택사추출물의 성분분리와 화장품 원료로서의 특성 Separation and Purification of Effective Components from the Alisma orientale and its Application as a Cosmeceutical Ingredient원문보기
본 연구는 택사의 화장품 원료로서의 특성을 알아보기 위하여 화장품의 기능들인 항산화, 미백, 세포 손상 회복 및 항염증과 관련된 다양한 실험을 실시하였다. 30, 70, 100% MeOH 용매로 추출한 택사 추출물들은 DPPH법으로 실시한 free radical scavenging assay에서 좋은 활성을 보여주었고, tyrosinase 활성 억제 시험에서도 0.5% 이상의 농도에서 농도 의존적인 활성을 보여주었다. Human fibroblast를 사용한 proliferation assay (MTT assay)에서 각 용매 추출물들은 별다른 효과를 보여주지 못했고 0.05% 이하의 농도에서는 세포 독성으로부터 안전하다는 것을 알 수 있었다. Bl6 melanocyte를 사용한 melanin 생성 억제시험에서 각 용매별 추출물은 독성으로부터 안전한 0.05% 이하의 농도에서 melanin 생성을 40% 이상 억제하는 높은 활성을 보여주었다. 이후 우리는 택사 추출물의 MPLC분리 분획을 실시하여 세 가지 분획을 얻었으며 이들을 대상으로 세포 손상 회복시험과 melanin생성 억제 시험, 염증인자 생성 억제 시험을 실시하였다. 그 결과 분획물들 중 3번 분획물이 세포 손상 회복을 30% 이상 올려주는 좋은 결과를 보여주었고, melanin 생성 억제 시험과 COX-2 생성억제에서도 주목할만한 결과를 보여주었다.
본 연구는 택사의 화장품 원료로서의 특성을 알아보기 위하여 화장품의 기능들인 항산화, 미백, 세포 손상 회복 및 항염증과 관련된 다양한 실험을 실시하였다. 30, 70, 100% MeOH 용매로 추출한 택사 추출물들은 DPPH법으로 실시한 free radical scavenging assay에서 좋은 활성을 보여주었고, tyrosinase 활성 억제 시험에서도 0.5% 이상의 농도에서 농도 의존적인 활성을 보여주었다. Human fibroblast를 사용한 proliferation assay (MTT assay)에서 각 용매 추출물들은 별다른 효과를 보여주지 못했고 0.05% 이하의 농도에서는 세포 독성으로부터 안전하다는 것을 알 수 있었다. Bl6 melanocyte를 사용한 melanin 생성 억제시험에서 각 용매별 추출물은 독성으로부터 안전한 0.05% 이하의 농도에서 melanin 생성을 40% 이상 억제하는 높은 활성을 보여주었다. 이후 우리는 택사 추출물의 MPLC분리 분획을 실시하여 세 가지 분획을 얻었으며 이들을 대상으로 세포 손상 회복시험과 melanin생성 억제 시험, 염증인자 생성 억제 시험을 실시하였다. 그 결과 분획물들 중 3번 분획물이 세포 손상 회복을 30% 이상 올려주는 좋은 결과를 보여주었고, melanin 생성 억제 시험과 COX-2 생성억제에서도 주목할만한 결과를 보여주었다.
In this study, we performed anti-oxidation, whitening, cell recovery and anti-inflammation effects with Alisma orientale to evaluate the cosmeceutical properties. Alisma orientate extract (30, 70, 100 % MeOH) exhibited a significant tree radical scavenging effect against 1,1-diphenyl-2-picryl hydraz...
In this study, we performed anti-oxidation, whitening, cell recovery and anti-inflammation effects with Alisma orientale to evaluate the cosmeceutical properties. Alisma orientate extract (30, 70, 100 % MeOH) exhibited a significant tree radical scavenging effect against 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazine (DPPH) radical generation and showed tyrosinase inhibition effect in a dose dependent manner (over 0.5% concentration). In cell proliferation assay using human fibroblast, it didn't show any proliferation effect but showed safety from cytotoxicity under 0.05% concentration. For whitening assay, we evaluated the melanin synthesis rate using B16 melanocyte and it showed a significant inhibitory effect (up to 40% under 0.05% concentration). After major screening assay, we separate 3 fractions from Alisma orientate extract by MPLC and performed cell recovery assay, melanin synthesis inhibition assay and anti-inflammatory assay. The third fraction showed a cell recovery effect over 30% against radical damage and remarkable repression in melanin synthesis and COX-2 synthesis.
