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문제 정의
- 또한 염증이 있는 부위에서만 작용하는 효소인 COX-2의 활성을 억제하는 보고도 있다(25). 따라서 본 연구에서는 갈 근(Puerariae Radix)을 높은 함량의 유효물질을 얻기 위해 70% 에탄올로 추출한 후 용매 분획물 중 에틸아세테이트 분획물(EPR)에 대한 마우스 대식세포, 토끼 연골조직 세포 및 동물에서 골관절염 항염증 작용, 염 증유발관련 효소 억제 작용, 관절조직 분해효소 억제작용 및 소염 진통작용 등의 치료작용을 확인하여 골관절염 치료 후보제로서의 가능성을 확인하였다.
- 또한, 이런 갈근의 isoflavonoid는 에탄올이나 메탄올에 대한 용해성이 높고 열수 추출보다는 에탄올 추출물에서 높은 함량이 추출됨이 보고되었다(31). 따라서 본 연구에서는 갈근을 70% 에탄올에서 추출한 후 단계별 용매 분획물을 얻은 후 그 중 생리 활성이 우수한 ethyl acetate 분획 층을 사용하여 마우스 대식세포, 토끼 연골조직 세포 및 동물에서 염증, 재생 및 통증 실험을 통해 골관절염 치료 후보물질로서의 가능성을 알아보고자 하였다.
- 그러나 질환 상태의 연골조직에서는 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP- 13의 발현 및 활성이 증가하며 이러한 현상은 염증성 cytokine에 의해 유발된다. 본 실험에서는 갈근 EA 분획물의 관절조직 분해효소 활성 억제 효과를 확인하기 위하여 MMP-9 의 활성실험을 하였다. Fig.
제안 방법
- -염증성 cytokine들에 의해 활성화된 마우스 대식세포 (RAW 264.7)와 토끼 연골조직 세포 배양액에서 NO 생성 저해 활성을 측정함으로써, 갈근(Puerariae Radix')의 ethyl acetate(EA) 분획물의 항염증 효과를 확인하였다. 갈근의 EA 분획물은 0.
- ), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신 (100 ]Jg/mL)을 포함한 DMEM 배지를 포함한 24 well plate에 2xio6 cells/well이 되도록 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 습윤조건 하에서 배양하였다. RAW 264.7 세포에서 산화질소를 유도하기 위하여 대장균의 세포벽 구성성분인 lipopolysaccharide(LPS)를 100 ng/ mL의 농도로 투여하고 대조군에는 용매인 DMSO만을 처리하고 실험군에서는 갈 근 EA 분획 물(0.8, 4.0 및 20.0 Hg/mL) 처리 후, 16시간 동안 배양하였다.
- 본 연구에 사용한 갈근은 국내산으로써 경기도에 소재한 대영제약에서 구입하였다. 갈근 200 g을 환저플라스크(round bottom flask) 에 5배 (w/v)의 70% 에탄올을 가하여 60℃에서 2시간 2회 추출, 감압농축 하여 얻은 70% 에탄올 추출물을 hexane, ethyl acetate(EA), butanol(BuOH) 및 증류수 (H2O) 순으로 분획하여 각 분획물을 동결건조한 결과 다음과 같은 분말을 얻었다(Fig. 1). 각각의 분획물에 대해 iNOS assay 및 PGE2 assay를 실시하여 그 중 생리 활성이 우수한 EA 분획물을 실험에 이용하였다.
- 갈근 EA 분획물에 대한 NO 생성 억제 효과를 마우스 대식세포와 토끼 연골조직 세포를 이용하여 확인하였다. 염증을 일으키는 cytokine들에 의해 생성된 nitric oxide(NO)의 양은 세포배양액 중에 존재하는 nitritelNCfe-)의 형태로서 Griess 시약[0.
- 7)와 토끼 연골조직 세포 배양액에서 NO 생성 저해 활성을 측정함으로써, 갈근(Puerariae Radix')의 ethyl acetate(EA) 분획물의 항염증 효과를 확인하였다. 갈근의 EA 분획물은 0.8, 4.0, 20.0 Ug/mL로 처리하였고 음성 대조군 (LPS 또는 CM)에 비해 마우스 대식세포에서는 0.8 및 4.0 Ug/mL 처리군에서는 차이를 보이지 않았으나, 20.0 Hg/rnL 처리군에서는 42.3%로 유의성 있는(p<0.001) NO 생성 저해 효과를 나타냈다(Fig. 2). 또한, 토끼 연골조직 세포에서는 각각 5.
