고양이의 연령에 따른 난포의 분포를 알아보고 난포의 배양과 난자 생산의 가능성을 알아보고자 0.3세부터 5세까지의 총 41 마리 고양이를 난소 적출술 후 사용하였다. 고양이 난소의 무게와 크기를 측정하고 난포의 분포를 알아보기 위해 난소를 10% formalin에 보관한 후 고정된 난소를 $3{\mu}m$-sections으로 자른 후 조직 슬라이드를 준비하여 hematoxylin와 eosin으로 염색하였다. 난포의 분포를 200 배율와 400 배율 현미경하에서 평가하였으며 난포를 원시 난포(primordial), 일차 난포(primary), 이행성 난포(transitional), 전동난포(preantral), 동난포(antral)로 분류하여 관찰하였다. 단순 기계적인 방법에 의해 전동난포(preantral follicles)를 분리하여 배양배지가 담긴 96 microliter plates well로 옮겨 배양하였다. 난포의 배양액은 Medium 199에 1% ITS(insulin, transferrin, selenium)를 첨가하고 10% FBS나 10% PVA를 첨가하여 사용하였으며 배양배지위에 mineral oil를 덮고 16일 동안 난포를 배양하였다. 난포의 크기는 4일마다 측정하였다. 0.3세부터 5세까지 고양이 난소의 무게는 0.1g에서 0.3g으로 증가하는 양상을 보이기는 했으나 유의적인 차이가 없었다. 난포의 분포는 고양이의 연령에 관계없이 원시난포의 분포가 그 외 난포들의 분포보다 높게 나타났다(p<0.05). 난포를 4일 이상 배양하였을 때 배양액의 조성성분과 관계없이 난포의 크기가 감소하였으며, 체외 배양된 난포로부터 적은 수의 난자만을 회수할 수 있었다. 많은 수의 원시 난포 등을 분리하기 위한 유용한 난포 분리법과 난포의 배양에 필요한 기타 성분들의 비교 연구가 이루어져야 할 것으로 생각되며 이러한 집 고양이를 이용한 기초 번식 기술은 미래에 멸종위기에 처한 고양이 과 동물을 보존하기 위한 중요한 방법이 될 것으로 기대된다.
고양이의 연령에 따른 난포의 분포를 알아보고 난포의 배양과 난자 생산의 가능성을 알아보고자 0.3세부터 5세까지의 총 41 마리 고양이를 난소 적출술 후 사용하였다. 고양이 난소의 무게와 크기를 측정하고 난포의 분포를 알아보기 위해 난소를 10% formalin에 보관한 후 고정된 난소를 $3{\mu}m$-sections으로 자른 후 조직 슬라이드를 준비하여 hematoxylin와 eosin으로 염색하였다. 난포의 분포를 200 배율와 400 배율 현미경하에서 평가하였으며 난포를 원시 난포(primordial), 일차 난포(primary), 이행성 난포(transitional), 전동난포(preantral), 동난포(antral)로 분류하여 관찰하였다. 단순 기계적인 방법에 의해 전동난포(preantral follicles)를 분리하여 배양배지가 담긴 96 microliter plates well로 옮겨 배양하였다. 난포의 배양액은 Medium 199에 1% ITS(insulin, transferrin, selenium)를 첨가하고 10% FBS나 10% PVA를 첨가하여 사용하였으며 배양배지위에 mineral oil를 덮고 16일 동안 난포를 배양하였다. 난포의 크기는 4일마다 측정하였다. 0.3세부터 5세까지 고양이 난소의 무게는 0.1g에서 0.3g으로 증가하는 양상을 보이기는 했으나 유의적인 차이가 없었다. 난포의 분포는 고양이의 연령에 관계없이 원시난포의 분포가 그 외 난포들의 분포보다 높게 나타났다(p<0.05). 난포를 4일 이상 배양하였을 때 배양액의 조성성분과 관계없이 난포의 크기가 감소하였으며, 체외 배양된 난포로부터 적은 수의 난자만을 회수할 수 있었다. 많은 수의 원시 난포 등을 분리하기 위한 유용한 난포 분리법과 난포의 배양에 필요한 기타 성분들의 비교 연구가 이루어져야 할 것으로 생각되며 이러한 집 고양이를 이용한 기초 번식 기술은 미래에 멸종위기에 처한 고양이 과 동물을 보존하기 위한 중요한 방법이 될 것으로 기대된다.
