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문제 정의
- 多用하는 甘菊, 馬齒.竟, 生地楡, 苦蔘, 黃柏, 蛇床子 등의 복합추출물(S1)을 이용하여 여드름 및 여러 염증성 피부질환 의원 인균으로 알려진 S. aureus, M. fnrfiir, P. acnes, S. 叩 i dermis에 대한 항균력을 평가하고, 이와 더불어 피부질환의 면역학적인원인으로 생각되는 아낙필락시에 위의 한약재들이 미치는 영향을 알아보기위해 Compound48/80에 의한 비만세포의 부유량과 히스타민의 방출량을 비교하고 Passive Cutaneous Anaphylaxis (PCA) 반응을 유도하여 항알레르기 효과를 검증하고 Cyclooxygenease-2 활성에 미치는 영향 및 염증을 일으키는 주요한 Cytokine으로 알려진 IL-1& TNF-a, IL-6의 유전자 발현도 억제 효과를 살펴보았고 세포독성 정도를 평가한 결과 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 그렇지만 대부분 항생제에 대한 내성과 화학적 살균제의 세포독성 때문에 새로운 형태의 항 미생물제가 필요한 실정이다. 그러므로 본 실험에서 S1 을 이용하여 상기 균에 대한 항균 효과를 알아보고자 하였다.
- 如胛s가 여드름을 유발하는 대표적인 균이라고 알려져 있으며 다양한 물질들을 사용하여 여드름의 치료 및 예방에 적용하고 있지만 항균활성에 대한 객관적인 자료들이 미비한 실정이다. 본 실험에서 S1 을 이용하여 agar diffusion 법을 통해 S1의 P. 但%%에 대한 항균활성을 실험한 결과 항균 활성이 나타났으므로 이를 직접 배양배지에 적용 균의 성장에 미치는 S1 의 영향을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 甘菊, 馬齒竟, 生地檢, 苦蔘, 黃柏, 蛇床子(이하 S1)를 이용하여 여드름 및 피부에 염증을 유발할 수 있는 이 네 가지 균주들에 대한 저해 작용 및 생육 특성을 파악하고자 하였다. S.
- 저자는 瀉火解毒 淸熱燥濕 疏散風熱의 효능이 있어 內服藥 과 外用藥으로 피부과 질환에 多用하는 甘菊, 馬齒竟, 生地楡, 苦 蔘, 黃柏, 蛇床구를 이용하여 항균, 항염, 항알레르기 효과를 평가하기 위해 본 실험을 시행하였다.
제안 방법
- 각기 균이 성장할 수 있는 고체 배지를 제조하고 그 위에 미생물 배양액 100以를 도말하였다. 10분 동안 배지의 표면을 건조한 후, 배지위에 직경 10mm의 paper disk를 올려놓고 추출 샘플을 10%, l%(w/v)로 희석한 용액 5项씩을적용하였다. 37℃로 고정된 배양조에서 보관하면서 paper disk 주위에서 미생물이 성장하지 않는 clear zone의 직경을 확인하여 항균 활성을 비교하였다.
- 10분 동안 배지의 표면을 건조한 후, 배지위에 직경 10mm의 paper disk를 올려놓고 추출 샘플을 10%, l%(w/v)로 희석한 용액 5项씩을적용하였다. 37℃로 고정된 배양조에서 보관하면서 paper disk 주위에서 미생물이 성장하지 않는 clear zone의 직경을 확인하여 항균 활성을 비교하였다.
- 여기에서 얻어진 수층 2砒 에 IM NaOH 용액 400 及와 1% o-phthaldialdehyde 용액 100成를 가하고 37℃ 항온수조에서 3분간 반응시켰다. 3M HC1 용액 200以를 가한 다음 人ex = 353nmz Xem = 438nm에서 spectrofluorometer로 상대 형광강도를 측정하여 정량하였다.
- 주사한 부위는 유성펜으로 표시하였다. 48시간 후에 anti-DNP IgE 로 감작시킨 비만 세포를 DNP-HSA로 탈감작시키기 1시간 전에 S1 을 1, 10, 100nig/m« 피부에 도포하여 처리하였디..
- 2g을 혼합한 시험관에 넣고 진탕 후 원심분리 500% 10분간 하였다. Butanol층 &戒를 취해 0.1M HC1 n-heptane 10诫를 가하여 진탕 후 원심분리 500xg/ 10 분간 하였다. 여기에서 얻어진 수층 2砒 에 IM NaOH 용액 400 及와 1% o-phthaldialdehyde 용액 100成를 가하고 37℃ 항온수조에서 3분간 반응시켰다.
