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문제 정의
- 칡의 꽃을 갈 화라고 부르며, 칡 줄기의 속 껍질은 청 올치라고 부르며 옷감을 짜고, 노를 꼬는데 사용한다 夕 칡은 오래 전부터 구황작물로 이용되고 있고, 음주와 관련된 숙취 증상을 완화하기 위해 사용되며, 고혈압, 협심증, 당뇨병 등에 약효를 갖고 있으며, 주요 성분으로는 isoflavone 유도체와 starch 10— 14%, daidzin, diadzein(daidzin-7-glucoside), puerarin, puerarin- 7-xyloside, genistein, formononetin, coumestan 유도체, 방향족 배당체 및 oleanane계 sapogenin 등으로 구성되어 있다.源) 본 연구는 칡의 뿌리를 유기용매(作-hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol)와 물을 사용하여 연속추출한 후, 얻은 갈근 추출물이 피부염증 균에 대한 항균효과와 항산화 활성 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- ), CO2 incubator(NUAIRE), ELISA reader (Molecular devices, spectra MAX 340, USA), Microscope (Olympus, CK2, USA). NMR은 FT/NMR spectrometer; model JEOL-ECP 500을 사용하였으며, Dimethyl sulfoxide-dg를 용매로 사용하였으며, 내부표준물질로 tetramethyl- silane(TMS)를 기준으로 BQOO ppm)으로 측정하였다. Column chromatography의 흡착제는 silica gel 60(kiesel gel, 230—400 mesh), silica gel plate(0.
- 액체배지 희석법 相)을 이용 하였으며, 96-microwell plate(Nunclon, Denmark)에 각 추출물의 농도를 최고 3, 200 卩咖에서 최저농도 100까지 2배씩 연속적로 희석하였다. 각 균주는 단일 콜로니를 액체배지에 접종하고, 37°C 배양기에서 18시간 동안 배양한 균주(揷 cells/m/)를 접종하여 37°C 배양기에서 24시간 배양한 후, ELISA (Spectra Max 250, Molecula Deveces, USA)에 의한 흡수 파장 630nm에서 흡광도를 측정하여 배지의 탁도를 확인하였고, 순수 배양액의 흡광도 값과 같은 결과를 얻은 것을 MUC로 결정하였으며, MIC의 수치가 낮은 것을 항균효과가 높은 것으£ 판정 하였다.
- 본 연구에서는 갈근을 유기용매와 물로 연속 추출하여 얻은 갈근 추출물과 생리활성물질을 피부염증균에 대한 항균, 항진균 효과와 항산화 활성을 검색호)여 다음과 같은 실험 결과를 얻었다. 결론적으로 갈근의 크로르포름 추출물, 에틸아세테이트 추출물과 메탄올 추출물에 대한 항진균효과(MIC50, 800 卜ig/mZ)는 효모형 진균인 C.
- 항균효과를 파악하기 위하여 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 액체배지 희석법 相)을 이용 하였으며, 96-microwell plate(Nunclon, Denmark)에 각 추출물의 농도를 최고 3, 200 卩咖에서 최저농도 100까지 2배씩 연속적로 희석하였다. 각 균주는 단일 콜로니를 액체배지에 접종하고, 37°C 배양기에서 18시간 동안 배양한 균주(揷 cells/m/)를 접종하여 37°C 배양기에서 24시간 배양한 후, ELISA (Spectra Max 250, Molecula Deveces, USA)에 의한 흡수 파장 630nm에서 흡광도를 측정하여 배지의 탁도를 확인하였고, 순수 배양액의 흡광도 값과 같은 결과를 얻은 것을 MUC로 결정하였으며, MIC의 수치가 낮은 것을 항균효과가 높은 것으£ 판정 하였다.
- 4 gm 여과지로 여과하여 3RC에서 감압 농축하여 헥산 추출물을 얻었다. 위와 같은 방법으로 클로르포름, 에틸아세테이트, 메탄올로 추출하여, 클로르포름 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 메탄올 추출물을 얻었다. 위 추출물의 잔사를 80°C~85°C에서 4시간 동안 진탕하면서 3회 환류 추출하여 물 추출물을 얻었다.
- 칡뿌리의 추출물로부터 유용 활성 물질을 탐색하기 위해 항산 화 활성을 검정하였으며, 자유 라디칼인 l, l-diphenyl-2-picryl hydmzyl(DPPH)을 사용한 항산화 활성 측정 방법을 이용하였다. 실험관에 메탄올을 넣고 시료 화합물을 농도별로 첨가한 다음 상기 DPPH(0.