This study was conducted to determine the distribution of cat follicles among varying ages and produce oocytes from preantral follicles cultured in vitro. We used ovaries from 41 cats ranging in age from 0.3 to 5 years. Ovaries were obtained from cats undergoing routine ovariectomy at local veterina...
This study was conducted to determine the distribution of cat follicles among varying ages and produce oocytes from preantral follicles cultured in vitro. We used ovaries from 41 cats ranging in age from 0.3 to 5 years. Ovaries were obtained from cats undergoing routine ovariectomy at local veterinary clinics. As a prelude to in vitro culture of preantral follicles, the length and the width and the weight of ovaries among cats of varying ages were measured. Ovaries were fixed in 10% formalin, embedded in paraffin, cut into $3{\mu}m$-sections, mounted on slides and stained with hematoxylin and eosin. Follicles were evaluated at 200X and 400X magnification. Distribution of follicles among cats of varying ages were evaluated according to follicle classification: primordial, primary, transitional, preantral and antral follicles. Preantral follicles were isolated by the simple mechanical procedure. Each follicle was cultured in a well containing $100{\mu}l$ of medium 199 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) or polyvinylalcohol (PVA) for 16 days. Follicle diameters were measured under inverted microscope every 4 days. The length, the width and the weight of ovaries were increased gradually according to ages but there was not significant difference among cats of varying ages. Majority of follicles were primordial follicles (84%) regardless of cat ages (p<0.05). Follicle diameter increased until 4 days of culture. However, period longer than 4 days of culture in vitro had a deleterious effect on follicle survival regardless of supplement (FBS or PVA). A few oocytes were collected from preantral follicles cultured in vitro. These basic reproductive techniques in domestic cats can be a useful tool to save endangered feline species.
This study was conducted to determine the distribution of cat follicles among varying ages and produce oocytes from preantral follicles cultured in vitro. We used ovaries from 41 cats ranging in age from 0.3 to 5 years. Ovaries were obtained from cats undergoing routine ovariectomy at local veterinary clinics. As a prelude to in vitro culture of preantral follicles, the length and the width and the weight of ovaries among cats of varying ages were measured. Ovaries were fixed in 10% formalin, embedded in paraffin, cut into $3{\mu}m$-sections, mounted on slides and stained with hematoxylin and eosin. Follicles were evaluated at 200X and 400X magnification. Distribution of follicles among cats of varying ages were evaluated according to follicle classification: primordial, primary, transitional, preantral and antral follicles. Preantral follicles were isolated by the simple mechanical procedure. Each follicle was cultured in a well containing $100{\mu}l$ of medium 199 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) or polyvinylalcohol (PVA) for 16 days. Follicle diameters were measured under inverted microscope every 4 days. The length, the width and the weight of ovaries were increased gradually according to ages but there was not significant difference among cats of varying ages. Majority of follicles were primordial follicles (84%) regardless of cat ages (p<0.05). Follicle diameter increased until 4 days of culture. However, period longer than 4 days of culture in vitro had a deleterious effect on follicle survival regardless of supplement (FBS or PVA). A few oocytes were collected from preantral follicles cultured in vitro. These basic reproductive techniques in domestic cats can be a useful tool to save endangered feline species.
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문제 정의
그러므로 본 연구에서는 선행적으로 고양이 연 령에 따른 난소의 무게와 크기를 비교하고 다양한 연령층의 고양이에서 난포의 종류에 따른 분포를 알아보고자 한다. 또한 전동난포를 회수하여 난포 의 체외 배양 및 배양된 난포로부터 난자의 회수 가능성을 알아보고자 한다.
그러므로 본 연구에서는 선행적으로 고양이 연 령에 따른 난소의 무게와 크기를 비교하고 다양한 연령층의 고양이에서 난포의 종류에 따른 분포를 알아보고자 한다. 또한 전동난포를 회수하여 난포 의 체외 배양 및 배양된 난포로부터 난자의 회수 가능성을 알아보고자 한다.
본 실험의 궁극적인 목적은 난소로부터 난포를 분리하여 난포를 체외에서 성숙시켜 난포내의 난 자의 사용 가능성을 알아보고자 하는데 있다. 그러나 난포의 분리시 높은 분포율을 보인 원시 난포 의 분리가 어려웠으며 상대적으로 분리가 용이한 전동난포의 분포율은 낮아 충분한 수의 전동난포 의 회수가 어려웠다.