- Compound 48/80 비 투여군(control), Compound 48/80 투여군(C48/80), 그리고 S1 투여군은 SI 100mg/me 도포군, SI 10mg /inC 도포군, SI Inig/被 도포군으로 군을 나누어서 각 군당 생쥐 3마리씩 사용하였다.
- LPS(L明/咸)를 사용하여 대식세포주인 RAW 264.7(1x106 cell)의 COX-2 활성을 유도한 모델에서 S1 을 50, 100, 200ppm 농도로 24시간 처리하여 COX-2 발현 정도를 Western Blot 수행하여 분석하였다. LPS 단독 처리군에 비해 S1 을 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
- MTT 정량방법을 이용하여 1, 10, 50, 100, 200, 500, lOOOppm 농도의 S1 을 포함된 배양액에서 L929 세포를 24시간 배양 후 세포증식률을 측정하여 대조군과 비교하였다(Fig. 9). S1 이 1, lOppm농도에서는 세포증식률이 대조군에 비해 2, 6%로 증가되었고, 50ppm에서는 12% 증가됨을 확인하였다.
- Mosmann的의 방법에 i자■라 배양한 세포주를 각각 5xl03 c이1/畝이 되도록 96 well plate에 분주하여 24시간 배양 후 이들 세포를 L 10, 50, 100, 200z 500, 1000 ppm 농도의 S1 이 포함된 배양액에서 24시간 배양 후 MTT 200陽/砒 가 포함된 배양액을 well 당 200及씩 넣은 후 다시 3시간 동안 배양하였다. 배양 후배양액을 버리고 DMSO를 10CM/well씩을 넣어 5분간 실온에방치하며 Formazan을 용해한 후 microplate Reader로 흡광도 570 nm에서 측정하였다.
- PCA 반응에 미치는 S1의 효과를 검토하기 위하여 DNP-HSA와 Evans bkie의 혼합액을 투여하기 1시간 전에 S1 을 L 10, lOOmg/i此의 농도로 피부에 도포하여 처리하였다. Table 10 에서와 같이 수동 피부 아나팔락시 반응은 S1 농도 의존적으로 억제 되었으며, 특히 lOOmg/畝의 농도에서 유의성 있는 억제 효과를 나타내었다.
- 한약재 도포 40분 후, ether로 마취한 생쥐의 양쪽 귀 등쪽면에 microsyririge를 사용하여 희석한 Compound 48/80을 20以씩(10%g/site) 각각 피내주사를 실시하였다. control군은 Compound 48/80 대신에 생리식염수를 20以 피내주사하였다. 주사 40분 후 다시 ether로 마취하여 digimatic micrometer(Mitutoyoz Japan)를 이용하여 귀 두께를 측정하였다.
- 甘菊, 馬齒竟, 生地楡, 苦蔘, 黃柏, 蛇床子 복합추출물(S1)의 여드름이나 다양한 피부과 질환의 원인균으로 알려진 Stapylococcus aureus, Malassezia furfur, Propionibaderium acnes, St叩洲ococcus 咖姑湖s에 대한 항균, 항염 및 항알레르기 효과를 검증한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 귀 두께 측정 후 바로 귀를 절단하여 10% paraformaldehide 에 귀조직을 담아서 4℃에 보관하였다, 24시간 후 30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 100% ethanol에 차례로 귀조직을 담아서 탈수를 하였다 xylene 처리 후 파라핀에 조직을 담아서 24시간 동안 5 2 ℃ incubatei에 보관하여 잔여 xylene이 모두 증발하도록 하였다. 귀조직을 임베딩 틀에 고정하여 파라핀이 충분히 굳은 후에 조직을 8um로 절편하여 슬라이드 글라스에 붙여서 37℃에서 24 시간 동안 두어 조직이 슬라이드 글라스에 완전히 접착되도록 하였다.
- 지수성장기의 중간단계에서 있는 미생물 배양액 100以를 한천배지에 도말하고 10분 동안 표면을 건조시켰다. 그 후 paper disk를 위치시키고 S1 추출물 1%, 10% 용액 50成를 각각 흡수 시킨 후 37℃ 에서 12~24시간 배양 후, 그 저지환을 측정하였다. 피부 상재균인 S.
- )로필터한 후 rotary evaporator(EYELA, Japan)틀 이용하여 농축하였다. 그 후 농축액을 동결건조기(Ilshin, korg)를 이용 분말을 회수, 4C 냉장고에 보관하면서 실험을 행하였다. 실험에 사용 시 샘플내의 미생물을 완전 제거하기 위해 autoclave(12rc, 15 분)에서 멸균을 행하였다.
