)과 비교하였다.
대상 데이터
- 또한 shikonin 및 유도체 화합물의 물질동정을 위해서 shikonin, deoxyshikonin, P, P-dimethylacrylshikonin, 2- methykn-butyrylshikonin 등의 표품(Tokyo Ksei Kogyo Co., Ltd., Japan) 4종을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 지치뿌리는 2003년 경북 영천지역에서 재 배한 것과 산출지 역 의 오차를 줄이 기 위 해 같은 지 역 에서 생산되는 것을 한약상회로부터 구입하였다. 이를 물에 3회 씻은 다음, -70°C에서 1 일간 급속 냉동시키고 진공동결건조 7] (Bondiro, Ilshin Lab Co.
- 추출용 용매는 시약용 1급(Duksan Pure Chemical Co., Ltd., Korea)으로 methanol과 n-hexane을 사용하였고, col umn chromatography용으로 acetonitrile(Aldrich Chemical Co., USA) 등을 사용하였다.
성능/효과
- 결론적으로 지치에 있어서 shikonin과 deoxy아likonin 물 질의 총함량은 야생지치가 3.12%, 재배지치가 2.64%로서 야 생지치가 재배지치보다 약 0.48%로 많았다(p<0.05). 다만 shikonin과 deoxyshikonin 이외의 다른 acethylshikonin, teracrylshikonin, isovalerylshikonin, isobutyrylshikonin, propionylshikonin, a -methyl-n-butyrylshikonin,methylacrylshikonin, P-hydroxyisovalerylshikonin 등의 유 도체 화합물이 더 존재할 수도 있으므로 야생 및 재배지 치 에 대해 shikonin 유도체 화합물의 총량을 비교하는 것은 무리 라고 추정되었다.
- 야생 및 재배지치의 methanol 추출물로 조제한 n-hexane 용매 분획 물에 대하여 shikonin 및 그 유도체 화합물을 표품 으로 해서 HPLC/MS로 물질을 분리하였다. 분리된 물질의 구조 확인을 위해 'H-NMR, ^C-NMR을 통해 분석한 결과, compound I 은 화학식 이 이 며 분자량이 288.3인 shikonin이었고, compound II는 화학식이 (以詛忒力이며 분 자량이 272.3인 deoxyshikonin것으로 밝혀내 었다. 야생지 치 에 함유된 shikonin과 deoxyshikonin은 2.
- 이를 기준으로 하여 야생 및 재배 지치 n- hexane 분획물의 shikonin과 deoxyshikonin 함량을 Table 3과 같이 계산하였다. 야생 및 재배지치 에서의 n-hexane 분 획물의 중량 당 shikonin의 함량은 야생지치가 2.23%, 재배 지치가 2.24%이었고, n-hexane 분획물의 중량 당 deoxy - shikonin의 함량은 야생지치가 0.87%, 재배지치가 0.41%로 측정되었다.
- 어떠한 전처리 공정을 거치지 않고 acetonitrile 용매에 0.01 M formic acid를 녹여 HPLC로 분석한 야생 지치의 n-hexane 분획물은 Fig. 1과 같이, 재배 지치의 n-hexane 분획물은 Fig. 2와 같이, 총 9개의 peak가 확인되었다. 이를표품 4종의 RT5]- 비교했을 때, 2개의 peak로부터 shikonin 물질로 추정 되 는 compound I 과 deoxyshikonin 물질로 추 정되는 compound II를 찾아낼 수 있었다.
- 41%이었다. 지치의 동정된 색소물질 총량은 야생지치 3.12%, 재배지치 2.64%로 야생지 치가 재배지치보다 유의적으로 많았다(p<0.05).
- 이를표품 4종의 RT5]- 비교했을 때, 2개의 peak로부터 shikonin 물질로 추정 되 는 compound I 과 deoxyshikonin 물질로 추 정되는 compound II를 찾아낼 수 있었다. 확인된 2개의 peak를 제외한 7개의 peak는 P, p-dimethylacrylshikonin, 2-methyl-n-butyrylshikonin의 peak라고 보기 어 려우며, 또 다른 shikonin 유도체 화합물이거나 다른 물질일 것으로 추정 되었다. 이처럼 shikonin 유도체 화합물의 큰 분자구조가 열, 산, 알칼리에 의해 가수분해되어 쉽 게 적은 분자로 나누어지므 로 기존보고에서는 인위적 인 유도체 화합물로 만들어 물질을 확인한 것으로 보인다(5-7, 19)
후속연구
- 이에 본 연구에서는지치과식물중의 하나인 지치에 대한 약리성만이 아닌 식품 소재로서 활용되기 위한 정확한 품질 구분을 위해 화합물의 확인작업이 필요하다. 따라서 지치 뿌리의 shikonin 화합물에 대한 기능성은 일부 밝혀졌으나 (8, 15-20) 기능성 식품 원료로서 사용되게 하려면 지치의 종 에 따른 정 확한 성 분물질 동정 이 우선적으로 고려 되 어 야 할 사항이므로(15), 지치로부터 추출한 용매 분획물을 안정화 된 화합물로 유도하지 않고 원성 분을 변 형 하지 않고 그대로 사용하여 재배방법 에 대한 화합물의 구성 차이를 알아보고 자 하였다.
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