각 난소마다 준비된 조직 슬라이드를 200 배율 과 400 배율의 현미경(Nikon, Japan)하에서 관찰하여 난포를 분류하고 각 난포의 분포를 산출하였다. 각 난포의 분포율은 총 난포수에 대한 각 난포의 백분율로 계산하였다.
각 난소마다 준비된 조직 슬라이드를 200 배율 과 400 배율의 현미경(Nikon, Japan)하에서 관찰하여 난포를 분류하고 각 난포의 분포를 산출하였다. 각 난포의 분포율은 총 난포수에 대한 각 난포의 백분율로 계산하였다.
고양이 난소의 무게와 크기를 측정하고 난포의 분포를 알아보기 위해 난소를 10% formalin에 보 관한 후 고정 된 난소를 3 um-sections으로 자른 후 조직 슬라이드를 준비하여 hematoxylin와 eosin으 로 염색하였다. 난포의 분포를 200 배율와 400 배 율 현미경하에서 평가하였으며 난포를 원시 난포(primordial), 일차 난포(primary), 이행성 난포(transitional), 전동난포(preantral), 동난포(antral)로 분류하여 관찰하였다.
난소의 물기를 제거한 후 각각 저울(sartoruis, germany)과 자를 이용하여 난소의 무게와 길이와 너비를 측정하였다.
배양배지는 medium 199 에 follicular stimulating hormone(2IU/ml), epidermal growth factor(10ng/ml), 1% ITS(insulin, transferrin, selenium) 를 첨가하고 10% fetal bovine serum (FBS)나 10% polyvinyl alcohol(PVA)를 첨가하였다. 난포를 5% CO2, 37.5℃ 조건하에서 16일 동안 배양하였으며 3일마다 새 배지로 교환하였다.
단순 기계적인 방법에 의해 전동난포(preantral follicles)를 분리하여 배양배지가 담긴 96 microliter plates well로 옮겨 배양하였다. 난포의 배양액 은 Medium 199에 1% ITS(insulin, transferrin, sele- nium)를 첨가하고 10% FBS나 10% PVA를 첨가하여 사용하였으며 배양배지위에 mineral oil를 덮고 16일 동안 난포를 배 양하였다. 난포의 크기는 4일 마다 측정하였다.
고양이 난소의 무게와 크기를 측정하고 난포의 분포를 알아보기 위해 난소를 10% formalin에 보 관한 후 고정 된 난소를 3 um-sections으로 자른 후 조직 슬라이드를 준비하여 hematoxylin와 eosin으 로 염색하였다. 난포의 분포를 200 배율와 400 배 율 현미경하에서 평가하였으며 난포를 원시 난포(primordial), 일차 난포(primary), 이행성 난포(transitional), 전동난포(preantral), 동난포(antral)로 분류하여 관찰하였다.
A)의 각 welt내로 옮긴 후 멸균된 mineral oil(100#l)로 덮고 배 양하였다. 배양배지는 medium 199 에 follicular stimulating hormone(2IU/ml), epidermal growth factor(10ng/ml), 1% ITS(insulin, transferrin, selenium) 를 첨가하고 10% fetal bovine serum (FBS)나 10% polyvinyl alcohol(PVA)를 첨가하였다. 난포를 5% CO2, 37.
분리된 전동난포(preantral fbllicles)를 medium 199-Hepes와 배양배지로 세척한 후 각 난포를 배 양배지(100ul)가 담긴 96 well microliter plates(Cos- tar, U.S.A)의 각 welt내로 옮긴 후 멸균된 mineral oil(100#l)로 덮고 배 양하였다. 배양배지는 medium 199 에 follicular stimulating hormone(2IU/ml), epidermal growth factor(10ng/ml), 1% ITS(insulin, transferrin, selenium) 를 첨가하고 10% fetal bovine serum (FBS)나 10% polyvinyl alcohol(PVA)를 첨가하였다.
대상 데이터
고양이의 연령에 따른 난포의 분포를 알아보고 난포의 배양과 난자 생산의 가능성을 알아보고자 0.3세부터 5세까지의 총 41 마리 고양이를 난소 적 출술 후 사용하였다.
Blade를 이용하여 난소를 작은 조각으로 자른 후 난소 조각을 medium 199-Hepes에 담아 실체현미경하에서 1ml 주 사기에 주사 바늘(25gauge)을 연결하여 난포를 분 리하였다. 난포가 부유된 액을 100“m cell strainer (Flacon, U.S.A)를 이용하여 여과한 후 난포를 채 취하였다.