- . 꼬리 정맥에 DNP-HSA(lmg/畝 in PBS)와 Evan blue(4%) 16mg을 l:l(200ul)로 혼합하여 주사하여 항원 항체 반응을 야기시키고, 30분 후에 치사시켰다. Evans Blue로 염색된 처음 표시한 피부 부위 적출하여 IM KOH lm« 를 가하여 37℃로 20시간 incubation시켜 조직을 완전히 용해하였다.
- 대한 효과를 실험하였다. 또 in vitro 실험으로 Compound 48/80에 의해 유도되는 복강비만세포로부터 히스타민 유리 조절에 미치는 효과를 실험하였다. S1은 비만세포로부터 Compound 48/80에 의한 히스타민의 유리를 농도 의존적으로 억제하였으며, hng/皿의 농도에서 유의성 있는 억제 효과를 나타내었다 (Fig.
- 또한 본 실험에서는 S1 이 즉시형 알레르기 반응의 조절에 미치는 효과를 검토하기 위하여 in vivo 실험으로 비면역학적 자극제인 Compound 48/80에 의한 IgE 매개 수동 피부 아나필락시에 대한 효과를 실험하였다. 또 in vitro 실험으로 Compound 48/80에 의해 유도되는 복강비만세포로부터 히스타민 유리 조절에 미치는 효과를 실험하였다.
- 슬라이드 글라스를 xylene에 담궈 파라핀을 녹인 후, 100%, 95%, 90%, 70%, 50%, 30%의 ethanol로 재수화시켜 염색을 실시하였다. 먼저 alcian blue로 40분 염색 후 증류수로 세척하고 NFR(nuclear fast red)로 2분 염색하여 증류수로 세척 후 커버글라스를 덮어서 현미경으로 관찰하였다.
- 7에 S1 을 50, 100, 200ppm으로 LPS(0丄妮/禍)로 자극하기 30분 전에 처리하고 20시간 배양하였다. 배양후 RNA를 분리한 후 이를 이용하여 cDNA를 합성하여 LPS에 의해 생성된 cytokine의 측정하기 위해서 RT-PCR을 수행하였다. RT- PCR 결과 IL-고은 House keeping gene인actin의 양과 비교 측정시 Table 11.
- 1% bovine serum albumin) 20i此를 복강 내에 주입하고 복벽을 마사지 하였다. 복벽 중앙선을 절개하고 pasteur pipette로 복강 세척액을 채취하여 원심분리 (150xg, 10분)하였다. 상층액을 제거한 후 비만세포 부유액을 Tyrode buffer B에 재부유시켰다.
- 본 실험에서는 마우스 귀 피내조직에 비만세포의 탈과립을 유도하여 히스타민을 방출시키는 물질인 compound 48/80을 주사하여 히스타민에 의한 즉시형 과민반응을 인위적으로 유발시켜서 S1의 국소 도포에 의한 귀부종의 감소 효과와 조직검사를 통한 비만세포의 탈과립 정도를 알아보았다. Fig.
- 샘플의 제조는 중탕가열을 통한 열수 추출법을 사용하였으며 이때의 추출 조건은 90℃, 90분이었다. 추출된 물질은 원심분리기(Hanil, Korea)를 이용 8, 000rpm에서 10분 동안 2회 행하여 이물질을 제거하였으며 0.
- 귀조직을 임베딩 틀에 고정하여 파라핀이 충분히 굳은 후에 조직을 8um로 절편하여 슬라이드 글라스에 붙여서 37℃에서 24 시간 동안 두어 조직이 슬라이드 글라스에 완전히 접착되도록 하였다. 슬라이드 글라스를 xylene에 담궈 파라핀을 녹인 후, 100%, 95%, 90%, 70%, 50%, 30%의 ethanol로 재수화시켜 염색을 실시하였다. 먼저 alcian blue로 40분 염색 후 증류수로 세척하고 NFR(nuclear fast red)로 2분 염색하여 증류수로 세척 후 커버글라스를 덮어서 현미경으로 관찰하였다.
- 그 후 농축액을 동결건조기(Ilshin, korg)를 이용 분말을 회수, 4C 냉장고에 보관하면서 실험을 행하였다. 실험에 사용 시 샘플내의 미생물을 완전 제거하기 위해 autoclave(12rc, 15 분)에서 멸균을 행하였다.
- 역전 사중합연쇄반응은 역전 사 kit(promega, Madison USA) 와 중합연쇄반응 kit(Pre-mixz 한국생공, 대덕)를 이용하여 실시하였다. 즉 rapid guanidium isothiocyanate 방법으로 마우스 대식세포 주로부터 주출한 0.