- , USA) 을 첨가하였으며, 1 x 1。6개의 세포를 60 mm dish에 접종하고, 5~6일 동안 37℃, 5% CO2 습윤조건 하에서 배양하였다. 관절 세포(passage 0)가 80% 정도 자랐을 때, 배지는 serum free DMEM으로 바꾸고, 대조군을 제외한 모든 dish에 cytokine mixture(CM IL-10 1 ng/mL, TNF- a 10 ng/mL, IFN- a 1 ng/mL, LPS 1 ]ig/mL)을 투여한 후 20분간 배양하였다. 대조군(control)과 음성대조군(CM)에는 용매인 DMSO(0.
- 관절 세포(passage 0)가 80% 정도 자랐을 때, 배지는 serum free DMEM으로 바꾸고, 대조군을 제외한 모든 dish에 cytokine mixture(CM IL-10 1 ng/mL, TNF- a 10 ng/mL, IFN- a 1 ng/mL, LPS 1 ]ig/mL)을 투여한 후 20분간 배양하였다. 대조군(control)과 음성대조군(CM)에는 용매인 DMSO(0.05%)만 처리 하고 실 험군에는 갈근 EA 분획물(0.8, 4.0 및 20.0 Ug/mL) 처리 후, 16시간 동안 배양하였다.
- 02% NaN"에 담근 후, 37℃에서 48시간 동안 반응시 켰다. 반응이 끝난 gee 0.25% Com- massie Brilliant Blue R250(Sigma-aldrich, USA)으로 1시간 동안 염색한 후 탈색(25% ethanol, 8% acetic acid)하였다.
- 세포수집 후, 원심분리를 하여 세포 조각(cell debris)은 제거하고 상등액만 취하였다. 상등액 샘플과 염료를 섞은 후, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 10% Zymogram gel을 이용하여 100 V의 전압을 가하여 3시간 동안 SDS-PAGE를 실시하였다. Gel에서 SDS를 제거하기 위해 0.
- 갈근 EA 분획물에 대한 NO 생성 억제 효과를 마우스 대식세포와 토끼 연골조직 세포를 이용하여 확인하였다. 염증을 일으키는 cytokine들에 의해 생성된 nitric oxide(NO)의 양은 세포배양액 중에 존재하는 nitritelNCfe-)의 형태로서 Griess 시약[0.1% (1 -naphtyDethylenediamine 2HCI, 1% sulfanilamide in 5% cone. H3PO4 in 压0]을 이용하여 측정하였다. 즉, 각각의 세포배양 상등액 100 虬와 Griess 시약 100 pL를 혼합하여 96-multiwell plates에서 10분 동안 반응시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 항원-항체 복합체에 TMB(3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine) 용액 150 UL를 가하고 실온에서 30분간 발색시키고, 1 M H2SO4 100 pL를 가하여 반응을 중단시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 방법은 시료의 PGE2와 첨가된 PGE2-peroxidase con- jugate와의 경쟁 반응으로 흡광도 변화와 농도와의 관계를 나타내는 표준 검량선을 이용하여 각 세포배양액에 함유된 PGE2의 함량을 계산하였다.
- 체중 20-22 g의 ICR계 mouse 수컷 8마리를 1군으로 하여 시료 200 ㎎/㎏과 400 ㎎/㎏을 각각 경구투여하고, 1시간 후에 0.6% 초산생리식 염 액 0.1 mL/10 g 단위로 복강 내 주사하고, 주사 후 10분 후부터 10분간 각각의 쥐가 나타내는 통증 반응인 롸이 딩 (writhing: 등을 쭉 펴거나 뒷다리를 몸 뒤로 완전히 뻗어 제치는 현상)을 보이는 횟수를 관찰하였다.
- 토끼 연골 조직의 구성 성분인 프로테오글리칸의 분해를 유발시켜 배양액 내의 프로테오글리칸의 분해 산물인 glu- cosaminoglycan(GAG)을 1, 9-디 메틸메틸블루 발색제 (1, 9- dimethylmethylene blue dye, DMB)에 의해 발색 된 정도를 525 nm에서 흡광도를 측정한 후, chondroitin sulfate로 표준 정량하였다.
