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문제 정의
- 또한, 미더덕 유래 용혈성 항균 펩티드에 대한 보고가 외국에서 연구되어 보고되었으나(13-16), 아직 미더덕의 기능성 소재에 대해서는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 미더덕 유래 항산화 물질을 탐색하고 그 기능성을 조사하여 미더덕의 소비증진을 통한 어민의 수입 증대뿐만아니 라신규 소재 발굴을기 하고자 하였다.
가설 설정
- 3)H2: extracts from S. clava after heat treatment at 120℃ for 5 min.
제안 방법
- 각 세 포주를 1 X 105 cells/well의 농도로 맞추고 96 well에 각각 100 虬씩 첨가하여 24시간 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양한 후, DMSO에 녹여진 미더덕 추출물 시료를 각각 5, 10, 50, 100 및 500 Pg/mL의 농도로 첨 가하였다. 24시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT용액을 10 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배 양시 킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고DMSO을 100 11L 첨가하여 천천히 녹인 후 ELISA reader(BioRad, Microplate, Model 680, US A) 를 이용하여 540 nm 에서 흡광도룰 측정하여 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 각 세 포주를 1 X 105 cells/well의 농도로 맞추고 96 well에 각각 100 虬씩 첨가하여 24시간 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양한 후, DMSO에 녹여진 미더덕 추출물 시료를 각각 5, 10, 50, 100 및 500 Pg/mL의 농도로 첨 가하였다. 24시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT용액을 10 虬씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배 양시 킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고DMSO을 100 11L 첨가하여 천천히 녹인 후 ELISA reader(BioRad, Microplate, Model 680, US A) 를 이용하여 540 nm 에서 흡광도룰 측정하여 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 분쇄한 미더덕 100 mL로부터 약 9 g의 동결건조 시료를 회수할 수 있었다. 동결건조 시료 9 g에 100 mL 용매를 각각 가하여 진탕배양기에서 위에 서술한 바와 같은 방법으로 추출하여 FD시료라 명명하였다. 각각의 추출물은 여과지(Whatman No.
- 한편, 미더덕을 110℃에서 15분간 가열 처리한 후 분쇄하여 같은 방법으로 추출한 시료를 Hl, 120℃에서 5분간 가열한 후 분쇄하여 추출한 시료를 H2라 명명하였다. 또한, 신선한 미더덕의 분쇄물을 심온동결기 (Upright Deep freezer VX 530, 한국)로 -70℃에서 하룻밤 저장하고, 동결건조기(Freeze Dryer FD 5512, (주) 일신랩, 한국)로 4일 동안 완전히 건조시킨 후, 다시 분쇄기를 이용하여 분말로 만들어서 27 mesh의 체로 걸러 분말의 크기를 일정하게 했다. 분쇄한 미더덕 100 mL로부터 약 9 g의 동결건조 시료를 회수할 수 있었다.
- 건조시료인 FD의 경우 FR, Hl, H2의 경우보다 전체적인 수율이 낮고 경향이 달랐는데, 아세톤에 의해 추출되는 양이 매우 줄었으며 물을 이용한 경우 매우 증가하였다. 미더덕 추출물의 항산화력은 DPPH 라디칼 소거능과 환원력으로 측정하였다. FR, Hl, H2은 아세톤>에탄올>메 탄올 순으로 라디 칼 소거 능을 나타내 었고, 모든 추출 용매 에서 FR>H1>H2의 순서로 라디 칼 소거능을 보였다.
- 신선한 미더덕 분쇄물로부터 열처리하지 않은 시료(FR), 110℃에서 15분간 열처리한 시료(Hl), 120℃에서 5분간 열처리한 시료(H2), 동결건조한 시료(FD)를 제조하고, 이들로부터 메탄올, 에탄올, 아세톤, 물 주줄물을 제조하여 주줄 수율, 항산화활성, 항암활성을 조사하였다. 수분이 함유된 시료인 FR, Hl, H2의 경우 열처리 온도가 높을수록 전체적인 추출 수율이 감소하였으나, 용매 에 따라 회수되는 비율은 비슷한 경향을 나타내었으며 에탄올을 이용하였을 때 가장 높은 수율을 보였다.
- 신선한 미더덕을 믹서기(Mixer MC-811C, (주)노비타, 한국)로 분쇄한 후, 분쇄물 100 mL에 1 L의 용매 (methanol, ethanol, acetone, water)를 각각 가하여 진탕배양기 (HB-201s, (주) 한백 , 한국에서 25℃, 100 rpm의 조건으로 18시간 추출하여 FR시료라 명 명하였다. 한편, 미더덕을 110℃에서 15분간 가열 처리한 후 분쇄하여 같은 방법으로 추출한 시료를 Hl, 120℃에서 5분간 가열한 후 분쇄하여 추출한 시료를 H2라 명명하였다.