In this study, we performed anti-oxidation, whitening, cell recovery and anti-inflammation effects with Alisma orientale to evaluate the cosmeceutical properties. Alisma orientate extract (30, 70, 100 % MeOH) exhibited a significant tree radical scavenging effect against 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazine (DPPH) radical generation and showed tyrosinase inhibition effect in a dose dependent manner (over 0.5% concentration). In cell proliferation assay using human fibroblast, it didn't show any proliferation effect but showed safety from cytotoxicity under 0.05% concentration. For whitening assay, we evaluated the melanin synthesis rate using B16 melanocyte and it showed a significant inhibitory effect (up to 40% under 0.05% concentration). After major screening assay, we separate 3 fractions from Alisma orientate extract by MPLC and performed cell recovery assay, melanin synthesis inhibition assay and anti-inflammatory assay. The third fraction showed a cell recovery effect over 30% against radical damage and remarkable repression in melanin synthesis and COX-2 synthesis.
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문제 정의
본 연구에서는 수십여 가지의 천연물을 대상으로 실시한 기본 스크리닝에서 주목할만한 결과를 보여준 몇 가지 천연물 중 하나인 택사의 화장품적인 특성을 알아보기 위하여 항산화, 미백, 세포 증식 및 세포 손상 억제, 항염증 등과 관계된 일련의 실험을 실시하였다. 추가로 MPLC를 사용하여 택사 추출물을 분리 분획하여 각각의 분획물에 대한 실험도 실시하였다.
제안 방법
FBS를 10% 농도로 하여 배양하였다. 3-(4,5-dimeth- ylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 측정은 Mosmann 방법[19]을 변형하여 실시하였다. 섬유아세포증식 시험은 각 용매별 택사 추출물을 대상으로 실시하였다.
이 중 배양 상등액을 취하여 배양액으로 유리 된 IL-1을 ELISA kit (ENDOGEN 사) 사용하여 정량한다. Dish를 사용하여 동일한 시험을 실시한 후 dish 바닥에 세포들을 수거하여 초음파로 파쇄한 후 세포 내에 존재하는 COX-2의 양을 COX2 ELISA kit (ENDOGEN 사)을 사용하여 정량한다.
Tyrosinase 효소의 활성 저해 측정은 Kubo와 Kinst- Hori의 방법[18]을 변형하여 실험에 사용하였다. 96 well plate에 0.
배양 후 배지를 제거하고 10% FBS, 0.2 mM theoph- ylline이 함유된 DMEM으로 교체한 농도별 희석한 sam-pie을 각각 첨가하고 나서, 5% CO2, 37℃ 조건하에서 세포가 약 80% 이상 될 때까지 배양하였다. 이 시험에서 사용한 택사 시료는 각 용매별 추출물과 100% 메탄올 추출물의 MPLC 분획물을 사용하였다.
실시하였다. 세포 손상의 유도는 과산화수소를 사용하여 라디칼 손상을 유도하였다. 이 시험에서의 시료는 100% 메탄올 추출물의 MPLC 분획물을 대상으로 하였다.
상등액이 제거된 pellet을 60℃ 항온기에서 24 h 건조시킨 후 1 N NaOH를 첨가하여 세포내의 melanin을 용해시켰다. 용해된 melanin을 PBS로 적당량 희석하여 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 melanin 저해율을 측정하였다.
또한, 세포 배양계를 이용한 시험에서는 주목할만한 세포 분화 촉진 효과를 보여주지는 못하였으나 세포 독성이 없는 농도 범위에서 매우 높은 멜라닌 생성 억제 활성을 보여주었다. 이러한 결과는 메탄올 택사 추출물을 대상으로 MPLC 분리 분획을 통한 추가 연구를 하게 하였고, 실라카겔 크로마토그래피 ethyl acetate : methyl alcohol (7:3)의 조건으로 전개시켜 분리한 결과 3개의 분획을 얻을 수 있었다. 각 분획의 면적비는 1번 분획은 약 25%, 2번 분획은 약 44% 그리고 3번 분획은 약 30% 였다.
추가로 MPLC를 사용하여 택사 추출물을 분리 분획하여 각각의 분획물에 대한 실험도 실시하였다.