- 통증 유발물질인 프로스타글란딘을 합성하는 효소인 cyclooxygenase 2(COX-2)의 갈근 EA 분획물에 의한 활성 억제를 확인하기 위해 C0X-2를 나타내는 지표인 PGE2의 농도 변화를 마우스 대식세포 및 토끼 연골조직 세포에서 확인하였다. 마우스 대식세포에서는 염증성 cytokine을 처리하지 않은 대조군(control, 17.
대상 데이터
- 1). 각각의 분획물에 대해 iNOS assay 및 PGE2 assay를 실시하여 그 중 생리 활성이 우수한 EA 분획물을 실험에 이용하였다.
- 마우스 대식 세포주(RAW 264.7) : 마우스 유래의 대식 세포주인 RAW 264.7을 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였으며, 10% 우 태아 혈청 (fetal bovine serum, 26140- 079, Gibco Co.), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신 (100 ]Jg/mL)을 포함한 DMEM 배지를 포함한 24 well plate에 2xio6 cells/well이 되도록 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 습윤조건 하에서 배양하였다. RAW 264.
- 본 연구에 사용한 갈근은 국내산으로써 경기도에 소재한 대영제약에서 구입하였다. 갈근 200 g을 환저플라스크(round bottom flask) 에 5배 (w/v)의 70% 에탄올을 가하여 60℃에서 2시간 2회 추출, 감압농축 하여 얻은 70% 에탄올 추출물을 hexane, ethyl acetate(EA), butanol(BuOH) 및 증류수 (H2O) 순으로 분획하여 각 분획물을 동결건조한 결과 다음과 같은 분말을 얻었다(Fig.
- 토끼 연골조직 세포 : 2~3주령의 토끼 관절로부터 연골 조직을 분리하여 primary culture 하여 사용하였으며, 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 여기에 penicillin - streptomycin (Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 실험 결과는 mean土SD으로 표시하였으며, 음성대조군 (LPS 또는 CM)과 갈근 EA 분획물 및 양성 대조군(apigenin)과 갈근 EA 추출물 사이의 유의성은 paired Studenfs t-test를 적용하여 각각 *p<0.05, **p<0.001 및 %<0.0이인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 염증성 cytokine들로 유발된 COX-2에 기인한 PGE? 의 농도변화를 assay kit(Amersham, U.K)를 사용하여 enzyme- linked immunosorbent assay(ELISA) 방법으로 정량하였다. Goat anti-mouse Ig가 부착되어 있는 96-well plate에 PGEs 표준액 또는 시료를 가한 후, PGEz-peroxidase con- jugate와 mouse anti-PGE?를 각각 50 UL씩 가하고 실온에서 1시간 반응시 킨 후, 0.
성능/효과
- 6). 20.0 Ug/ mL(26.44 ±0.42 pg/mL) 농도에서는 음성 대조군에 비해 유 의성 있는 감소를 보였으며(p<0.001), 양성대조군(apigenin, 24.46±1.16 pg/mL)과 같은 수준을 보여 통증 억제에 효과가 있음을 확인하였다.
- 72 Ug/mL을 나타내 소염 효능을 보였다. DMB assay를 통해서 관절조직의 중요성분 중 하나인 프로테오글리 칸의 시료에 의한 분해 억제 정도를 측정해 본 결과, 갈근 EA 분획물은 프로테오글리 칸의 분해를 농도 의존적으로 저해할 뿐만 아니라 정상 세포인 대조군과 비슷한 수준까지 나타냄을 확인하였다(Fig. 3). 이는 연골세 포를 자극하고 프로테오글리칸을 생성시켜 연골을 재생시키거나 연골의 파괴를 막는, 것을 의미한다.
- 본 실험에서는 갈근 EA 분획물의 관절조직 분해효소 활성 억제 효과를 확인하기 위하여 MMP-9 의 활성실험을 하였다. Fig. 7에서와 같이 염증성 cytokine에 의해 증가된 MMP-9의 활성이 갈근 EA 분획 물에 의해 농도 의존적으로 억제되었으며 20.0 μg/mL에서는 대조군 수준까지 감소되는 것을 확인하였다.