- 02% EDTA(Gibco BRL)를 사용하여 부착된 세포를 분리하였다. 집적된 암세포에 배지를 넣고 암세포가 골고루 분산되도록 피펫으로 잘 혼합하여 cell culture dish에 10 ml/5] 일정량 분할하여 주입하고, 3~4일마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- l, l-Diphenyl-2-picrylhy-drazyl(DPPH) 시 약은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입 하였고, potassium ferricyanide, ethanol, 염화철은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
- 구입한 미더덕의 이물질을 제거하고 물로 깨끗이 여러 번 씻어 물기를 제거한 후, 분쇄기 (Mixer MC 811C, (주) 노비타, 한국)를 이용하여 분쇄하여 사용하였다. l, l-Diphenyl-2-picrylhy-drazyl(DPPH) 시 약은 Sigma Chemical Co.
- 본 실험에 사용한 미 더 덕 (Styela daua)은 경 상남도 마산시 진동면 고현마을에서 2004년 10월에 구입하였다. 구입한 미더덕의 이물질을 제거하고 물로 깨끗이 여러 번 씻어 물기를 제거한 후, 분쇄기 (Mixer MC 811C, (주) 노비타, 한국)를 이용하여 분쇄하여 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 암 세포주는 인간 대장암 유래의 세포인 HT-29를 사용하였다. 세포배양을 위한 배지는 RPMI1640 medium(Gibco BRL)을 사용하였으며 10% fetal bovine se-rum(FBS)과 항생제는 100 units/mL의 penicillin, 100 }Jg/mL 의 streptomycin을 처리 하였고 5% COz, 37℃의 incubator에서 배양하였다 (19).
이론/모형
- DPPH 라디 칼 소거능은 Lee 등(17)의 방법에 준하여 시료 0.1 mL에 4.1 X10-5 M의 DPPH 용액 0.9 mL를 가한 후 상온에서 10분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 3과 같다. 각 용매 에 대한 추출물의 항암효과를 조사하기 위하여 MTT reduction assay법 (20)을 이 용하였으며 추출물을 처리 하지 않은 대조구와 비교하여 각 추출물의 암세포 증식 억제 효과를 확인하였다. 신선 미더덕 추출물의 경우에는 물 추출물을 포함한 전 추출물에서 항암활성을 보이지 않았으며 가장 농도가 높은 500 lig/mL에서 약간의 항암활성을 보였다(Fig.
- 모든 실험은 3회 반복으로 이루어졌으며, 그 평균값은 SAS software를 사용하여 General Linear Model의 방법에 따라 처리 하였다(21). 모든 처리 값의 차이는 신뢰 수준 95% (p<0.
- 세포독성은 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl~ tetrazolium bromide를 사용하여 MTT assay로 행하였다 (20). 각 세 포주를 1 X 105 cells/well의 농도로 맞추고 96 well에 각각 100 虬씩 첨가하여 24시간 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양한 후, DMSO에 녹여진 미더덕 추출물 시료를 각각 5, 10, 50, 100 및 500 Pg/mL의 농도로 첨 가하였다.
성능/효과
- 이들 주줄물은 물을 제외한 모든 주줄용매에서 FR> H1>H2의 순서로 라디칼 소거능을 보였는데, 이는 고온의 열처리가 미더덕의 항산화력을 감소시키는 것을 의미한다. 가장 높은 라디칼 소거능은 FR의 아세톤 추출물에서 44.45 %로 측정되었다.
- 수분이 함유된 시료인 FR, Hl, H2의 경우 열처리 온도가 높을수록 전체적인 추출 수율이 감소하였으나, 용매 에 따라 회수되는 비율은 비슷한 경향을 나타내었으며 에탄올을 이용하였을 때 가장 높은 수율을 보였다. 건조시료인 FD의 경우 FR, Hl, H2의 경우보다 전체적인 수율이 낮고 경향이 달랐는데, 아세톤에 의해 추출되는 양이 매우 줄었으며 물을 이용한 경우 매우 증가하였다. 미더덕 추출물의 항산화력은 DPPH 라디칼 소거능과 환원력으로 측정하였다.
- 미더덕에 열처리를 한 경우, 열처리 온도가 상승할수록, 라디 칼 소거능 및 환원 력 이 모두 감소하였다. 대장암 세포주 HT-29에 대한 미더덕 추출물의 암세포증식억제 효과는 동결건조 미더덕의 아세톤 추출물이 500 Ug/mL의 농도에서 약 42%의 높은 활성을 보였다. 이상의 실험 결과로 미더덕에 항산화력과 항암력을 가지는 성분이 함유되어 있음을 알 수 있었다.
- 지금까지는 한약재를 비롯한 농산물 유래의 추출물이 항암효과를 보이는 연구(33, 34)가 보고된바가 있으나 해양생물 유래의 추출물에서 항암효과를 보이는 결과에 대해서 구체적으로 보고된 바가 많이 없는 실정이다. 따라서 이번 연구결과는 생리활성물질을 탐색함에 있어서 추출방법의 중요성과 해양생물이 중요한 천연자원이 될 수 있다는 가능성을 확인할 수 있었다.