- 코팅된 에 틸아세테이트 추출물을 다시 실리카겔(250 g)이 충진된 컬럼크로 마토그라피(47 mmx 800 mm)에 넣어 클로르포름/메탄올 이동상으로 용리시켜 분획 1(250 mg), 분획 2(1, 250 mg), 분획 3(5, 100 mg), 분획 4(2, 780 mg), 분획 5(1, 600 mg), 분획 6(3, 150 mg), 분 획 7(2, 160 mg)을 얻었다. 클로르포름/메탄올 이동상(13~20%)으로 용리시켜 얻은 분획(4)에서 결정을 아세톤으로 재결정 시켜 yellow amorphous power puerarin(30 mg, 1.1%)을 얻었으며, 클로르포름/메탄올 이동상(20〜25%)Q로 용리시켜 얻은 분획⑵ 에서 얻은 결정을 메탄올/클로르포름(4:1)에서 재결정 시켜 백 상 침상결정 daidzin(l, 100 mg, 8%)을 얻었다. Daidzin(l) : Rf= 0.
- 항균효과를 파악하기 위하여 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 액체배지 희석법 相)을 이용 하였으며, 96-microwell plate(Nunclon, Denmark)에 각 추출물의 농도를 최고 3, 200 卩咖에서 최저농도 100까지 2배씩 연속적로 희석하였다.
대상 데이터
- 小Hexane, chloroform, ethyl acetate, methanoRDAEJUNG)은 재증류하여 사용하였으며, 물은 3차 증류수를 사용하였다. Daidzein과 quercetin 은 Aid ich에서서 구입하 여 사용하였다.
- mutans, JC-2), Staphylococcus epidermidisiS. epidermidis, ATCC 12228), Staphylococcus aureus(S. aureus, ATCC 29213)와 Candida albicans(C. albicans, KCTC 1940)를 사용하였다. 세균배양에 사용된 배지는 S.
- Merck), sand (Aldrich)를 사용하였다. 小Hexane, chloroform, ethyl acetate, methanoRDAEJUNG)은 재증류하여 사용하였으며, 물은 3차 증류수를 사용하였다. Daidzein과 quercetin 은 Aid ich에서서 구입하 여 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 칡뿌리(갈근, 5, 000 g)를 세절하여 blender^ 분쇄하여 사용하였다. 갈근을 小hexane(3x 15, 000 m/)으로 상온에서 24시간 동안 진탕하면서 3회 추출한 후, 헥산추출액을 0.
- albicans, KCTC 1940)를 사용하였다. 세균배양에 사용된 배지는 S. mutans, S. epiderwtidis와 S. gws는 Brain heart infusion(BHI, Difco)를 사용하였고, C. albicans^: Sabouraud(증류수 1Z에 Bacto-peptone 10 g, Bacto-dextrose 40 g)# 사용하였다.
- 분쇄하여 사용하였다. 실험에 사용된 식물체는 원광대학교 한의학전문대학원 한약자워개 발학과에 보관되어 있다.
성능/효과
- 칡의 뿌리를 유기용매를 사용하여 극성이 낮은 용매로부터 극성이 높은 용매로 상온에서 연속추출하여 얻은 추출물과 그 잔 사는 물을 80~850°C에서 4시간 동안 추출하여 얻은 결과, 용매의 극성에 따라 추출물의 수득율은 증가함을 볼 수 있었다C“ble I). 연속추출물에 대한 항균효과를 측정한 결과, 극성이 낮은 헥산과 클로르포름용매로 추출한 추출물에 대하여 S. mutans, S. 어)idemiidis와 S. 勿"必에 대한 최소억제농도는 3, 200 回m2 이 상으로 항균 활성이 나타나지 않았다. 그러나 C.
- 4)Fig. 2는 13C-NMR spectrum에서 보는 바와 같이 isoflavonoid 골격의 A ring의 13C-NMR spectrum은 153.9 ppm C-2, 124.3 ppm C-3, 175.3 ppm C-4, 162.0 ppm C-7의 탄소를 확인하였으며, 104.0 ppm에서 glucose에 기인하는 anomeric carbon signal을 확인할 수 있었으며, 61.2ppm에서 glucose의 C-6'에 의한 CHRH기임을 알 수 있다. C-4의 ketone의 탄소가 175.
- S. mutans, S. epidetmidis와 S. aureus 대한 최소억제농도는 3, 200 ug/rn/으로 항균활성이 나타났다. 진균인 C.
- 4 ppm C-5"은 이등의 연구에서의 결과와 같이 glucose임을 확인할 수 있었다.分 이상의 결과를 종합해 본 결과 화합물 2는 puerarin(2)으로 판단된다.