- 이런 골관절염 항염증 및 관절조직 분해효소 억제 작용뿐만 아니라, 진통에서도 우수한 효능이 있음을 확인하였다. 갈근 EA 분획물이 세포 수준에서 통증 유발을 증가시킨 음성 대조군(CM)에 비교해 통증 유발 물질인 PGE2를 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다(Fig. 4, Fig. 5). 또한, 마우스를 이용한 초산 통증 유발 실험에서도 갈근 EA 분획물에서 대조군(control)에 비하여 농도 의존적 인 진통 효과가 있음을 확인하였다(Fig.
- 갈근(Puerariae Radix)의 70% ethanol 추출물 중 ethyl acetate 분획물(EPR)은 염증성 cytokine을 처리한 마우스 대식세포 및 토끼연골조직세포에서 염증의 발현과 관련된 NO 생성 저해 효과를 보였고, 관절 조직의 주요 성분 중 하나인 proteoglycan의 분해 억제 효과와 관절조직 분해효소인 MMP-9의 활성이 억제되었다. 또한, 통증 유발물질인 프로스타글란딘의 유의성 있는 감소를 보여 통증 억 제 효과가 있음을 확인하였을 뿐만 아니라 초산유발 진통 효과 테스트인 동물 모델에서도 효과적으로 통증을 억제함을 확인하였다.
- 초산 유발 마우스에서의 진통 효과에 미치는 결과는 다음과 같다. 대조군에서는 10분 동안에 20.3±1.5회의 writhing syndrom을 일으켰으며, 갈근의 EA 분획 물 200 ㎎/㎏ 투여군에서는 18.3±1.5회(10.0% 저해)로 감소를 보였고, 400 ㎎/㎏ 투여군에서는 15.0±1.0회(26.3% 저해로 유의성 있는 억제 효과를 나타내어 진통 효과가 있음을 알 수 있었다 (Fig. 8, p<0.05).
- 2). 또한, 갈근 EA 분획물의 NO 생성 저해 효과에 대한 心0값은 마우스 대식세포 및 토끼 연골조직세 포에서 각각 23.61 ±0.35 pg/mL, 294.23 + 0.72 Ug/mL을 나타내 소염 효능을 보였다. DMB assay를 통해서 관절조직의 중요성분 중 하나인 프로테오글리 칸의 시료에 의한 분해 억제 정도를 측정해 본 결과, 갈근 EA 분획물은 프로테오글리 칸의 분해를 농도 의존적으로 저해할 뿐만 아니라 정상 세포인 대조군과 비슷한 수준까지 나타냄을 확인하였다(Fig.
- 이는 연골세 포를 자극하고 프로테오글리칸을 생성시켜 연골을 재생시키거나 연골의 파괴를 막는, 것을 의미한다. 또한, 관절연골 조직의 파괴에 관여하는 MMP-2, 9에 대하여 zelatin zymo- graphy 방법을 통해 갈근 EA 분획물에 의한 변화를 측정한 결과 특히 MMP-%] 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 이는 연골조직에서 MMP 합성 및 활성화에 의해 파괴된 항상성을 갈근 EA 분획물이 그 항상성을 유지 시키고 균형을 이루게 하여 연골 특이적 ECM 단백질을 정 상적으로 합성함을 의미한다.
- 5). 또한, 마우스를 이용한 초산 통증 유발 실험에서도 갈근 EA 분획물에서 대조군(control)에 비하여 농도 의존적 인 진통 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 7).
- 2). 또한, 토끼 연골조직 세포에서는 각각 5.5%, 16.2%, 39.5%로 유의성 있는(p<0.001) NO 생성 저해 효과를 보였다(Fig. 3). Apigenin의 ICsoe 마우스 대식세포에서는 7.