- 항산화활성, 항암활성을 조사하였다. 수분이 함유된 시료인 FR, Hl, H2의 경우 열처리 온도가 높을수록 전체적인 추출 수율이 감소하였으나, 용매 에 따라 회수되는 비율은 비슷한 경향을 나타내었으며 에탄올을 이용하였을 때 가장 높은 수율을 보였다. 건조시료인 FD의 경우 FR, Hl, H2의 경우보다 전체적인 수율이 낮고 경향이 달랐는데, 아세톤에 의해 추출되는 양이 매우 줄었으며 물을 이용한 경우 매우 증가하였다.
- 어떤 물질의 환원력은 그 물질의 항산화능력의 중요한 지표가 된다(31). 신선 미더덕 (FR)의 메탄올 추출물이 가장 높은 활성을 보였고, 열처리 온도가 높을수록 모든 용매에서 환원력은 감소하였다. 동결건조 미더덕(FD)의 경우에는 메탄올 >에탄올>물>아세톤의 순서로 환원력이 측정되었다.
- 이상의 결과는 열처리 온도와 수분 유무가 미더덕 추출물의 항산화력에 크게 영향을 미침을 의미한다. 미더덕은 척색동물문의 미 색동물아문의 우렁 쉥이 (멍 게)과에 속하는 해양생물로, 우렁 쉥이와 유사한 특성을 지니고 있다.
- 이상의 결과로 미더덕에 항산화력과 항암력을 가지는 성분이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. 지금까지는 한약재를 비롯한 농산물 유래의 추출물이 항암효과를 보이는 연구(33, 34)가 보고된바가 있으나 해양생물 유래의 추출물에서 항암효과를 보이는 결과에 대해서 구체적으로 보고된 바가 많이 없는 실정이다.
- 대장암 세포주 HT-29에 대한 미더덕 추출물의 암세포증식억제 효과는 동결건조 미더덕의 아세톤 추출물이 500 Ug/mL의 농도에서 약 42%의 높은 활성을 보였다. 이상의 실험 결과로 미더덕에 항산화력과 항암력을 가지는 성분이 함유되어 있음을 알 수 있었다.
- 장기간 유통 가능한 미더덕 제품을 개발하기 위해 레토르트를 이용하여 살균조건을 검토하였고, 110℃에서 15 분간 또는 120℃에서 5분간 가열하는 조건이 적당함이 보고되었다(22). 이와 같이 열처리를 한 시료인 Hl, H2는 신선한 미더덕의 추출물(FR)에 비하여 열처리 온도가 높을수록 전체적인 수율은 감소하였으나, 용매에 따라 회수되는 비율은 비 슷한 경향을 나타내 었으며 에탄올을 이용하였을 때 가장 높은 수율을 보였다. 가장 많이 추출된 조건은 신선한 미더덕의 분쇄물 100 mL로부터 에탄올을 이용하여 추출하였을 때 1.
- 0 g에 100 mL의 용매를 첨가하여 추출물을 제조한 경우(FD)에는 수분을 함유하고 있는 미더덕 분쇄물의 추출물(FR, Hl, H2)의 경우보다 전체적인 수율이 낮고 경향이 달랐다. 즉, 메탄올을 이용한 경우에는 1.22 g이 추출되어 추출량은 FR, Hl, H2에 비해 줄었지만 전체 추출물에서 차지 하는 비 율은 32.8%로 증가하였고, 물로 추출한 경우에는 1.12 g이 추출되어 절대량 및 상대량도 매우 증가하였다. 아세톤에 의해 추출되는 양은 매우 줄어 0.
- FR, Hl, H2은 아세톤>에탄올>메 탄올 순으로 라디 칼 소거 능을 나타내 었고, 모든 추출 용매 에서 FR>H1>H2의 순서로 라디 칼 소거능을 보였다. 한편 FD는 에탄올 추출물이 가장 높은 라디 칼 소거능을 보였고, 아세톤과 물 추출물에서는 활성을 나타내지 않았다. 환원력의 경우, FR의 메탄올 추출물이 가장 높은 활성을 보였고, 열처리 온도가 높을수록 모든 용매에서 환원력은 감소하였다.
- 한편 FD는 에탄올 추출물이 가장 높은 라디 칼 소거능을 보였고, 아세톤과 물 추출물에서는 활성을 나타내지 않았다. 환원력의 경우, FR의 메탄올 추출물이 가장 높은 활성을 보였고, 열처리 온도가 높을수록 모든 용매에서 환원력은 감소하였다. FD의 경우에는 메탄올>에탄올>물>아세톤의 순서로 환원력이 측정되었다.
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