- 염증반응의 중요한 cytokine들인 IL-邛, TNF-a, IL-6의 발현 도를 분석하기 위해서 마우스 대식세포주 RAW 264.7에 S1 을 50, 100, 200ppm으로 LPS(0丄妮/禍)로 자극하기 30분 전에 처리하고 20시간 배양하였다. 배양후 RNA를 분리한 후 이를 이용하여 cDNA를 합성하여 LPS에 의해 생성된 cytokine의 측정하기 위해서 RT-PCR을 수행하였다.
- 120g/ 畝; Sigma) 2戒에 가하여 원심분리(400xg, 15분)하였다. 완충액과 metrizamide의 접촉면에 남아있는 세포는 수집하여 제거하고, Tyrode buffer B 1臨에 재부유시킨 후 이 과정을 반복하여 비만세포는 toluidine blue 염색으로 확인시 순도 95%가 되도록 하였다
- control군은 Compound 48/80 대신에 생리식염수를 20以 피내주사하였다. 주사 40분 후 다시 ether로 마취하여 digimatic micrometer(Mitutoyoz Japan)를 이용하여 귀 두께를 측정하였다.
- 주출한 한약물을 처리 당일 FBS가 첨가되지 않은 DMEM와 FBS가 첨가된DMEM에 희석하여 처리농도별로 사용한다. 처리농도는 1, 10, 50, 100, 200, 500, 1000 ppm로 처리하고, 처리 시간은 24시간으로 실시하였다.
- Kawabata 등均의 방법에 따라 실험하였다. 즉 ICR계 생쥐의 등 쪽 털을 제모 후, anti-DNP IgE lOOng을 생쥐의 등에 3 부위에 피내주사하여 감작시켰다. 주사한 부위는 유성펜으로 표시하였다.
- 세포 부유액 중 비만세포는 Yurt 등의 방법으로 정제하였다. 즉 Tyrode buffer B 项에 재부유시킨 비만세포 부유액을 22.5% metrizamide(0.225g/niQ(density 1.120g/ 畝; Sigma) 2戒에 가하여 원심분리(400xg, 15분)하였다. 완충액과 metrizamide의 접촉면에 남아있는 세포는 수집하여 제거하고, Tyrode buffer B 1臨에 재부유시킨 후 이 과정을 반복하여 비만세포는 toluidine blue 염색으로 확인시 순도 95%가 되도록 하였다
- 즉 rapid guanidium isothiocyanate 방법으로 마우스 대식세포 주로부터 주출한 0.5 ng의 total RNA를 역전사반응액 (0.1 pg; oligo (dT)15z reverse transcription buffer, 5mM MgCh, 1 mM dNTP mixture, 10 unit; rRNase ribonuclease inhibitor, 10 units; AMV reverse transcriptase)과 혼합하여 42℃에서 30분간반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA 1 成(0.
- 히스타민은 Shore 등")방법에 따라 정량하였다. 즉 에펜돌프 튜브에 시료 500必를 취하여 0.1M HC1 450以와 60% 과염소산 용액 50以를 혼합한 후 원심분리 400xg, 20분간 하였다. 그 상층 액을 800成를 취해 5M NaOH 용액 500以, 증류수 3m«, n-butanol lOmC 및 NaCl 1.
- 등")의 방법에 따라 분리하였다. 즉 흰쥐를 ether 로 마취시킨 후 Tyrode buffer B (137mM NaCl, 12mM NaHCO3/ 2.7mM KC1, 0.3mM NaH2PO4/ ImM MgCE ImM CaC12/ 5.6mM dextrose, 0.1% bovine serum albumin) 20i此를 복강 내에 주입하고 복벽을 마사지 하였다. 복벽 중앙선을 절개하고 pasteur pipette로 복강 세척액을 채취하여 원심분리 (150xg, 10분)하였다.
- 처리농도는 1, 10, 50, 100, 200, 500, 1000 ppm로 처리하고, 처리 시간은 24시간으로 실시하였다.
- 이때의 추출 조건은 90℃, 90분이었다. 추출된 물질은 원심분리기(Hanil, Korea)를 이용 8, 000rpm에서 10분 동안 2회 행하여 이물질을 제거하였으며 0.45㎛ 여과지(ADVANTEC, USA.)로필터한 후 rotary evaporator(EYELA, Japan)틀 이용하여 농축하였다. 그 후 농축액을 동결건조기(Ilshin, korg)를 이용 분말을 회수, 4C 냉장고에 보관하면서 실험을 행하였다.