- 갈근(Puerariae Radix)의 70% ethanol 추출물 중 ethyl acetate 분획물(EPR)은 염증성 cytokine을 처리한 마우스 대식세포 및 토끼연골조직세포에서 염증의 발현과 관련된 NO 생성 저해 효과를 보였고, 관절 조직의 주요 성분 중 하나인 proteoglycan의 분해 억제 효과와 관절조직 분해효소인 MMP-9의 활성이 억제되었다. 또한, 통증 유발물질인 프로스타글란딘의 유의성 있는 감소를 보여 통증 억 제 효과가 있음을 확인하였을 뿐만 아니라 초산유발 진통 효과 테스트인 동물 모델에서도 효과적으로 통증을 억제함을 확인하였다. 즉, 갈근의 70% ethanol 추출물 중 ethyl acetate 분획물(EPR)은 독성의 문제뿐만 아니라, 소염, 진통 효과 및 연골조직세포의 분해를 억제하는 다양한 효과를 나타내는 장점을 지니고 있어 관절염 치료제의 훌륭한 후보약재가 될 것으로 기대된다.
- 4에 나타내었다. 음성대조군(CM)의 경우는 proteoglycan의 분해 산물인 GAG 함량이 31.84±0.52 μ응/mg으로서 대조군(coir trol, 15.18±0.16 μg/mg)에 비해 유의성 있는 증가를 보여 염증성 cytokines에 의한 pnDteoglycan의 분해를 확인하였다(pCO.OOD 갈근 EA 분획물을 처리한 시험군에서는 농도 의존적인 proteoglycan 분해 억제하였음을 확인하였고, 20.0 jig/mL( 17.63±0.17 yg/mg) 농도에서는 대조군과 비슷한 수준으로 proteoglycan의 분해를 유의성 있게 저해함을 확인하였다 (p<0.001).
- 이런 골관절염 항염증 및 관절조직 분해효소 억제 작용뿐만 아니라, 진통에서도 우수한 효능이 있음을 확인하였다. 갈근 EA 분획물이 세포 수준에서 통증 유발을 증가시킨 음성 대조군(CM)에 비교해 통증 유발 물질인 PGE2를 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다(Fig.
- 이상과 같은 결과로 보아 갈근의 70% ethanol 추출물 중 ethyl acetate 분획물(EPR)은 기존에 잘 알려진 항산화 작용뿐만 아니라, 소염 및 진통 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 특히, 갈근은 식품 원재료로서 전래적인 식생활이나 통념상 널리 이용되어져 왔으며, 지금까지 특별한 부작용이 보고된 적이 없어 단일 합성 의약품의 복용으로 발생되는 안전성 문제를 지니지 않을 것으로 사료된다.
- 001). 토끼 연골조직 세 포에서도 염증성 cytokine을 처리하지 않은 대조군(control, 19.65±1.24 pg/mL)에 비하여 처리한 음성대조군(CM, 267.72 + 9.98 pg/mL)에서 약 14배 이상 증가를 보여 통증 유발을 확인하였고 이와 비교해 갈근 EA 분획물을 처리한 군에서 농도 의존적인 감소를 확인하였다(Fig. 6). 20.
- 5). 특히, 20.0 Ug/ mL(193.50 +10.18 pg/mL) 농도에서는 음성대조군에 비해 유의성 있는 감소를 보였으며 (p<0.001), 양성 대조군(apigenin, 302.70+11.88 pg/mL)에 비해서도 유의성 있는 우수한 통증 억제 효과가 있음을 확인하였다(p<0.001). 토끼 연골조직 세 포에서도 염증성 cytokine을 처리하지 않은 대조군(control, 19.
후속연구
- 특히, 갈근은 식품 원재료로서 전래적인 식생활이나 통념상 널리 이용되어져 왔으며, 지금까지 특별한 부작용이 보고된 적이 없어 단일 합성 의약품의 복용으로 발생되는 안전성 문제를 지니지 않을 것으로 사료된다. 실험동물을 이용한 골재생 효능 검색 등 좀 더 세밀한 약리 기전 연구가 수행된다면 천연물신약 개발의 경비 및 기간을 단축시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한, 통증 유발물질인 프로스타글란딘의 유의성 있는 감소를 보여 통증 억 제 효과가 있음을 확인하였을 뿐만 아니라 초산유발 진통 효과 테스트인 동물 모델에서도 효과적으로 통증을 억제함을 확인하였다. 즉, 갈근의 70% ethanol 추출물 중 ethyl acetate 분획물(EPR)은 독성의 문제뿐만 아니라, 소염, 진통 효과 및 연골조직세포의 분해를 억제하는 다양한 효과를 나타내는 장점을 지니고 있어 관절염 치료제의 훌륭한 후보약재가 될 것으로 기대된다.
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