[논문]생지황(生地黃)이 자궁경부암세포(子宮經部癌細胞)(HeLa cell)에 미치는 영향(影響)

김주연; 조옥현; 최창민; 조한백

문제 정의

刺戟에 의하여 損傷된 DNA의 回復은 PARP의 分節 로 인하여 저해됨으로서 genomic DNA 의 分節이 규칙적으로 일어나게 된다. 따라서 活性化된 caspase-3 protease에 의해 세포 내 기질 단백질인 PARP단백질이 分節되는지 알아보고자 하였다. 生地黃과 adriamycin 동시 처 치 시 caspase・3활성 증가와 비슷한 양상으로 PARP의 cleavage pattern이 보여지고 있음을 확인할 수 있었다 (Fig.
이에 본 箸者는 子宮頸部癌細胞인 HeLa cell에 adriamycin으로 인한 細胞의 成長抑制 등의 조건에서 生地黃을 투여하여 HeLa cell 의 細胞生存度와 細胞枯死에 관련된 caspase-3와 caspase*의 activity 增加, PARP (Poly(ADP-Ribose) polymerase) 의 cleavage 確認, Bcl-2와 Bax의 發現, Fas/FasL의 發現 등을 觀察한 結果生地黃이 HeLa cell에 미치는 抗癌效果에 對한 有意性있는 結果를 얻었기에 報告하는 바이다.
與否를 알아보았다. 하지만 生地黃 을 여러가지 용량에서 처리하여 보았으나 細胞生存度에는 영향이 없었으므로 대표적인 anti-cancer agent인 adriamycin으로 인한 細胞의 成長抑制 등의 조건에서 보다 강한 효과를 나타내는지 확인하여 보았다. Adriamycine luM의 용량에서는 세포의 독성을 야기하지 않았으나 生地黃 2 mg/ml을 동시 처리시 細胞枯死(apoptosis) 가 야기됨을 확인하였다 (Fig.
알아보았다. 하지만 生地黃을 여러 가지 用量에서 處理하여 보았으나 細胞生存度에는 영향이 없었으므로 대표적인 anti-cancer agent인 adriamycin으로인한 細胞의 成長抑制 등의 조건에서 보다 강한 효과를 나타내는지 확인하여 보았다. adriamycine luM의 용량에서는 細胞의 毒性을 야기하지 않았으나 生地黃 2 mg/ml를 同時處理時 세포 죽음이 야기됨을 확인하였다(Fig.

가설 설정

A. HeLa cells were subjected to 1 uM adriamycin, 2 mg/ml RR or the combined agents for 60 hrs. The cell lysates were perpared tor caspase-9 activity assay.

제안 방법

標示된 結果는 3번 以上의 獨立的인 結果이며 이들의 平均 (mean)과 標準偏差 (standaTd deviation, SD)를 算出하여 結果를 標示하였다. 細胞毒性을 보이는 값의 比較에 있어서는 students怎 t-test를 使用하였으며 p<0.
이때의 波長은 excitation wavelength (380nm) 와 emission wavelength (460nm) 를 使用하였다. 機質은 CPP32-like caspase 의 경우, fluorogenic substrate 인 7-amino-4-coumarin (AMC)-DEVD를 使用하였으며 proteolytic cleavage를 測定 함으로써 인지하였다.
生地黃 400g을 증류수 2,000ml와 함께환저플라스크에 넣고 冷却器를 附着하여 3時間동안 電熱器로 煎湯한 후 3, 000rpm 에서 20분간 遠心分離하고 진공 농축기로 감압, 농축한 후 凍結乾燥器에서 24 시간 凍結乾燥하여 10%의 수율로 건조물을 얻었다.
生地黃으로 因한 抗癌效果를 檢索하기 위해 子宮頸部癌細胞柱인 HeLa cell에 生地黃을 處理하고 細胞枯死(apoptosis)를 야기하는지 與否를 알아보았다. 하지만 生地黃 을 여러가지 용량에서 처리하여 보았으나 細胞生存度에는 영향이 없었으므로 대표적인 anti-cancer agent인 adriamycin으로 인한 細胞의 成長抑制 등의 조건에서 보다 강한 효과를 나타내는지 확인하여 보았다.
生地黃으로 因한 抗癌效果를 검색하기 위해 子宮頸部癌細胞柱인 HeLa cell 에 生地黃을 處理하고 죽음을 야기하는지 與否를 알아보았다. 하지만 生地黃을 여러 가지 用量에서 處理하여 보았으나 細胞生存度에는 영향이 없었으므로 대표적인 anti-cancer agent인 adriamycin으로인한 細胞의 成長抑制 등의 조건에서 보다 강한 효과를 나타내는지 확인하여 보았다.
바로 tap water로 水洗한 후, staining된 細胞를 10% acetic acid상에 5분 동안 常溫에서 反應하여 ELISA reader로 405 nm 에서 OD값을 計算한다. 細胞生存度實驗에서 culture media상의 細胞를 100%의 細胞活性度를 나타낸다는 基準으로 試藥處理群의 細胞生存度를 %로 計算하였다.
0) 에서 溶解하고 20, 000g로 15분 동안 遠心分離시켰다. 遠心分離하여 얻은 上層液은 BCA (Bicichonic acid, Sigma, St. Louis, USA) 方法으로 定量하여 assay buffer (lOOmM Hepes, 10% sucrose, 0.1% chaps, pH 7.5, ImM PMSF, lyg/ml aprotinin, lp g/ml leupeptin, 2mM DTT)에 稀釋된 螢光標識된 機質과 37, C에서 30분간 反應시킨 후, fluorometer■로 測定하였다. 이때의 波長은 excitation wavelength (380nm) 와 emission wavelength (460nm) 를 使用하였다.
사람 子宮頸部癌細胞柱인 HeLa-cell을 37℃z 5% CO₂ 狀況에서 10% fetal bovine serum (Hyclone Laboratories) o] 包含된 D-MEM (Gibco BRL)에서 培養하는 동안 약 24時間週期로 培養液을 交替하여 주며 log phase에 있는 細胞에 生地黃을 處理하여 apoptosis 現象을 觀察하였다.
이에 著者는 子宮頸部癌이 韓醫學의 崩漏에도 해당되고, 또한 生地黃이 崩漏 에 사용되는 약물이며, 抗癌治療에도 사용할 수 있다는 점에 着眼하여, 生地黃을 子宮頸部癌의 治療에 사용할 수 있을 것으로 思料되어 子宮頸部癌細胞柱인 HeLa cell에 生地黃을 處理하고, HeLa cell의 細胞枯死(apoptosis)와, 生存度, 細胞蛋白質의 發顯을 觀察하였다.