추출액은 여과지(Whatman, No 2)를 사용하여 여과한 후 evaporator (EYELA, BUCHI)를 이용하여 농축하였다. 메탄올 추출물은 syringe filter (Sartorius)로 다시 한번 여과하여 실험에 사용하였다.
택사 100% 메탄올 추출물 2 g을 메탄올 20 ㎖에 용해시킨 후 syringe filter (Sartorius)로 여과한 후, MPLC를사용하여 실라카겔 크로마토그래피 ethyl acetate: methylalcohol (7:3)의 조건으로 전개시켜 분리하였다. 이 방법으로 3개의 분획으로 분리하였고, 254 nm에서 측정한 결과 1번 분획은 약 25%, 2번 분획은 약 44% 그리고 3번 분획은 약 30%의 면적비를 나타내었다.
택사 300 g을 각각 1 L의 100%, 70% 그리고 30% 메탄올의 조건으로 실온에서 일주일동안 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman, No 2)를 사용하여 여과한 후 evaporator (EYELA, BUCHI)를 이용하여 농축하였다.
항산화 활성은 DPPH를 이용하여 시료의 라디칼 소거 효과를 측정하는 Blois법[17]을 변형하여 실험에 사용하였다. 96 well plate에 0.
대상 데이터
사용하였다. DPPH(l, l-diphenyl-2-picryl-hydra-zyl), tyrosinase (from mushroom), L-tyrosine, MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazol-2-yl)]는 Sigma사의 제품을, 크로마토그래피에 사용한 Silica gel 60 (230~400 mesh)은 Merck사의 제품을, 용매는 덕산화학과 Fisher사의 제품을 사용하였다.
Human normal fibroblast를 국내 MTT사에서 구입하여 DMEM과 HAM'S/FT2 media를 3:1의 비율로 조성하고 FBS를 10% 농도로 하여 배양하였다. Fibroblast를 12 well plate에 분주한 후 24 h 배양한다.
본 실험에 사용한 택사는 2005년 3월 경동시장에서 구입하여 사용하였다. DPPH(l, l-diphenyl-2-picryl-hydra-zyl), tyrosinase (from mushroom), L-tyrosine, MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazol-2-yl)]는 Sigma사의 제품을, 크로마토그래피에 사용한 Silica gel 60 (230~400 mesh)은 Merck사의 제품을, 용매는 덕산화학과 Fisher사의 제품을 사용하였다.
사람의 정상 섬유아세포를 국내 MTT사에서 구입하여 DMEM과 HAM'SZF-12 media를 3 : 1의 비율로 조성하고 FBS를 10% 농도로 하여 배양하였다. 3-(4,5-dimeth- ylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 측정은 Mosmann 방법[19]을 변형하여 실시하였다.
3-(4,5-dimeth- ylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 측정은 Mosmann 방법[19]을 변형하여 실시하였다. 섬유아세포증식 시험은 각 용매별 택사 추출물을 대상으로 실시하였다. Human fibroblast를 12 well plate에 분주하여 24 h 배양 후, 시료를 처리하여 48 h 배양하였다.
2 mM theoph- ylline이 함유된 DMEM으로 교체한 농도별 희석한 sam-pie을 각각 첨가하고 나서, 5% CO2, 37℃ 조건하에서 세포가 약 80% 이상 될 때까지 배양하였다. 이 시험에서 사용한 택사 시료는 각 용매별 추출물과 100% 메탄올 추출물의 MPLC 분획물을 사용하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음 PBS로 세척하고 trypsin으로 처리하여 세포 pellet을 회수하였다.
세포 손상의 유도는 과산화수소를 사용하여 라디칼 손상을 유도하였다. 이 시험에서의 시료는 100% 메탄올 추출물의 MPLC 분획물을 대상으로 하였다. Human fibroblast를 12 well plate에 분주하여 24 h 배양 후 2 × 10-4 M의 과산화수소를 대조군을 제외한 모든 well에 처리한다.
성능/효과
1% (1 ㎎/㎖) 까지는 비슷한 결과를 나타내었다. 0.2% (2 ㎎/㎖)부터 1% (10 ㎎/㎖)까지는 70%와 30%메탄올 추출물이 100% 메탄올 추출물에 비해 좋은 결과를 나타내었다. 0.