- 한약 추출 분말을 함유한 배지(1.0%, 0.5%, 0.1%, w/v)를제조한 후 여드름 균인 Propionbaderium 但功%와 피부에 염증을 일으키는 주요균인 Stapylococcus aureus 배양액을 액체 배지에 lxlO5-lxlO6CFU/me7} 되게 첨가한 후 37℃에서 진탕배양 하면서 일정시간 간격으로 시료를 채취하여 증류수로 적정 희석하여 600nm에서 OD값을 측정하여 균의 성장을 확인하였다.
- S1 을 100mg/M lOmg/me lmg/国의 농도로 희석하여 생쥐의 귀 등쪽면과 안쪽면 모두 약간 흘러내릴 정도로 충분한 양을 발라주었다. 한약재 도포 40분 후, ether로 마취한 생쥐의 양쪽 귀 등쪽면에 microsyririge를 사용하여 희석한 Compound 48/80을 20以씩(10%g/site) 각각 피내주사를 실시하였다. control군은 Compound 48/80 대신에 생리식염수를 20以 피내주사하였다.
- 흰쥐의 복강 비만세포에 미치는 S1의 효과를 검토하기 위하여 compound 48/80을 투여하기 20분 전에 S1 을 0.01, 0.1, Img/ 戒의 농도로 처리하였다. Table 9에서와 같이 S1은 비만세포에서 compound 48/80에 의한 히스타민의 유리를 농도 의존적으로 억제하였으며, Img/戒의 농도에서 유의성 있는 억제 효과를 나타내었다.
대상 데이터
- Compound 48/80, Anti-dinitrophenyl(DNP) IgEz DNP-Human serum albumin(HSA), Metrizamide, 및 O-phthaldialdehyde (OPA)는 Sigma사 제품을 사용하였다. a-minimal essential medium, Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)z Fetal bovine serum(FBS)은 Gibco BRL사 제품을 사용하였다.
- Sigma사 제품을 사용하였다. a-minimal essential medium, Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)z Fetal bovine serum(FBS)은 Gibco BRL사 제품을 사용하였다.
- 대식세포주인 RAW 264.7(monocyte)는 Korean Cell Line Bank(KCLB)로 구입하였다. 세포 배양은 10% FBS와 100unit/ml 의 penicillin/streptomycirr을 1% 첨가한 DMEM 배지를 사용하며, 37℃, 5% CO2 incubatoi■에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 동물은 대한실험동물센터(대전)에서 구입한 Sprague-Dawley계 흰쥐 및 ICR계 생쥐를 실험에 사용할 때까지 온도 22±2℃, 상대습도 55±5%로 유지되는 항온, 항습 사육실에서 사육하였다.
- 본 실험에 사용된 한약재는 원광대학교 광주한방병원에 서구입하였으며 건조된 상태였다.
- 본 실험에서 사용한 균주는 Stapylococcus epidermis KCTC 1917, Stapylococcus aureus KCTC 1928, Malassezia fiirfur KCTC 7743, Propionibacterium acnes KCTC 3320으로서 한국 유전자은행에서 분양받아 사용하였다.
- 생쥐 섬유모세포의 일종인 L929 세포주를 사용하였다. 세포배양은 10% FBS와 lOOunit/m。의 penicillin/streptomycin§ 1% 첨가한 DMEM 배지를 사용하며, 37℃, 5% CO2로 조정된 배양 기내에서 배양하며, 배양액은 3일마다 교환한다.
- 항균성 실험에 사용된 배지 중 Nutrient broth, Yeast-malt broth는 Difco(USA)에서 Actinomyces broth는 BBL(USA)에서구입하여 사용하였다 그 외 사용된 시약은 Duksan(korea)에서구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 통계학적 유의성 검정은 one-way ANOVA (Analysis of Variance) 방법을 사용하였으며, 유의수준 p<0.05 의 범위내에서 그 결과들은 평균에 대한 표준 편차로 나타낸다.
이론/모형
- Kanemoto 등")의 방법에 따라 분리하였다. 즉 흰쥐를 ether 로 마취시킨 후 Tyrode buffer B (137mM NaCl, 12mM NaHCO3/ 2.
- 히스타민은 Shore 등")방법에 따라 정량하였다. 즉 에펜돌프 튜브에 시료 500必를 취하여 0.
- Kawabata 등均의 방법에 따라 실험하였다. 즉 ICR계 생쥐의 등 쪽 털을 제모 후, anti-DNP IgE lOOng을 생쥐의 등에 3 부위에 피내주사하여 감작시켰다.