- a闻cams에 대한 항진균효과을 함유한 생리활성물질이 포함되어 있으리라 생각된다(Ebles I and ID). 갈근 연속추출물에 대한 항산화 효과를 DPPH법을 이용하여 측정한 결과 에틸아세테이트 추출물에서 가장 활성(IC50, 119.87 ±0.16 翊m/)이 높게 관찰되었으며, 용매의 극성이 증가하는 순서인 메탄올 추출물(IC50, 146.36±0.30|ig/m/), 물 추출물(IC®, 17L18±0.20 回m/)로 항산화 활성이 감소하는 경향이 관찰되었으나, 극성이 약한抢 클로르포름 추출물(电。, 220.45+1.20 询m/) 으로 감소하였으며, 헥산 추출물(Ry, 3, 900.32 土 6.10 I也曲에 서는 황산화활성이 거의 관찰되지 않았다. 갈근추출물에 대한 항산화 활성은 에틸아세테이트 추출물 QC”, 119.
- 갈근에서 분리된 isoflavonoid 인 分 daidzin 과 puerarin에 대하여 S. mutans, S. e忧dwmidis와 S. 做物奶에 대한 최소억제농도는 3, 200 卩g/mZ으로 미약한 항균 활성이 나타났으나, 효 모성 진균인 C. albicans'* 대한 최소억제농도는 800 卩以1血과 3, 200 gg/m/S. 관찰되었다.
- 본 연구에서는 갈근을 유기용매와 물로 연속 추출하여 얻은 갈근 추출물과 생리활성물질을 피부염증균에 대한 항균, 항진균 효과와 항산화 활성을 검색호)여 다음과 같은 실험 결과를 얻었다. 결론적으로 갈근의 크로르포름 추출물, 에틸아세테이트 추출물과 메탄올 추출물에 대한 항진균효과(MIC50, 800 卜ig/mZ)는 효모형 진균인 C. aZ滅a酒에 대한 활성이 S. mutans, S. epidetmidis와 S. 보다 높게 관찰되었으며, 물 추출물의 S. 枷泌沏泌s와 S. 物, 物5에 대한 항균효과는 최소억제농도(MIC5Q, 1, 600 g^m/) 로 관찰되었다.갈근연속추출물에서 에틸아세테이트 추출물의 항산화활성 ad, 119.
- 갈근추출물로부터 분리된 puerarin과 daidzin에 대한 항산화 활성은 DPPH법으로 측정한 결과와 daidzein의 항산화능도 Choo et a”。이 보고한 것처럼 유사한 활성를 관찰할 수 있었다. 그렇지만 quercetin과 eugen이의 활성은 유사한 측정값을 얻었으며, benzyl alcohol, ethyl acetate의 활성은 미약한 것으로 관찰되었으나, 방향족 산인 benzoic acid는 S. epidermidis 에 대한 최소억제농도는 1, 600 昭伺으로 약힌悟 항균활성이 나타났으며, S. aureus와 효 모성 진균인 C. albicans0^ 대한 최소억제농도는 800 p.g/m/ 로 관찰되었다(Eble n).n)
- aureus 대한 최소억제농도는 3, 200 ug/rn/으로 항균활성이 나타났다. 진균인 C. albicans는 헥산 추출물과 물 추출물을 제외하고는 모든 추출물에서 최소억제 농도가 높은 800 卩必m/으로 항진균활성이 관찰되었으며 , 물 추 줄 물의 S. epidermidisS^ S. aureus^ 대한 최소억제농도는 1, 600 卩以的으로 다른 추출물의 항균 활성보다 높게 나타났다. 칡뿌리를 연속 추출한 클로르포름 추출물, 에틸아세테이트 추출물과 메탄 올 추출물은 효-모형 진균인 C.
- 칡의 뿌리를 유기용매를 사용하여 극성이 낮은 용매로부터 극성이 높은 용매로 상온에서 연속추출하여 얻은 추출물과 그 잔 사는 물을 80~850°C에서 4시간 동안 추출하여 얻은 결과, 용매의 극성에 따라 추출물의 수득율은 증가함을 볼 수 있었다C“ble I). 연속추출물에 대한 항균효과를 측정한 결과, 극성이 낮은 헥산과 클로르포름용매로 추출한 추출물에 대하여 S.
후속연구
- 16 噸m/)은 가장 좋은 활성을 얻었으며, 이와 같은 연구결과는 isoflavonoid 골격 구조와 연관할 때, 갈 근추출물에서 관찰된 항균 및 항진균 효과는 puerarin, daidzin, daidzein, quercetin보다는 다른 생리 활성물질이 함유되어 나타나는 것으로 생각된다. 향후 칡 추출물에 대한 항균 및 항진균 물질을 분리 및 분석을 통하여, 이들 생리활성물질에 대한 피부염증균의 억제효과를 연구하고자 한다.
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