30, 70, 100% 메탄올 용매로 추출한 택사 추출물은 in vitro 실험인 DPPH 라디칼 소거 시험과 tyrosinase 활성 억제 시험에서 좋은 활성을 보여주었다. 또한, 세포 배양계를 이용한 시험에서는 주목할만한 세포 분화 촉진 효과를 보여주지는 못하였으나 세포 독성이 없는 농도 범위에서 매우 높은 멜라닌 생성 억제 활성을 보여주었다.
MPLC로 얻은 3가지로 시험한 결과 세 가지 분획물 모두 세포 손상을 회복시키는 효과가 있었으며 3번 분획물의 경우 손상 회복 효과가 매우 높은 것을 확인할 수 있었다. 1, 2번 분획물은 마일드한 효과를 보여주었다.
있다. 각 용매별 택사 추출물은 0.2% 이하 모든 시험영역에서 매우 높은 멜라닌 생성 억제 효과를 보여주고있다. 그러나, 3.
이 결과는 시험 농도에서 cell의 proliferation 결과 뿐 아니라 cytotoxicity를 확인할 수 있다. 각 용매별 택사 추출물은 별 다른 세포증식 효과를 보여주지 못하였고 30, 70% 메탄올 추출물은 세포 독성에 대하여 비교적 안전한 결과를 보여주었다. 그러나 100% 메탄올 추출물은 0.
시험에서 좋은 활성을 보여주었다. 또한, 세포 배양계를 이용한 시험에서는 주목할만한 세포 분화 촉진 효과를 보여주지는 못하였으나 세포 독성이 없는 농도 범위에서 매우 높은 멜라닌 생성 억제 활성을 보여주었다. 이러한 결과는 메탄올 택사 추출물을 대상으로 MPLC 분리 분획을 통한 추가 연구를 하게 하였고, 실라카겔 크로마토그래피 ethyl acetate : methyl alcohol (7:3)의 조건으로 전개시켜 분리한 결과 3개의 분획을 얻을 수 있었다.
세포 손상복구 시험에서 세 가지 분획 모두 좋은 효과를 보여주었고, 특히 3번 분획물의 효과가 두드러졌다. 멜라닌 생성 억제 시험에서 역시 3번 분획물의 효과가 매우 높았으며, 염증 인자 분비 억제 시험에서도 COX-2 생성에 대한 강한 억제 효과를 보여주었다.
이렇게 얻어진 세 개의 분획을 가지고 세포 손상 복구 시험과 멜라닌 생성 억제 시험, IL-1, COX-2 분비 억제 시험을 실시하였고, 우리는 매우 흥미로운 결과를 얻을 수 있었다. 세포 손상복구 시험에서 세 가지 분획 모두 좋은 효과를 보여주었고, 특히 3번 분획물의 효과가 두드러졌다. 멜라닌 생성 억제 시험에서 역시 3번 분획물의 효과가 매우 높았으며, 염증 인자 분비 억제 시험에서도 COX-2 생성에 대한 강한 억제 효과를 보여주었다.
(7:3)의 조건으로 전개시켜 분리하였다. 이 방법으로 3개의 분획으로 분리하였고, 254 nm에서 측정한 결과 1번 분획은 약 25%, 2번 분획은 약 44% 그리고 3번 분획은 약 30%의 면적비를 나타내었다.
이러한 결과들로부터 우리는 택사 추출물 및 그 분리 분획물들이 화장품 원료로써 매우 높은 연구 가치가 있다는 결론을 얻을 수 있었다. 또한, 3번 분획물에 대한 좀 더 다양하고 깊은 연구가 필요하다고 판단하였다.
각 분획의 면적비는 1번 분획은 약 25%, 2번 분획은 약 44% 그리고 3번 분획은 약 30% 였다. 이렇게 얻어진 세 개의 분획을 가지고 세포 손상 복구 시험과 멜라닌 생성 억제 시험, IL-1, COX-2 분비 억제 시험을 실시하였고, 우리는 매우 흥미로운 결과를 얻을 수 있었다. 세포 손상복구 시험에서 세 가지 분획 모두 좋은 효과를 보여주었고, 특히 3번 분획물의 효과가 두드러졌다.
후속연구
또한, 3번 분획물에 대한 좀 더 다양하고 깊은 연구가 필요하다고 판단하였다. 따라서, 본 연구소에서는 3번 분획물에 대한 구조분석을 실시하여 효능성분의 작용메카니즘 등 더욱 구체적인 연구를 진행 중에 있다.
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