- 침전물을 제거하였다. 상층액을 Katayama 등珂의 방법에 따라 spectrofluorometer로 620nni에서 흡광도를 측정함으로써 조직 내의 Evans Blue의 양을 정량하였다.
- 상층액을 제거한 후 비만세포 부유액을 Tyrode buffer B에 재부유시켰다. 세포 부유액 중 비만세포는 Yurt 등의 방법으로 정제하였다. 즉 Tyrode buffer B 项에 재부유시킨 비만세포 부유액을 22.
- 여드름 균 및 염증 세균에 대한 S1의 항균력을 측정하기 위해 한천평판법(agar diffusion method)을 사용하였다. 지수성장기의 중간단계에서 있는 미생물 배양액 100以를 한천배지에 도말하고 10분 동안 표면을 건조시켰다.
- 항균활성 검사는 Agar diffusion법을 이용하였으며 사용된 방법은 다음과 같다. 각기 균이 성장할 수 있는 고체 배지를 제조하고 그 위에 미생물 배양액 100以를 도말하였다.
성능/효과
- 如就s의 균 성장 억제보다는 성장을 다소 늦주어주는 역할을 한다고 생각된다. 0.5% S1 추출물 첨가 배지 또한 균의 성장이 관찰되었지만 60시간 배양 후 OD값이 0.2정도로서 S1 을 첨가하지 않는 배앙배지의 12시간 정도와 동일한 균체량이관찰되었다. 이는 0.
- furfur에 대한 항균싱은 관찰되지 않았다. 10% 첨가시 저 지환의 크기가 증가하였으며 14~ 15mm정도로 높은 항균활성을 나타내었다. 그렇지만 고농도에서도 MJ”功^에 대한 저지환이 관찰되지 않았으며 이로부터 S1 추출물이 이 균에 대해서는 항균효과가 없다는 것을 알 수 있었다.
- 배양후 RNA를 분리한 후 이를 이용하여 cDNA를 합성하여 LPS에 의해 생성된 cytokine의 측정하기 위해서 RT-PCR을 수행하였다. RT- PCR 결과 IL-고은 House keeping gene인actin의 양과 비교 측정시 Table 11. 에서 같이 S1 을 50, 100, 200ppm의 처리하였을때 각각 93%, 86%, 81%으로나타나 S1 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. TNF-ae House keeping gene인 0-actin의 양과 비교 측정시 Table 12.
- 에서 같이 S1 을 50, 100, 200ppm의 처리하였을때 각각 93%, 86%, 81%으로나타나 S1 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. TNF-ae House keeping gene인 0-actin의 양과 비교 측정시 Table 12. 에서 같이 S1 을 50, 100, 200ppm의 처리하였을 때 각각 92%, 87%, 74%으로나타나 S1 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. IL-6은 House keeping gene인actin의 양과 비교 측정시 Table 13에서 같이 S1 을 50, 100, 200ppm의 처리하였을 때 각각 80%, 76%, 69%으로나타나 S1 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다(Fig.
- 수동 피부 아나팔락시 반응은 S1 농도 의존적으로 억제 되었으며, 특히 100mg/ml의 농도에서 유의성 있는 억제 효과를 보였다. COX-2 발현 정도를 분석한 결과 LPS 단독 처리군에 비해 S1 투여군이 S1 농도 의존적으로 억제됨을 보였다. S1에 대한 염증성 cytokine인 IL-ip, TNF-a , IL-6의 유전자 발현도 억제 효과를 확인한.
- LPS 단독 처리군에 비해 S1 을 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. Fig 7.에서 같이 50ppmz 100ppm을 처리한 군에서 35, 50% 정도 발현 억제 효과가 나타남을 확인하였고, 2Q0ppm에서는 60% 정도의 COX-2 발현 억제 효과가 있는 것으로 나타냈었다.
- 7(lxl06 c이1)의 COX-2 활성을 유도한 실험에서 COX-2는 LPS 단독 처리군에 비해 S1 처리군에서 S1 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. Fig 7에서 같이 50ppm, 100ppm을 처리한 군에서 35, 50% 정도 발현 억제 효과가 나타남을 확인하였고, 200ppm에서는 60% 정도의 COX-2 발현 억제 효과가 있는 것으로 나타냈다. 이런 결과로 S1은 임상적으로도 염증질환의 치료 및 예방에 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 에서 같이 S1 을 50, 100, 200ppm의 처리하였을 때 각각 92%, 87%, 74%으로나타나 S1 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. IL-6은 House keeping gene인actin의 양과 비교 측정시 Table 13에서 같이 S1 을 50, 100, 200ppm의 처리하였을 때 각각 80%, 76%, 69%으로나타나 S1 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다(Fig. 8).