대상 데이터

Anti-Bcl-2, Bax or PARP antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 공급받았다. 細胞培養時必要한 培養液 및 試藥들은 Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) 에서 구입하였다.
實驗에 使用된 藥材는 圓光大學校韓醫科大學益山韓方病院에서 購入한 것을 精選하여 使用하였다.
細胞培養時必要한 培養液 및 試藥들은 Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) 에서 구입하였다.

데이터처리

標示하였다. 細胞毒性을 보이는 값의 比較에 있어서는 students怎 t-test를 使用하였으며 p<0.01, 혹은 p<0.05 水準으로 有意性을 檢證하였다.

이론/모형

HeLa ceH(5xlO°)를 0.5ml lysis buffer 溶液에 넣은 다음 蛋白質量은 BCA protein assay法으로 定量한다. 定量한 蛋白質은 sample buffer■에서 denaturation 시킨 다음 SDS-PAGE를 利用하여 전기영동을 한다.

성능/효과

Fas 는 45 kDa 의 tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily 의 member로써, Fas cell surface receptor는 FasL와 더불어 apoptosis의 initiation의 주요 molecule 로 여겨지고 있 다"\ Apoptosis 에 요구되어지는 de novo protein synthesis pathway 시 가■장 연구가 많이 되어온 Fas/FasL를 알아보고자 하였다 3&39) 1 uM 용량의 adriamycin 존재하에 2 mg/ml 生地黃을 동시 투여하여 Fas and FasL의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7).
1. HeLa cell 에 luM 용량의 adriamycin 과 2 mg/ml 生地黃을 동시처치시 세포 죽음이 야기됨을 확인하였다.
2. HeLa cell에 luM 용량의 adriamycin 과 2 mg/ml 生地黃을 동시처치시 aspase-3과 caspase-8 의 活性이 增加 하는 것을 確認할 수 있었다.
3. HeLa cell에 luM 용량의 adriamycin 과 2 mg/ml 生地黃을 동시처치시 caspase-3 活性增加와 비슷한 양상으로 PARP (Poly (ADP-Ribose)polymerase) 의 cleavage pattern이 보여지고 있음을 確認할 수 있었다.
4. HeLa cell에 luM 용량의 adriamycin 과 2 mg/ml 生地黃을 동시처치시 Bcl-2와 protein 발현은 별다른 變化 가 없었다.
5. HeLa cell에 luM 용량의 adriamycin 과 2 mg/ml 生地黃을 동시처치시 Fas/FasL의 發顯이 增加하는 것을 確認할 수 있었다.
하지만 生地黃 을 여러가지 용량에서 처리하여 보았으나 細胞生存度에는 영향이 없었으므로 대표적인 anti-cancer agent인 adriamycin으로 인한 細胞의 成長抑制 등의 조건에서 보다 강한 효과를 나타내는지 확인하여 보았다. Adriamycine luM의 용량에서는 세포의 독성을 야기하지 않았으나 生地黃 2 mg/ml을 동시 처리시 細胞枯死(apoptosis) 가 야기됨을 확인하였다 (Fig. 1). 특히 生地黃 (5 mg/ml)을 처리시에도 동일한 효과를 보였으나 본 실험결과에서는 제시하지 않았다.
하지만 生地黃을 여러 가지 用量에서 處理하여 보았으나 細胞生存度에는 영향이 없었으므로 대표적인 anti-cancer agent인 adriamycin으로인한 細胞의 成長抑制 등의 조건에서 보다 강한 효과를 나타내는지 확인하여 보았다. adriamycine luM의 용량에서는 細胞의 毒性을 야기하지 않았으나 生地黃 2 mg/ml를 同時處理時 세포 죽음이 야기됨을 확인하였다(Fig. 1). 특히 生地黃 5 mg/ml를 處理時에도 同-한 效果 를 보였으나 본 실험결과에서는 제시하지 않았다.
따라서 活性化된 caspase-3 protease에 의해 세포 내 기질 단백질인 PARP단백질이 分節되는지 알아보고자 하였다. 生地黃과 adriamycin 동시 처 치 시 caspase・3활성 증가와 비슷한 양상으로 PARP의 cleavage pattern이 보여지고 있음을 확인할 수 있었다 (Fig. 5).
Fas cell surface receptoi.는 FasL와더불어 apoptosis 의 initiation 의 주요 molecule로 여겨지고 있는데功, apoptosis 에 요구되어지는 de novo protein synthesis pathway시 가장 연구가 많이 되어온 Fas/FasL를 알아보고자 하였다 3&1 uM 용량의 adriamycin 존재하에 2 mg/ml 生地黃을 동시투여하여 Fas and FasL의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7).

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