본 실험에 사용된 고양이는 0.3세부터 5세까지 총 41 마리였으며 미국, 뉴올린언즈에 위치한 개 인 동물병원에서 난소 적출술 후 난소를 penicillin (100 IU/ml) 과 streptomycin(0.1mg/ml) 이 첨가된 0.9% saline에 담긴 플라스틱 용기에 담아 오두본 희귀동물 연구소(Audubon Center for Research of endangered species)내 실험실로 운반하였다.
본 실험에 사용된 화학약품은 별도의 표기가 없는 한 Sigma(St. Louis, MO, U.S.A.)와 Gibco(Life Technologies, Grand Island, NY, U.S.A.)로부터 구입하여 사용하였다.
총 41 마리의 고양이 난소중 36마리로부터 적출 된 난소는 고양이 연령별 난포의 분포를 알아보기 위해 사용되었으며, 5마리로부터 적출된 난소는 난포의 배양실험에 사용되었다.
데이터처리
본 연구에 의해 얻어진 실험결과의 통계처리는one-way analysis of variance(ANOVA)# 이 용하여분석하였으며, 일 때 유의적 차이를 인정하 였다
이론/모형
Oktay 등(1995)의 방법에 준하여 난포를 Table 1과 같이 분류하였다.
난소내 난포의 분포를 알아보기 위해 난소의 조 직 슬라이드는 Wood 등(1997) 방법에 준하여 준 비하였다. 난소를 10% formalin의 플라스틱 병에 담아 고정 하여 파라핀에 포맷한 후 3 /J.
체외 배양에 사용되는 난포는 Figueiredo 등 (1994)의 방법에 준하여 효소처리 없이 단순 기계 적인 방법에 의해 분리하였다. Blade를 이용하여 난소를 작은 조각으로 자른 후 난소 조각을 medium 199-Hepes에 담아 실체현미경하에서 1ml 주 사기에 주사 바늘(25gauge)을 연결하여 난포를 분 리하였다.
성능/효과
난소로부터 분리된 난포의 크기는 약 70 um이 었으며, 난포를 10% FBS가 첨가된 배지에 4일간 배양하였을 때 난포의 크기는 120um로 증가한 반면 10% PVA가 첨가된 배 양액 에 배 양된 난포는 100um로 증가하였다. 그러나 4일 이후에는 배지 에 관계없이 난포의 직경은 급격히 감소하여 난포 가 변성되고 있는 것으로 생각된다.
05, Table 3). 난포 종류별 각 난포의 평균 분포율을 살펴보면 원시 난포(primordial follicle)의 평균 분포율은 84.0%이었으며, 일차 난포(primary follicle)는 8.2%, 이행성 난포(transitional follicle)는 1.5%, 전동난포(preantral folli- cle)는 1.2%, 동난포(antral follicle)^ 4.2%로 나타났다. 각 연령별 각 난포의 비율을 비교하였을 때 각 난포의 분포율은 연령과는 관계없이 모든 연령 대에서 비슷하게 나타났다.
조직학적 관찰에 의해 고양이 연령에 따른 난포 의 종류별 분포를 관찰하였을 때 고양이의 연령에 관계없이 원시난포의 분포가 그 외 난포들의 분포 보다 높게 나타났다(p<0.05, Table 3). 난포 종류별 각 난포의 평균 분포율을 살펴보면 원시 난포(primordial follicle)의 평균 분포율은 84.
후속연구
3세에서 5세까지 다양하였으나 실제 고양이의 중성화 수술은 어 린 나이에서 행해지기 때문에 고 연령의 고양이 난소 를 구하기 힘들었다. 5세 이상의 고양이 난소를 포 함하여 난포의 분포를 조사할 수 있다면 연령에 따른 전반적인 난포의 분포를 알아보는데 유용할 것으로 생각된다.
난포를 4일 이상 배양하였을 때 배양액의 조성성분과 관계없이 난포의 크기가 감소하였으며, 체외 배양된 난포 로부터 적은 수의 난자만을 회수할 수 있었다. 많은 수의 원시 난포 등을 분리하기 위한 유용 한 난포 분리법과 난포의 배양에 필요한 기타 성 분들의 비교 연구가 이루어져야 할 것으로 생각되 며 이러한 집 고양이를 이용한 기초 번식 기술은 미래에 멸종위기에 처한 고양이 과 동물을 보존하기 위한 중요한 방법이 될 것으로 기대된다.
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