- 7(1x106 cell)의 COX-2 활성을 유도한 모델에서 S1 을 50, 100, 200ppm 농도로 24시간 처리하여 COX-2 발현 정도를 Western Blot 수행하여 분석하였다. LPS 단독 처리군에 비해 S1 을 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. Fig 7.
- 결과 모두 S1 농도 의존적으로 억제됨을 보였다. MTT 정량에 의한 세포생존률을 측정한 결과 S1 이 L929 세포에 SOOppm 농도 이상에서 세포 독성이 유발됨을 알 수 있었다.
- S. epidermis (KCTC 1917), S. aureus (KCTC 1928), M. fiirfur (KCTC 7743), P. acnes (KCTC 3320)를 이용하여 항균 활성검증 결과 S1 을 1% 첨가시 S. epidermis, P. “mes에서 lOTlmm 정도의 저해환을 나타냈으며 M, furfure 대한 항균성은 관찰되지 않았다. S1 을 10% 첨가 시 S.
- 의 성장에 미치는 영향을 시간대별로 OD값을 측정하여 조사한 것이다. S. wreus는 실험에 사용한 다른 미생물에 비해 성장속도가 빠르다는 것을 알 수 있으며 lxl06cfu/me 접종시 1시간 유도기를 거쳐 12시간 후 까지 대수 증식기를 나타냈다. S10] 0.
- 또 in vitro 실험으로 Compound 48/80에 의해 유도되는 복강비만세포로부터 히스타민 유리 조절에 미치는 효과를 실험하였다. S1은 비만세포로부터 Compound 48/80에 의한 히스타민의 유리를 농도 의존적으로 억제하였으며, hng/皿의 농도에서 유의성 있는 억제 효과를 나타내었다 (Fig. 6) 또한 PCA 반응에 미치는 S1의 효과는 Table 9어서와 같이 S1의 농도 의존적으로 억제되었으며, 특히 lOOmg/畝의 농도에서 유의성 있는 억제 효과를 나타내었다. 그러므로 S1은 히스타민 유리 억제와 PCA 반응에 효과를 나타냄으로써 비만 세포 매개 즉시형 알레르기 반응을 억제하는 성분이 함유되어 있을 것으로 생각된다.
- S1의 안전성을 확인한 실험으로 세포독성평가는 S1 이 50ppm농도에서는 세포증식률이 대조군에 비해 6%로 증가되었고, 100ppm에서는 12% 증가됨을 확인하였다(Fig. 9). 500ppm과 lOOOppm에서는 세포 생존률 대조군에 비해 11, 23%이하로 감소하였다.
- S1에 대한 염증성 cytokine인 IL-ip, TNF-a , IL-6의 유전자 발현도 억제 효과를 확인한.결과 모두 S1 농도 의존적으로 억제됨을 보였다. MTT 정량에 의한 세포생존률을 측정한 결과 S1 이 L929 세포에 SOOppm 농도 이상에서 세포 독성이 유발됨을 알 수 있었다.
- 4). 귀부종에 대한 농도별 억제효과를 백분율로 환산하면 S1 100 mg/mV} 60.00%, SI lOmg/mVl- 56.15%, SI lmg/mV} 28.08%의 억제 효과를 각각 나타내었다(Table 8).
- 10% 첨가시 저 지환의 크기가 증가하였으며 14~ 15mm정도로 높은 항균활성을 나타내었다. 그렇지만 고농도에서도 MJ”功^에 대한 저지환이 관찰되지 않았으며 이로부터 S1 추출물이 이 균에 대해서는 항균효과가 없다는 것을 알 수 있었다. 피부 염증 세균인 S.
- Table 9에서와 같이 S1은 비만세포에서 compound 48/80에 의한 히스타민의 유리를 농도 의존적으로 억제하였으며, Img/戒의 농도에서 유의성 있는 억제 효과를 나타내었다. 농도별 히스타민 억제율은 0.01, O.hng/畝에서는 13%, 48%의 억제 효과를 나타내었으며, hng/戒에서는 72%의 억제율이 나타내었다(Fig. 6).
- 또한 이들 cytokine 유전자의 프로모터에 존재하는 NF-kB element는 cytokine 유전자 발현에 중요한 역할을 한다46). 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에서 LPS(Lipopolysaccharide)에 유도된 NF-kB의 활성화에 의해 생성되는 IL-W, TNF-a , IL-6의 발현도를 측정하기 위해서 본 연구에서는 RT-PCR 방법을 이용하여 S1에 대한 염증성 cytokine인 IL-1P, TNF-a , IL-6의 유전자 발현도 억제 효과를 확인한 결과 IL-고은 S1 을 50, 100, 200ppm의 처리시 LPS에 비해 93%, 86%, 81%으로 나타나 S1 농도 의존적으로 억제되었으며(Table 11), TNF-q에서는 50, 100, 200ppm2] 처리시 LPS에 비해 92%, 87%, 74%으로 나타나 S1 농도 의존적으로 억제되었으며(Table 12), IL-6에서도 50, 100, 200ppm의 처리시 LPS에 비해 80%, 76%, 69%으로 나타나 S1 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다(Table 13). S1 이 LPS에 의해 생성된 cytokine들을 농도 의존적으로 억제 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 모든 생쥐의 귀를 주사부위에서 절제하여 조직검사를 실시한 결과, control군에 비하여 C48/80군의 비만세포의 수가 다소 많았으며 SI lOOmg/10mg/m£/ lmg/mC 도포군에서는 C48/80군에 비하여 비만세포의 수가 감소하는 경향을 노였다. 또한 alcian blue에 의해 염색되는 비만세포 세포질의 과립이 S1 도포 군에서 더 크게 관찰되는 것으로 보아 S1 이 compound 48/80에 의해 유발되는 비만세포의 탈과립을 억제하였다고 생각된다(Fig.
- 1mg/ml에서는 48%, 에서는 72%의 억제율을 보였다. 수동 피부 아나팔락시 반응은 S1 농도 의존적으로 억제 되었으며, 특히 100mg/ml의 농도에서 유의성 있는 억제 효과를 보였다. COX-2 발현 정도를 분석한 결과 LPS 단독 처리군에 비해 S1 투여군이 S1 농도 의존적으로 억제됨을 보였다.
- 하였다. 이상을 종합해보면 李 등은 風, 濕, 熱 등의 外因 으로 許등은 胃熱, 肺熱, 痰飮, 血熱 등의 內因으로 발생한다고 하였다. 최근의 여러 문헌에서는 肺胃積熱, 血熱血燥, 脾虚痰飮, 腸胃濕熱, 陰虛血瘀 등이 원인이 된다고 하였으며 이외에 過食과 기름진 음식, 지나친 기호식품의 섭취 또한 여드름의 발생원인 이라고 하였다
- 이에 LPS(以 g/畝)를 사용하여 대식세포주인 RAW 264.7(lxl06 c이1)의 COX-2 활성을 유도한 실험에서 COX-2는 LPS 단독 처리군에 비해 S1 처리군에서 S1 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. Fig 7에서 같이 50ppm, 100ppm을 처리한 군에서 35, 50% 정도 발현 억제 효과가 나타남을 확인하였고, 200ppm에서는 60% 정도의 COX-2 발현 억제 효과가 있는 것으로 나타냈다.
- 그 후 paper disk를 위치시키고 S1 추출물 1%, 10% 용액 50成를 각각 흡수 시킨 후 37℃ 에서 12~24시간 배양 후, 그 저지환을 측정하였다. 피부 상재균인 S. epidermis (KCTC 1917), S. aureus (KCTC 1928), M. furfur (KCTC 7743), P. acnes (KCTC 3320)틀 이용하여 항균활성 검증 결과 Fig. 1과 같다 S1 을 1% 첨가하였을 시 S. epidermis, P. Qmes등 2균에 대해서는 10~Umm정도의 항균 활성을 보였지만 M. furfur에 대한 항균싱은 관찰되지 않았다. 10% 첨가시 저 지환의 크기가 증가하였으며 14~ 15mm정도로 높은 항균활성을 나타내었다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합할 때 瀉火解毒 淸熱燥濕 疏散風熱의 효능이 있는 甘菊, 馬齒竟, 生地楡, 苦蔘, 黃柏, 蛇床子 복합추출물은 항균력과 항염효과 , 항알레르기효과를 모두 가지고 있는 것으로 평가되며 여드름이나 각종 다양한 염증성, 알레르기성 피부과 질환에 임상적으로 광범위한 활용가치가 있을 것으로 사료되며 성분 분석 및 작용기전에 대한 연구가 지속되어야 할 것이라고 사료된다.
- 이는 S1 이 L929 세포에 500ppm 농도 이상에서 세포 독성을 유발됨을 알 수 있었다. 좀 더 안전성을 확인하기 위해서는 경구 아급성 독성, 급성 독성 등의 in vivo 실험을 수행해야 할 것으로 사료된다.
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